專(zhuān)利名稱：特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)分子及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)分子及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻是我國(guó)乃至全世界最重要的糧食作物之一，是世界上食用人口最多、歷史最悠久的農(nóng)作物。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)正廣泛地應(yīng)用于農(nóng)作物品質(zhì)改良，已有多個(gè)轉(zhuǎn)基因水稻品系進(jìn)行了環(huán)境釋放，申請(qǐng)商業(yè)化種植?？曝S6號(hào)是轉(zhuǎn)雙價(jià)抗蟲(chóng)基因的轉(zhuǎn)基因水稻品系，所導(dǎo)入外源基因是Bt/CpTI。在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)時(shí)，必須使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為陽(yáng)性對(duì)照或制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種可替代植物基因組的一種重組質(zhì)粒分子，一般包括物種特異性片段和轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)的外源基因或品系特異性片段。優(yōu)點(diǎn)是生產(chǎn)成本低，質(zhì)粒DNA的純度高，產(chǎn)量大，制作和應(yīng)用更為靈活，可以人為設(shè)計(jì)攜帶多個(gè)外源基因，使其應(yīng)用更為廣泛。目前，已經(jīng)成功應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因大豆棉花和玉米等的定量檢測(cè)，而且目前標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子已經(jīng)獲得了國(guó)際協(xié)同認(rèn)證。目前尚未有針對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號(hào)進(jìn)行特異性檢測(cè)的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)分子及其
應(yīng)用。 本發(fā)明所提供的特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)分子具體為環(huán)狀載體。所述環(huán)狀載體具體包括豇豆胰蛋白酶抑制劑編碼基因(CpTI基因)片段、蘇云金芽孢桿菌殺蟲(chóng)晶體蛋白編碼基因(Bt基因)片段、水稻內(nèi)源基因GOS片段，以及Ti質(zhì)粒T-DNA的邊界序列(如右邊界序列RB)片段。在本發(fā)明中，所述豇豆胰蛋白酶抑制劑編碼基因片段的序列具體可如序列表中序列I的第10-101位所示；所述蘇云金芽孢桿菌殺蟲(chóng)晶體蛋白編碼基因片段的序列具體可如序列表中序列I的第265-336位所示；所述水稻內(nèi)源基因GOS片段的序列具體可如序列表中序列I的第191-258位所示；所述Ti質(zhì)粒T-DNA的邊界序列片段的序列具體可如序列表中序列I的第108-184位所示。進(jìn)一步，所述環(huán)狀載體為將所述豇豆胰蛋白酶抑制劑編碼基因片段、所述蘇云金芽孢桿菌殺蟲(chóng)晶體蛋白編碼基因片段、所述水稻內(nèi)源基因GOS片段、所述Ti質(zhì)粒T-DNA的邊界序列片段一同與PEASY-T3質(zhì)粒相連后得到的重組載體。更加具體的，所述環(huán)狀載體為將如序列表中序列I所示的DNA片段與所述PEASY-T3質(zhì)粒連接所得的重組載體。所述環(huán)狀載體在作為標(biāo)準(zhǔn)分子檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號(hào)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種定性或定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號(hào)的試劑盒。本發(fā)明所提供的試劑盒，具體由所述環(huán)狀載體和如下(al)_ (a4)中的全部或部分組成:(al)由序列表中序列2和序列3所示單鏈DNA組成的引物對(duì)，以及核苷酸序列如序列表中序列4所示的探針；(用于擴(kuò)增CpTI基因片段)(a2)由序列表中序列5和序列6所示單鏈DNA組成的引物對(duì)，以及核苷酸序列如序列表中序列7所示的探針；(用于擴(kuò)增Bt基因片段)(a3)由序列表中序列8和序列9所示單鏈DNA組成的引物對(duì)，以及核苷酸序列如序列表中序列10所示的探針；(用于擴(kuò)增水稻內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因GOS片段)(a4)由序列表中序列11和序列12所示單鏈DNA組成的引物對(duì)，以及核苷酸序列如序列表中序列13所示的探針。(用于擴(kuò)增RB片段)以上(al)_ (a4)中，所述探針可為T(mén)aqMan熒光探針。