專利名稱：一種能降解無(wú)定形纖維素的基因重組釀酒酵母的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及遺傳工程和發(fā)酵工程領(lǐng)域，更具體地，涉及一種能降解無(wú)定形纖 維素的基因重組釀酒酵母。
背景技術(shù)：
目前車用燃料乙醇幾乎都是用糧食玉米等為原料生產(chǎn)，大量生產(chǎn)燃料乙醇勢(shì)必會(huì)帶來(lái)與人爭(zhēng)糧的問(wèn)題，會(huì)加劇世界糧食短缺的危機(jī)。解決方式是盡量由纖維素(Cellulose)生產(chǎn)乙醇而避免用淀粉和糖類來(lái)生產(chǎn)乙醇。纖維素是自然界中存在最廣泛的碳水化合物，也是地球上數(shù)量最多的可再生資源。在我國(guó)，每年植物秸桿等纖維素類物質(zhì)總量達(dá)7億噸，但目前大部分采用焚燒處理，造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。用來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉的農(nóng)林廢棄物替代糧食為原料來(lái)生產(chǎn)燃料乙醇是一個(gè)重點(diǎn)的發(fā)展方向，已經(jīng)被認(rèn)為是發(fā)展循環(huán)經(jīng)濟(jì)的有效途徑。纖維素分子是由D-葡萄糖以β_1，4-糖苷鍵相聯(lián)結(jié)而成的高分子化合物。利用纖維素生產(chǎn)乙醇的前提是把纖維素有效地水解為葡萄糖。因此，一直以來(lái)人們都在尋求降解纖維素的有效方法。目前形成了包括物理方法、酸水解法和酶水解法在內(nèi)的幾種主要處理手段。物理方法既無(wú)法完全破壞纖維素的結(jié)構(gòu)，又能耗巨大。酸水解法會(huì)造成環(huán)境污染，且分解后的產(chǎn)物回收率不高。酶水解法即用纖維素酶進(jìn)行酶處理的過(guò)程，具有反應(yīng)條件溫和，副產(chǎn)物少的特點(diǎn)，被認(rèn)為是比較有效且更接近自然的一種方法，分解后的產(chǎn)物較易被回收利用，而且污染低。因此，利用低耗能、低污染的生物技術(shù)，尤其是微生物發(fā)酵法對(duì)纖維素進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。無(wú)定形纖維素是聚合度低、結(jié)構(gòu)疏松的纖維素，較容易被試劑滲透，水解較快。無(wú)定形纖維素來(lái)源廣泛,可從農(nóng)業(yè)纖維素廢棄物制得。它能被內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶(Endoβ -1, 4-glucanase,EG)隨機(jī)切斷β _1，4_糖苷鍵,生成大量帶非還原性末端的小分子纖維素片段；這些小分子纖維素片 段又能被β -葡萄糖苷酶(β -D-GluC0SidaSe，BGL)進(jìn)一步降解,最終水解成為葡萄糖分子。因此將內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶兩種酶結(jié)合，就能直接降解無(wú)定形纖維素，生成葡萄糖。釀酒酵母(cererisiae)是工業(yè)上乙醇發(fā)酵的首選菌種,具有利用葡萄糖合成乙醇的能力，但缺乏有效降解纖維素生成葡萄糖的酶，因此在自然條件下不能直接利用纖維素類物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)生乙醇。若能將上述兩種酶的基因?qū)脶劸平湍?，以基因工程手段彌補(bǔ)釀酒酵母纖維素降解能力的缺陷，就可實(shí)現(xiàn)利用無(wú)定形纖維素發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的目的，對(duì)于解決糧食危機(jī)、能源危機(jī)均具有重要的指導(dǎo)意義。專利(CN 101319196)中公開(kāi)了一種能同時(shí)分泌表達(dá)EG、CBH及BGL的重組酵母，雖然也能夠利用無(wú)定形纖維素為原料進(jìn)行乙醇發(fā)酵，但是需要在釀酒酵母菌中種同時(shí)轉(zhuǎn)入EG、CBH及BGL三種酶基因，構(gòu)建工藝相對(duì)復(fù)雜，三種酶基因之間的表達(dá)調(diào)控也相對(duì)復(fù)雜
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種能 降解無(wú)定形纖維素的基因重組釀酒酵母。本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問(wèn)題是，提供一種能降解無(wú)定形纖維素的基因重 組釀酒酵母的構(gòu)建方法。本發(fā)明的上述技術(shù)問(wèn)題通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
一種能降解無(wú)定形纖維素的基因重組釀酒酵母，該基因重組釀酒酵母是將內(nèi)切β -1, 4-葡聚糖酶(EG)基因和β -葡萄糖苷酶(BGL)基因通過(guò)釀酒酵母表達(dá)載體同時(shí)轉(zhuǎn)入釀酒酵母并獲得正確的分泌表達(dá)而構(gòu)建成的。作為一種優(yōu)選方案，所述的釀酒酵母表達(dá)載體為釀酒酵母多基因共表達(dá)載體。作為一種優(yōu)選方案，所述釀酒酵母多基因共表達(dá)載體為載體pScIKP(專利ZL 2008I 0029630.6)。一種能降解無(wú)定形纖維素的基因重組釀酒酵母的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
51.將內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶基因(EG)和β-葡萄糖苷酶基因(BGL)接入釀酒酵母表達(dá)載體中，構(gòu)建重組雙基因共表達(dá)載體；
