專利名稱：用于促進生姜生長及防控連作生姜土傳枯萎病的促生菌及其微生物有機肥料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于促進生姜生長及防控連作生姜土傳枯萎病的促生菌及其微生物有機肥料，屬于農(nóng)業(yè)集約化生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
生姜土傳枯萎病是一種典型的土傳病害，嚴重影響生姜的產(chǎn)量與質(zhì)量。生姜枯萎病主要危害地下塊莖，該病病原菌為姜尖孢鐮刀菌和腐皮尖孢鐮刀菌，在連作2 3茬后即可發(fā)病，連作5年后越發(fā)嚴重。如果沒有防控該病害的方法與途徑，生姜植株生長將難以維繼。我們的研究結(jié)果表明，連作作物土傳枯萎病的關(guān)鍵問題不是養(yǎng)分缺乏或不平衡，也不是土壤次生鹽潰化問題，而是土壤中的微生物區(qū)系及其次生物質(zhì)的致毒問題。我國作物秸桿就地焚燒、規(guī)模化養(yǎng)殖后的畜禽糞便隨地棄置等不僅嚴重污染了環(huán)境，也極大地浪費了能作為有機肥和生物有機肥產(chǎn)品的原料；大量的養(yǎng)分資源流失于土壤-植物系統(tǒng)之外，明顯地削弱了我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的能力。如何將從土壤中因作物收獲而帶走的營養(yǎng)元素最大限度地歸還到土壤中去，唯一的途徑就是將這些固體有機廢棄物制成商品有機肥料再施入土壤。如果將這些固體有機廢棄物高溫發(fā)酵制備成腐熟堆肥，再將其用作制備生物(含特定有益微生物)有機肥料的載體將會有很好的應(yīng)用前景。生物有機肥是指特定功能微生物與主要以動植物殘體(如農(nóng)作物秸桿、畜禽糞便等)為來源并經(jīng)無害化處理、腐熟的有機物料復(fù)合而成的一類兼具微生物肥料和有機肥效應(yīng)的肥料。其本質(zhì)特征是含有特定功能的、表現(xiàn)出一定肥料效應(yīng)的有益微生物，這些特定有益微生物的生命活動是生物有機肥優(yōu)于其它肥料的關(guān)鍵因素。大量研究表明:農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中生物有機肥在增強作物抗逆性、提供作物養(yǎng)分、增加肥效、改善作物對養(yǎng)分的吸收、調(diào)節(jié)土壤酸堿度等方面發(fā)揮著積極的作 用。本研究擬從生姜土傳枯萎病發(fā)病嚴重的田塊中生長健康的生姜植株根系及根際土壤中篩選促生菌株，再與腐熟堆肥和其他合適載體采用合適的工藝生產(chǎn)促進生姜生長及防控連作生姜土傳枯萎病的微生物有機肥料，為生姜規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)產(chǎn)品。

發(fā)明內(nèi)容
1.技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于提供用于促進生姜生長及防控連作生姜土傳枯萎病的促生菌及其微生物有機肥料，防效高，并且有增產(chǎn)功能，使生姜連作生物障礙土壤得到生物修復(fù)，確保集約化農(nóng)業(yè)的順利發(fā)展。2.技術(shù)方案用于促進生姜生長及防控連作生姜土傳枯萎病的促生菌NJPRHSDAQ-1，屬解淀粉芽孢桿菌屬(Bacillus amyloliquefaciens), 2012年12月10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中國科學(xué)院微生物研究所，NJPRHSDAQ-1 菌種保藏號為；CGMCC N0.6963。NJPRHSDAQ-1菌株的主要生物學(xué)特性為菌體革蘭氏染色陽性，桿狀，中生芽孢，兼性厭氧生長，接觸酶陽性、氧化酶陽性、V.P.