TaqMan熒光探針是一種寡核苷酸探針，報(bào)告熒光基團(tuán)連接在探針的5’末端，淬滅熒光基團(tuán)連接在探針的3’末端。PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收； 0 擴(kuò)增時(shí)3&(1酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和 淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。所述報(bào)告熒光基團(tuán)可為Fam (FAM)、Hex (HEX)、Tet (TET)、Joe (JOE)、Vic (VIC)、Fite(FITE)、Cy3 (CY3)或 Cy5 (CY5)。所述淬滅熒光基團(tuán)可為 Tamra (TAMRA)、Rox (ROX)、Dabcy (DABCY) ,Bhql (BHQl)或Bhq2 (BHQ2)。在本發(fā)明中，所述探針5’端標(biāo)記的報(bào)告熒光基團(tuán)具體為FAM熒光基團(tuán)，3’端標(biāo)記的淬滅熒光基團(tuán)具體為T(mén)AMRA熒光基團(tuán)。所述試劑盒在作為標(biāo)準(zhǔn)體系檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號(hào)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。制備所述試劑盒的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。該方法具體可包括如下步驟:將所述試劑盒中的所述環(huán)狀載體、各引物對(duì)和各探針?lè)謩e單獨(dú)包裝。本發(fā)明所提供的特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)分子包含外源基因CpTI和Bt、內(nèi)參基因GOS及邊界序列部分區(qū)段。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的標(biāo)準(zhǔn)分子具有較高的靈敏度，其最低檢測(cè)線可達(dá)2拷貝，線性范圍廣，均勻性好，穩(wěn)定性強(qiáng)，對(duì)于轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號(hào)的定性和定量檢測(cè)具有重要意義。


圖1為標(biāo)準(zhǔn)分子PEASY-KF6質(zhì)粒陽(yáng)性克隆的PCR篩選結(jié)果。其中，泳道M為DL2000DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道I為陽(yáng)性對(duì)照；泳道2_24為23個(gè)標(biāo)準(zhǔn)分子pEASY_KF6質(zhì)?？寺?。
圖2為標(biāo)準(zhǔn)分子pEASY-KF6的質(zhì)粒構(gòu)建圖。實(shí)際上，對(duì)于插入片段，在“CpTI基因”前還有GCG-Hind III ;在“Bt基因”后還有Xba 1-GCG0圖3為各引物和探針特異性檢測(cè)結(jié)果。其中，A為外源基因CpTI的特異性檢測(cè)結(jié)果:1表示轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號(hào)(GMO+) ；B為外源基因Bt的特異性檢測(cè)結(jié)果:1表示轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號(hào)(GM0+)，2表示轉(zhuǎn)基因水稻品系Bt63，3表示轉(zhuǎn)基因棉花(轉(zhuǎn)Bt抗蟲(chóng)基因)品系中棉41 ;C為內(nèi)參基因GOS的特異性檢測(cè)結(jié)果:1表示轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號(hào)(GM0+)，2表示非轉(zhuǎn)基因水稻品系明恢86 (GM0-)，3表示轉(zhuǎn)基因水稻品系Bt63 ；D為邊界序列(品系特異性)的特異性檢測(cè)結(jié)果:1表示轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號(hào)(GM0+)。圖4為標(biāo)準(zhǔn)體系的靈敏度及標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定。其中，a為外源基因CpTI的靈敏度及標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定；b為外源基因Bt的靈敏度及標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定；c為內(nèi)參基因GOS的靈敏度及標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定；d為邊界序列(品系特異性)的靈敏度及標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定。a-d中，A-H均表示所檢測(cè)的模板(標(biāo)準(zhǔn)分子PEASY-KF6)的用量，A為1.5X 1O7拷貝，B為1.5X IO6拷貝，C為