52.將上述構(gòu)建得到的重組雙基因共表達(dá)載體用限制性內(nèi)切酶切割，使之線性化后轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因釀酒酵母。作為一種優(yōu)選方案，SI構(gòu)建重組雙基因共表達(dá)載體包括如下步驟: 511.分別將內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶基因(EG)和β-葡萄糖苷酶基因(BGL)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
512.用限制性內(nèi)切酶分別切割載體、內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶基因(EG)和β-葡萄糖苷酶基因(BGL)；
513.將內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶基因(EG)和β-葡萄糖苷酶基因(BGL)接入釀酒酵母表達(dá)載體中。作為一種優(yōu)選方案，S2中所述的限制性內(nèi)切酶為如a I。作為一種優(yōu)選方案，S2中所述的轉(zhuǎn)化是使用電轉(zhuǎn)化法、冷凍法或化學(xué)試劑法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。作為一種優(yōu)選方案，S12中用于切割內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶基因(EG)的限制性內(nèi)切酶為及I和分e I，用于切割葡萄糖苷酶基因(BGL)的限制性內(nèi)切酶為分e I ；S13中使用的限制性內(nèi)切酶為I和油a I。作為一種優(yōu)選方案，上述的內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶基因(EG)為綠色木霉的內(nèi)切β -1, 4-葡聚糖酶基因eg3 ;所述的β -葡萄糖苷酶基因(BGL)為綠色木霉的β -葡萄糖苷酶基因知"/7。作為一種最優(yōu)選方案，上述的內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶基因(EG)為綠色木霉AS3.3711 (購(gòu)自廣東微生物所菌種保藏中心)的內(nèi)切0-1，4-葡聚糖酶基因￡^^;所述的β -葡萄糖苷酶基因(BGL)為綠色木霉AS3.3711的β -葡萄糖苷酶基因bgll。綠色木霉AS3.3711的內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶基因的核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示，β -葡萄糖苷酶基因bgll的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。本發(fā)明所述的能降解無(wú)定形纖維素的基因重組釀酒酵母能夠降解無(wú)定形纖維素并發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
本發(fā)明構(gòu)建的基因重組釀酒酵母由于同時(shí)導(dǎo)入了兩種外源纖維素酶基因，所以能夠降解無(wú)定形纖維素成為葡萄糖，而釀酒酵母本身能利用葡萄糖合成乙醇，因此本發(fā)明的基因重組釀酒酵母可直接利用無(wú)定形纖維素發(fā)酵生成乙醇，無(wú)需外加另外的具有纖維素降解能力的微生物或纖維素酶共同發(fā)酵，也無(wú)需事先對(duì)無(wú)定形纖維素原料進(jìn)行糖化處理。因此，該基因重組釀酒酵母在利用無(wú)定形纖維素做原料生產(chǎn)乙醇的過(guò)程中具有操作簡(jiǎn)便、節(jié)能降耗、綠色環(huán)保的特點(diǎn)，在新一代石油替代產(chǎn)品一纖維素燃料乙醇的研制方面具有積極的推動(dòng)作用；
另一方面，本發(fā)明所述的釀酒酵母僅需要導(dǎo)入內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶(EG)基因和β -葡萄糖苷酶(BGL)兩種外源纖維素酶基因即可直接利用無(wú)定形纖維素發(fā)酵生成乙醇，且與專利(CN 101319196)中所述的釀酒酵母具有同樣的生產(chǎn)乙醇的能力。其優(yōu)勢(shì)在于:①本發(fā)明所述的雙基因重組酵母的構(gòu)建方法相對(duì)專利(CN 101319196)中三基因重組酵母的構(gòu)建方法簡(jiǎn)單，精簡(jiǎn)了生產(chǎn)步驟，節(jié)約了生產(chǎn)成本；②本發(fā)明所述的雙基因重組酵母在發(fā)酵過(guò)程中最大乙醇生成量出現(xiàn)的時(shí)間比三基因重組酵母短，因此發(fā)酵時(shí)間短、周期快，節(jié)約了時(shí)間，降低了能耗，也變相增加了產(chǎn)量本發(fā)明所述的雙基因重組酵母在降解無(wú)定形纖維素時(shí)不容易出現(xiàn)反饋抑制現(xiàn)象，因?yàn)镃BH降解纖維素的產(chǎn)物為纖維二糖，會(huì)對(duì)EG的酶活產(chǎn)生一定的反饋抑制作用，而本發(fā)明構(gòu)建的雙基因重組酵母由于不產(chǎn)生CBH，因此不會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的纖維二糖，也就不會(huì)對(duì)EG產(chǎn)生反饋抑制作用。