反應(yīng)陽性，甲基紅試驗陽性，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，發(fā)酵果糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，可發(fā)酵木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇，硝酸還原酶陽性，淀粉水解陽性，明膠水解陽性。用上述促進生姜生長及防控連作生姜土傳枯萎病的促生菌所生產(chǎn)的微生物有機肥料，該微生物有機肥料中含有I X IO8個/g以上的NJPRHSDAQ-1、全氮含量質(zhì)量比為4 5%,全氮中質(zhì)量比90%以上為有機氮，總氮磷鉀養(yǎng)分質(zhì)量比為6 10%、有機質(zhì)含量質(zhì)量比為30 35%。所述微生物有機肥料的生產(chǎn)方法，其特征為:(I)將權(quán)利要求1所述的促生菌NJPRHSDAQ-1，進行液體發(fā)酵生產(chǎn)，其發(fā)酵生產(chǎn)的條件為:培養(yǎng)液為NA培養(yǎng)基，pH7.0，發(fā)酵溫度范圍30 35°C，攪拌速度為180 300/轉(zhuǎn)分鐘，發(fā)酵時間為48hr.，發(fā)酵液的含菌或芽孢量> I X 101°個/ml ;所用NA培養(yǎng)液配制方法為，以配制IL培養(yǎng)基為例:葡萄糖IOg,蛋白胨5g,酵母粉0.5g,牛肉膏3g,加蒸懼水定容至IOOOmL, pH 值調(diào)至 7.0，115°C滅菌 30min。(2)分別將NJPRHSDAQ-1發(fā)酵液按50L/噸的量接種到腐熟的豬糞堆肥和菜柏的微生物分解混合物中進行固體發(fā)酵，發(fā)酵過程中每天翻堆I次，溫度不超過50°C，發(fā)酵5天，發(fā)酵結(jié)束后促生菌NJPRHSDAQ-1含量均達到I X IO8個/g以上，分別獲得含促生菌NJPRHSDAQ-1的豬糞堆肥固體菌劑和含促生菌NJPRHSDAQ-1的菜柏微生物分解混合物固體菌劑。所用腐熟的豬糞堆肥發(fā)芽指數(shù)為98%以上，有機質(zhì)含量> 35%，有機氮含量為1.2-2.0%，含水量25-30%。菜柏的微生物酶解物制備方法為，將保藏號為CGMCCN0.1543的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)菌株37-1發(fā)酵液加入到菜柏原料中，調(diào)節(jié)含水量55-65%和pH6.0-7.5，進行開放式固體發(fā)酵，待發(fā)酵溫度上升至50°C時立即開始翻堆，以后每天翻堆，使堆溫始終維持在35-50°C共5天，固體發(fā)酵開始后，堆物的PH會不斷上升，每次翻堆時用含酸液體調(diào)節(jié)含水量和pH，使它們分別維持在55-65%和6.0-7.0，發(fā)酵終止時再用含酸液體進行噴灑，直至堆物pH調(diào)整為5.0，再進行低溫干燥或自然涼干，即為菜柏的微生物酶解物。(3)再將含促生菌NJPRHSDAQ-1的豬糞堆肥固體菌劑和含促生菌NJPRHSDAQ-1的菜柏微生物分解混合物固體菌劑按體積比50-70%: 30-50%的比例充分混合，并后熟
2-3天，后熟過程中翻堆2次，最后在溫度不超過60°C的條件下將微生物有機肥的含水量蒸發(fā)至30%以下，包裝出廠即為能促進生姜生長及防控連作生姜土傳枯萎病的微生物有機肥。所述微生物有機肥料可專用于促進生姜生長及生姜土傳枯萎病的生物防控。3.有益效果本發(fā)明與目前市場上的有機肥料產(chǎn)品相比具有如下優(yōu)點:I)該肥料產(chǎn)品中含有促進生姜生長及抑制生姜土傳枯萎病原真菌生長的專一性高效菌株NJPRHSDAQ-1，其抑制效果非常顯著。盆 栽試驗結(jié)果表明，生姜土傳枯萎病的防控率達到75%以上，如果在開始種植生姜的土壤中連年施用本肥料產(chǎn)品，可以有效控制生姜土傳枯萎病的發(fā)生。2)該肥料為有機肥，含有豐富的有機質(zhì)(30 35% )，有機氮含量為4%，而且大部分為氨基酸和小分子多肽。本產(chǎn)品總磷含量為4%，而且生物有效性特別高，使用本產(chǎn)品后能使作物順利度過苗期磷素敏感期。