1.5 X 1O5 拷貝，D 為 1.5 X 1O4 拷貝，E 為 1.5 X 1O3 拷貝，F(xiàn) 為 1.5 X 1O2 拷貝，G 為 1.5 X 1O1拷貝，H為1.5X10°拷貝。a-d中，標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)均表示起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)均表示Ct值，即每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。pEASY-T3載體:北京全式金生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為CT301。轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號(hào)(GM0+)(轉(zhuǎn)CpTI基因水稻):中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院；戎俊，宋志平，蘇軍，夏輝，王鋒，盧寶榮.Bt/CpTI轉(zhuǎn)基因稻及其非轉(zhuǎn)基因親本對(duì)照在間隔種植條件下的轉(zhuǎn)基因漂移.生物多樣性，2006，14(4):309 - 314?？曝S6號(hào)由中國(guó)水稻研究所王渭霞提供，是1994年由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所王鋒和中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所朱禎共同培育的。轉(zhuǎn)基因水稻品系Bt63:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院；趙衛(wèi)東，鄭文杰，賀艷.熒光PCR方法定性和定量檢測(cè)BT63轉(zhuǎn)基因大米[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2009, (03): 133-135。非轉(zhuǎn)基因水稻品系明恢86 (GM0-):中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院；張建新，鄭家團(tuán)，謝華安，羅家密，黃顯波，鄧則勤，吳蘭英.水稻新種質(zhì)明恢86及其系列組合的選育研究[J].植物遺傳資源科學(xué)，2001，(01):32-36.
轉(zhuǎn)基因番茄品系華番I號(hào):中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院；黃文勝，陳紅運(yùn)，趙文軍，等.轉(zhuǎn)基因延熟番茄“華番一號(hào)”的品系特異性檢測(cè)方法[J].植物檢疫，2005，19(6):321-325。轉(zhuǎn)基因棉花(轉(zhuǎn)Bt抗蟲(chóng)基因)品系中棉41:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院；劉生榮，夏志明，劉黨培.雙價(jià)抗蟲(chóng)棉中棉所41豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)性及其簡(jiǎn)化栽培技術(shù)研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2005，(03): 166-168。轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米品系BVLA430101:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院；RumeiChen, Guangxing Xuej Yunliu Fan et al., Transgenic maize plants expressing afungal phytase gene.Transgenic Res(2008) 17:633-643。
實(shí)施例1、標(biāo)準(zhǔn)分子pEASY-KF6的構(gòu)建及特異性引物和探針的合成一、標(biāo)準(zhǔn)分子pEASY-KF6的構(gòu)建合成序列表中序列I所示的DNA片段，自5’端至3’端依次為:GCG_Hind II1-豇豆胰蛋白酶抑制劑編碼基因(CpTI基因)片段(第10-101位)-BamH 1-Ti質(zhì)粒T-DNA的右邊界序列(右邊界序列RB)片段(第108-184位)-BamH 1-水稻內(nèi)源基因GOS片段(第191-258位)-Hind II1-蘇云金芽孢桿菌殺蟲(chóng)晶體蛋白編碼基因(Bt基因)片段(第265-336位)-Xba 1-GCG。將上述合成的序列表中序列I所示的DNA片段以T-A克隆的方式與pEASY_T3載體相連，以連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，對(duì)重組菌懸液采用引物KF-F和KF-R進(jìn)行PCR檢測(cè)。同時(shí)以合成的序列表中序列I所示的DNA片段為模板作為陽(yáng)性對(duì)照。KF-F:5’ -GCGAAGCTTGATGACTCAAGCGATGAACC-3’(序列 I 的第 1-29 位)；KF-R:5’ -CGCTCTAGATTCTGGACTGCGAACAATGG-3’(序列 I 的第 317-345 位的反向互補(bǔ)序列)。