圖1為共表達(dá)兩種纖維素酶基因的重組質(zhì)粒構(gòu)建流程圖。圖2為雙基因重組酵母對(duì)無(wú)定形纖維素降解作用的剛果紅染色檢驗(yàn)結(jié)果圖。圖3為雙基因重組酵母降解無(wú)定形纖維素生成乙醇的氣相色譜檢測(cè)示例圖。圖4為雙基因重組酵母降解無(wú)定形纖維素并發(fā)酵生成乙醇的時(shí)間曲線圖。圖5為三基因重組酵母降解無(wú)定形纖維素，發(fā)酵生成乙醇的時(shí)間曲線圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例對(duì)發(fā)明不做任何形式的限定。實(shí)施例1內(nèi)切β -1, 4-葡聚糖酶基因eg3、β -葡萄糖苷酶基因bgll的克隆 參照GenBank上發(fā)表的里氏木霉(Jrichoderma reesei)纖維素酶基因序列，使用DNA
STAR引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，同時(shí)添加上合適的酶切位點(diǎn):
基因引物的參考序列為7: reesei EGIII，注冊(cè)號(hào)為M19373。
權(quán)利要求
1.一種能降解無(wú)定形纖維素的基因重組釀酒酵母，其特征在于該基因重組釀酒酵母是將內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶基因和β-葡萄糖苷酶基因通過(guò)釀酒酵母表達(dá)載體同時(shí)轉(zhuǎn)入釀酒酵母并獲得正確的分泌表達(dá)而構(gòu)建成的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因重組釀酒酵母，其特征在于所述的釀酒酵母表達(dá)載體為釀酒酵母多基因共表達(dá)載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因重組釀酒酵母，其特征在于所述釀酒酵母多基因共表達(dá)載體為載體pScIKP。
4.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的基因重組釀酒酵母的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟:內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶基因和β-葡萄糖苷酶基因接入釀酒酵母表達(dá)載體中，構(gòu)建重組雙基因共表達(dá)載體；上述構(gòu)建得到的重組雙基因共表達(dá)載體用限制性內(nèi)切酶切割，使之線性化后轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因釀酒酵母。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，SI構(gòu)建重組雙基因共表達(dá)載體包括如下步驟:別將內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶基因和β-葡萄糖苷酶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增；限制性內(nèi)切酶分別切割載體、內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶基因和β-葡萄糖苷酶基因； 內(nèi)切β-1，4-葡聚 糖酶基因和β-葡萄糖苷酶基因接入釀酒酵母表達(dá)載體中。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，S2中所述的限制性內(nèi)切酶為如aI。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建方法，其特征在于，S2中所述的轉(zhuǎn)化是使用電轉(zhuǎn)化法、冷凍法或化學(xué)試劑法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于，S12中用于切割內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶基因的限制性內(nèi)切酶為I和分e I，用于切割葡萄糖苷酶基因的限制性內(nèi)切酶%Spe I ;S13中使用的限制性內(nèi)切酶為I和油a I。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、4、5或8所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述的內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶基因?yàn)榫G色木霉的內(nèi)切爲(wèi)-^^葡聚糖酶基因^於廠所述的β-葡萄糖苷酶基因?yàn)榫G色木霉的葡萄糖苷酶基因知77。
全文摘要
本發(fā)明涉及遺傳工程和發(fā)酵工程領(lǐng)域，公開(kāi)了一種能降解無(wú)定形纖維素的基因重組釀酒酵母。該基因重組釀酒酵母是將內(nèi)切β-1,4-葡聚糖酶(EG)基因和β-葡萄糖苷酶(BGL)基因通過(guò)釀酒酵母表達(dá)載體同時(shí)轉(zhuǎn)入釀酒酵母并獲得正確的分泌表達(dá)而構(gòu)建成的。該基因重組釀酒酵母可利用無(wú)定形纖維素做原料生產(chǎn)乙醇且具有操作簡(jiǎn)便、節(jié)能降耗、綠色環(huán)保的特點(diǎn)，在新一代石油替代產(chǎn)品——纖維素燃料乙醇的研制方面具有積極的推動(dòng)作用。
文檔編號(hào)C12N1/19GK103103139SQ201310033518
公開(kāi)日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2013年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月29日
發(fā)明者劉澤寰, 龔映雪, 唐根云, 黎惠忠, 肖文娟, 李晶博, 林蔣海 申請(qǐng)人:廣州分子生物技術(shù)有限公司, 暨南大學(xué)