3)由于是生物菌株制劑，完全沒有因化學(xué)農(nóng)藥的使用所帶來的一系列問題，因而有利于蔬菜的無公害生產(chǎn)，農(nóng)民可以不用或減少其他防治疫病化學(xué)農(nóng)藥的用量，這不僅可為農(nóng)民節(jié)省開支，而且有利于農(nóng)產(chǎn)品的出口。同時，該微生物肥料還有增產(chǎn)功能，可為農(nóng)民增加收入。4)該微生物有機肥可以在營養(yǎng)缽使用，也可以在大田使用，不僅具有有機肥的功能，而且其中所含的促生菌通過多種促生及生防機制起作用，從而達到促生及防控生姜土傳枯萎病的效果。
四

圖1NJPRHSDAQ-1菌株的拮抗效果圖2NJPRHSDAQ-1菌株的的盆栽效果(注:CK為對照，T為施用含有NJPRHSDAQ-1的微生物有機肥)
五具體實施例方式(一 )促生菌株的分離促生菌株的初篩:采集生姜連作田塊中健康生姜植株的根際土壤，采用PDA+NA加入生姜土傳枯萎病病原菌-尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)(從山東安丘生姜土傳枯萎病發(fā)病嚴重的田塊中采集的發(fā)病植株中經(jīng)分離純化所得，經(jīng)回接試驗鑒定后證實為生姜土傳枯萎病病原菌)孢子懸液的雙層平板初篩目標菌株，初篩共獲得14株目標菌株，將菌種凍干_20°C保存，用于進一步篩選。促生菌株的復(fù)篩:取初篩后的促生菌株和病原菌，在PDA平板上進行對峙試驗，進行復(fù)篩。用打孔器(5_)從長滿病原菌的平板上挖取一塊病原菌菌塊至PDA平板中央，置于28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。ld(24h)后在PDA平板中央，距病原菌塊四周2cm處用滅菌牙簽接種待測目標菌，28°C培養(yǎng)3 5d，觀察測試目標菌菌落對病原菌的抑制情況。最終篩選得到菌株NJPRHSDAQ-1，其拮抗效果見圖1。( 二)促生菌株的鑒定促生菌株NJPRHSDAQ-1鑒定為解淀粉芽孢桿菌屬(Bacillusamyloliquefaciens)。NJPRHSDAQ-1菌株的主要生物學(xué)特性為菌體革蘭氏染色陽性，桿狀，中生芽孢，兼性厭氧生長，接觸酶陽性、氧化酶陽性、V.P.反應(yīng)陽性，甲基紅試驗陽性，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，發(fā)酵果糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，可發(fā)酵木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇，硝酸還原酶陽性，淀粉水解陽性，明膠水解陽性。(三)菌劑生產(chǎn) (I)將促生菌株NJPRHSDAQ-1，接種到NA培養(yǎng)液進行液體發(fā)酵生產(chǎn)，其發(fā)酵生產(chǎn)的條件為:pH7.0，發(fā)酵溫度范圍30 35°C，攪拌速度為180 300轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時間為48hr.，發(fā)酵液的含菌或芽孢量彡I X IOltl個/ml。(2)分別將NJPRHSDAQ-1發(fā)酵液按50L/噸的量接種到腐熟的豬糞堆肥和菜柏經(jīng)微生物分解混合物中進行固體發(fā)酵，發(fā)酵過程中每天翻堆I次，溫度不超過50°C，發(fā)酵5天，發(fā)酵結(jié)束后促生菌NJPRHSDAQ-1含量均達到I X IO8個/g以上，獲得含促生菌株NJPRHSDAQ-1的豬糞堆肥固體菌劑、和含促生菌株NJPRHSDAQ-1的菜柏經(jīng)微生物分解混合物的固體菌劑。所用腐熟的豬糞堆肥發(fā)芽指數(shù)為98%以上，有機質(zhì)含量> 35%，有機氮含量為