結(jié)果如圖1所示，PCR檢測(cè)的23個(gè)克隆均為陽(yáng)性。進(jìn)一步對(duì)陽(yáng)性克隆送樣測(cè)序。經(jīng)測(cè)序表明正確連入序列表中序列I所示DNA片段的pEASY-T3載體為陽(yáng)性，將其命名為PEASY-KF6 (圖2)。所得重組載體pEASY_KF6即為標(biāo)準(zhǔn)分子。二、特異性引物和探針的合成根據(jù)上述步驟一中合成的序列表中序列I所示的DNA片段，針對(duì)各基因設(shè)計(jì)如表I中所示的各特異性引物和探針。

表I科豐6號(hào)引物探針序列
權(quán)利要求
1.環(huán)狀載體，包括豇豆胰蛋白酶抑制劑編碼基因片段、蘇云金芽孢桿菌殺蟲(chóng)晶體蛋白編碼基因片段、水稻內(nèi)源基因GOS片段，以及Ti質(zhì)粒T-DNA的邊界序列片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的環(huán)狀載體，其特征在于:所述豇豆胰蛋白酶抑制劑編碼基因片段的序列如序列表中序列I的第10-101位所示；或 所述蘇云金芽孢桿菌殺蟲(chóng)晶體蛋白編碼基因片段的序列如序列表中序列I的第265-336位所示；或 所述水稻內(nèi)源基因GOS片段的序列如序列表中序列I的第191-258位所示；或 所述Ti質(zhì)粒T-DNA的邊界序列片段的序列如序列表中序列I的第108-184位所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的環(huán)狀載體，其特征在于:所述環(huán)狀載體為將所述豇豆胰蛋白酶抑制劑編碼基因片段、所述蘇云金芽孢桿菌殺蟲(chóng)晶體蛋白編碼基因片段、所述水稻內(nèi)源基因GOS片段、所述Ti質(zhì)粒T-DNA的邊界序列片段一同與PEASY-T3質(zhì)粒相連后得到的重組載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的環(huán)狀載體，其特征在于:所述環(huán)狀載體為將如序列表中序列I所示的DNA片段與所述PEASY-T3質(zhì)粒連接所得的重組載體。
5.權(quán)利要求1-4中任一所述的環(huán)狀載體在作為標(biāo)準(zhǔn)分子檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號(hào)中的應(yīng)用。
6.定性或定量檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號(hào)的試劑盒，包括權(quán)利要求1-4中任一所述的環(huán)狀載體和如下(al)_ (a4)中的全部或部分: (al)由序列表中序列2和序列3所示單鏈DNA組成的引物對(duì)，以及核苷酸序列如序列表中序列4所不的探針； (a2)由序列表中序列5和序列6所示單鏈DNA組成的引物對(duì)，以及核苷酸序列如序列表中序列7所不的探針； (a3)由序列表中序列8和序列9所示單鏈DNA組成的引物對(duì)，以及核苷酸序列如序列表中序列10所不的探針； (a4)由序列表中序列11和序列12所示單鏈DNA組成的引物對(duì)，以及核苷酸序列如序列表中序列13所示的探針。
7.權(quán)利要求6所述的試劑盒在作為標(biāo)準(zhǔn)體系檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號(hào)中的應(yīng)用。
8.制備權(quán)利要求6所述試劑盒的方法，包括如下步驟:將權(quán)利要求6所述試劑盒中的所述環(huán)狀載體、各引物對(duì)和各探針?lè)謩e單獨(dú)包裝。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)分子及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的標(biāo)準(zhǔn)分子為環(huán)狀載體，包括如序列1的第10-101位所示的豇豆胰蛋白酶抑制劑編碼基因片段、如序列1的第256-336位所示的蘇云金芽孢桿菌殺蟲(chóng)晶體蛋白編碼基因片段、如序列1的第191-258位所示的水稻內(nèi)源基因GOS片段，以及如序列1的第108-184位所示的Ti質(zhì)粒T-DNA的邊界序列片段。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的標(biāo)準(zhǔn)分子具有較高的靈敏度，其最低檢測(cè)線可達(dá)2拷貝，線性范圍廣，均勻性好，穩(wěn)定性強(qiáng)，對(duì)于轉(zhuǎn)基因水稻品系科豐6號(hào)的定性和定量檢測(cè)具有重要意義。
文檔編號(hào)C12N15/63GK103160533SQ201310088359
公開(kāi)日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2013年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月19日
發(fā)明者黃新, 任鶴 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院