1.2-2.0 %，含水量 25-30 %。其中菜柏經(jīng)微生物分解混合物的制備方法為(公知公用，見發(fā)明專利ZL200610086126.0，一種農(nóng)用氨基酸的生物制取方法及其肥料產(chǎn)品)，菌株37_1發(fā)酵液加入到菜柏原料中，調(diào)節(jié)含水量55-65%和pH6.0-7.5，進行開放式固體發(fā)酵，待發(fā)酵溫度上升至50°C時立即開始翻堆，以后每天翻堆，使堆溫始終維持在35-50°C (共5天)，固體發(fā)酵開始后，堆物的PH會不斷上升，每次翻堆時用含酸液體調(diào)節(jié)含水量和PH，使它們分別維持在55-65 %和6.0-7.0，發(fā)酵終止時再用含酸液體進行噴灑，直至堆物pH調(diào)整為5.0左右，再進行低溫干燥或自然涼干，即為菜柏的微生物分解混合物(含氨基酸的混合材料)_菜柏堆肥?！?3)再將含促生菌株NJPRHSDAQ-1的豬糞堆肥固體菌劑、和含促生菌株NJPRHSDAQ-1的菜柏經(jīng)微生物分解混合物的固體菌劑按體積比50-70%: 30-50%的比例充分混合，并后熟2-3天，后熟過程中翻堆2次，最后在溫度不超過60°C的條件下將微生物有機肥的含水量蒸發(fā)至30%以下，包裝出廠即為能促進生姜生長及防控連作生姜土傳枯萎病的微生物有機肥。該微生物有機肥料(促進生姜生長及防控生姜土傳枯萎病的專用微生物有機肥)中含有I X IO8個/g以上的NJPRHSDAQ-1、全氮含量質(zhì)量比為4 5%，全氮中質(zhì)量比90%以上為有機氮，總氮磷鉀養(yǎng)分質(zhì)量比為6 10%、有機質(zhì)含量質(zhì)量比為30 35%。(四)盆栽防效試驗試驗設(shè)2個處理:CK1-對照，未施用微生物有機肥料；T_施用含NJPRHSDAQ-1菌株的微生物有機肥料。微生物有機肥料用量:將催好芽的生姜移栽到生姜土傳枯萎病連作土壤中(生姜土傳枯萎病病原孢子達到I X 105/g 土)，處理T中按土重I %的用量施入微生物有機肥料。所有處理的氮磷鉀用量一致，常規(guī)管理。之后觀察其發(fā)病情況，記錄發(fā)病率，確認促生菌株是否有抑制生姜枯萎病的效果。生姜植株培育30天后，發(fā)現(xiàn)CK (對照，未施微生物有機肥料)處理有發(fā)病植株，再過20天后,CK處理有80%的植株發(fā)病。生姜培育50天后的植株發(fā)病率和生姜土傳枯萎病的防控率結(jié)果如表I所示。盆栽試驗結(jié)果表明:施用含有NJPRHSDAQ-1的微生物有機肥，能顯著增加生姜連作土壤中細菌和防線菌的數(shù)量，降低真菌的數(shù)量(表I)，有效防控生姜土傳枯萎病的發(fā)生，其防控率為75% (表2)。表I不同生物有機肥對生姜連作枯萎病土壤微生物區(qū)系的影響
權(quán)利要求
1.用于促進生姜生長及防控連作生姜土傳枯萎病的促生菌，菌株 NJPRHSDAQ-1，為解淀粉芽孢桿菌屬(Bacillus amyloliquefaciens)，2012 年 12 月 10日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，NJPRHSDAQ-1菌種保藏號為:CGMCC N0.6963o NJPRHSDAQ-1菌株的主要生物學(xué)特性為菌體革蘭氏染色陽性，桿狀，中生芽孢，兼性厭氧生長，接觸酶陽性、氧化酶陽性、V.P.反應(yīng)陽性，甲基紅試驗陽性，發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，發(fā)酵果糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，可發(fā)酵木糖、L-阿拉伯糖、甘露醇，硝酸還原酶陽性，淀粉水解陽性，明膠水解陽性。
2.用權(quán)利要求1所述用于促進生姜生長及防控連作生姜土傳枯萎病的促生菌所生產(chǎn)的微生物有機肥料，該微生物有機肥料中含有l(wèi)X108cfu/g以上的NJPRHSDAQ-1、全氮含量質(zhì)量比為4 5%,全氮中質(zhì)量比90%以上為有機氮,總氮磷鉀養(yǎng)分質(zhì)量比為6 10%、有機質(zhì)含量質(zhì)量比> 45%。
3.權(quán)利要求2所述微生物有機肥料的生產(chǎn)方法，其特征為: (1)將權(quán)利要求1所述的促生菌株NJPRHSDAQ-1，接種到NA培養(yǎng)液，進行液體發(fā)酵生產(chǎn)，其發(fā)酵生產(chǎn)的條件為:pH7.0，發(fā)酵溫度范圍30 35°C，攪拌速度為180 300轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵時間為48hr.，發(fā)酵液的含菌或芽孢量> I X 101°個/ml ;所用NA培養(yǎng)液配制方法為:葡萄糖IOg,蛋白胨5g,酵母粉0.5g,牛肉膏3g,加蒸懼水定容至IOOOmL,pH值調(diào)至7.0,115°C 滅菌 30min。
(2)分別將NJPRHSDAQ-1發(fā)酵液按50L/噸的量接種到腐熟的豬糞堆肥和菜柏的微生物分解混合物中進行固體發(fā)酵，發(fā)酵過程中每天翻堆I次，溫度不超過50°C，發(fā)酵5天，發(fā)酵結(jié)束后促生菌NJPRHSDAQ-1含量均達到I X 108cfu/g以上，分別獲得含促生菌NJPRHSDAQ-1的豬糞堆肥固體菌劑和含促 生菌NJPRHSDAQ-1的菜柏微生物分解混合物固體菌劑，其中: 腐熟后的豬糞堆肥:所用腐熟的豬糞堆肥發(fā)芽指數(shù)為98%以上，有機質(zhì)質(zhì)量比含量彡45%，有機氮質(zhì)量比含量為1.2-2.0%，含水量質(zhì)量比25-30% ； 菜柏的微生物酶解物制備方法為，將保藏號為CGMCC N0.1543的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)菌株37-1發(fā)酵液加入到菜柏原料中，調(diào)節(jié)含水量55-65%和pH6.0-7.5，進行開放式固體發(fā)酵，待發(fā)酵溫度上升至50°C時立即開始翻堆，以后每天翻堆，使堆溫始終維持在35-50°C共5天，固體發(fā)酵開始后，堆物的pH會不斷上升，每次翻堆時用含酸液體調(diào)節(jié)含水量和PH，使它們分別維持在55-65%和6.0-7.0，發(fā)酵終止時再用含酸液體進行噴灑，直至堆物PH調(diào)整為5.0，再進行低溫干燥或自然涼干，即為菜柏的微生物酶解物； (3)再將含促生菌NJPRHSDAQ-1的豬糞堆肥固體菌劑和含促生菌NJPRHSDAQ-1的菜柏微生物分解混合物固體菌劑按體積比50-70%: 30-50%的比例充分混合，并后熟2-3天，后熟過程中翻堆2次，最后在溫度不超過60°C的條件下將微生物有機肥的含水量蒸發(fā)至30%以下，包裝出廠即為能促進生姜生長及防控連作生姜土傳枯萎病的微生物有機肥。
4.權(quán)利要求2所述微生物有機肥料在促進生姜生長和防控連作生姜土傳枯萎病方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于促進生姜生長及防控連作生姜土傳枯萎病的促生菌及其微生物有機肥料，屬于農(nóng)業(yè)集約化生產(chǎn)技術(shù)。本發(fā)明分離得到了一株促生菌NJPRHSDAQ-1，接種到腐熟的豬糞堆肥和菜粕的微生物分解混合物中進行固體發(fā)酵制成微生物有機肥料，肥料中含有1×108cfu/g以上的促生菌、全氮含量為4～5％(90％以上為有機氮)，總氮磷鉀養(yǎng)分為6～10％、有機質(zhì)含量≥45％。盆栽試驗結(jié)果表明，生姜土傳枯萎病的防控率達到75％以上，如果在開始種植生姜的土壤中連年施用本肥料產(chǎn)品，可以有效控制生姜土傳枯萎病的發(fā)生。
文檔編號C12R1/07GK103194405SQ20131008109
公開日2013年7月10日 申請日期2013年3月14日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月14日
發(fā)明者沈其榮, 黃啟為, 潘汝浩, 張楠 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)