高粘附性丁酸梭菌及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明名稱為高粘附性丁酸梭菌及其制備方法，屬于基因重組領(lǐng)域。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種具有高粘附性的丁酸梭菌及其制備方法，技術(shù)方案要點為克隆得到乳桿菌的粘附蛋白基因，利用基因重組手段將含有粘附蛋白的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入丁酸梭菌，獲得丁酸梭菌重組菌株。通過基因表達，使丁酸梭菌可自體產(chǎn)生具有粘附功能的蛋白，大大提高了其粘附能力，進而提高了丁酸梭菌的治療功效。
【專利說明】高粘附性丁酸梭菌及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因重組領(lǐng)域，具體來說是一種基因重組后的丁酸梭菌及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]丁酸梭菌(CViosirii/iw? toijricw?)是一種新型的益生菌。丁酸梭菌又名酪酸菌，它是梭狀芽孢桿菌屬中的一個種，是1933年由日本千葉醫(yī)科大學宮入近治博士首先發(fā)現(xiàn)并報告的，因此又叫宮入菌。1935年,Kingi Miyairi博士從人的糞便和土壤中分離出丁酸梭菌，隨后發(fā)現(xiàn)其厭氧培養(yǎng)的過濾物中含有較少的脂肪酸，具有極強的整腸作用，它可抑制腸道中的致病菌，促進腸道中有益菌如雙歧桿菌和乳桿菌的生長。丁酸梭菌具有以下作用，(I) 丁酸梭菌能有效的抑制引起疾病的葡萄球菌、念珠菌、克雷伯菌、彎曲桿菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、痢疾桿菌和傷寒沙門氏菌以及腐敗菌的繁殖，調(diào)整腸道微生態(tài)恢復(fù)平衡，同時也減少了氨類、胺類、吲哚類和硫化氫等有害物質(zhì)的產(chǎn)生(這些產(chǎn)物如果被腸吸收可損害肝功能)。(2) 丁酸梭菌可以激活免疫系統(tǒng)，促進免疫功能，維持機體的健康狀況。(3) 丁酸梭菌在腸道內(nèi)能產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶、糖苷酶、纖維素酶，對腸道上皮組織的再生和修復(fù)有很重要的意義。但是，在丁酸梭菌的應(yīng)用過程中，其較低的粘附性能嚴重影響了它的應(yīng)用效果，因為大部分丁酸梭菌不能在動物腸道中定植，需要不斷的從外界補充，目前研究主要集中在提高丁酸梭菌的產(chǎn)量，例如申請?zhí)枮?01110324228.2的專利文獻公開了一種工業(yè)化生產(chǎn)超高細胞濃度的丁酸梭菌的方法，大大增加了它的應(yīng)用成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明解決的技術(shù)問題是，提供一種用具有高粘附性的丁酸梭菌及其制備方法，該方法將乳桿菌的粘附蛋白(adhension protein, AP)的基因轉(zhuǎn)移到丁酸梭菌中進行表達，從而提高丁酸梭菌的粘附能力。
[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
本發(fā)明制得的高粘附性丁酸梭菌重組菌株是攜帶重組質(zhì)粒的丁酸梭菌，所述的重組質(zhì)粒是含乳桿菌粘附蛋白基因的枯草芽孢桿菌質(zhì)粒PHY300PLK。
[0005]本發(fā)明所需的乳桿菌粘附蛋白基因可以從乳桿菌中擴增出來，所用引物為:5丨-CGCGGATCCATGAATACTGTTGCTCCTC-3 ;和 5' -CCGGAATTCATTTTTTTTACGTTTTTTTT-3 ;(引物合成自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)。
[0006]所述的乳桿菌粘附蛋白基因的核昔酸序列為SEQ ID No:2。
[0007]所述的乳桿菌粘附蛋白基因編碼的粘附蛋白的氨基酸序列為SEQ ID No:1。
[0008]一種利用基因工程技術(shù)制備高粘附性丁酸梭菌的方法，特征在于利用攜帶乳桿菌粘附蛋白基因編碼區(qū)的重組表達載體，采用任何轉(zhuǎn)基因方法在丁酸梭菌中表達乳桿菌粘附蛋白，從而提高丁酸梭菌的粘附能力。其步驟如下:
(O采用基因克隆的方法獲得乳桿菌粘附蛋白基因編碼區(qū)；(2)把乳桿菌粘附蛋白基因編碼區(qū)連于表達調(diào)控序列，形成重組表達載體；
(3)采用任何轉(zhuǎn)基因方法將重組表達載體轉(zhuǎn)化至丁酸梭菌中；
(4)在特定的條件下篩選和鑒定丁酸梭菌轉(zhuǎn)化子；
(5)在適合的條件下培養(yǎng)丁酸梭菌陽性克隆，獲得基因重組后的丁酸梭菌。
[0009]本發(fā)明涉及的重組菌株是攜帶重組質(zhì)粒的丁酸梭菌，所述的重組質(zhì)粒是含乳桿菌粘附蛋白基因的枯草芽孢桿菌質(zhì)粒PHY300PLK。用上述方法獲得重組丁酸梭菌，其特征為:導(dǎo)入了乳桿菌的粘附蛋白基因序列，可表達粘附蛋白，從而提聞了粘附能力，可大大提聞其在動物腸道中的定植能力。
[0010]所述的高粘附性丁酸梭菌，對于抗生素引起的雞、豬腹瀉，有較強的治療作用，最佳使用量為IO6個/千克體重。
[0011]所述的高粘附性丁酸梭菌，與殼聚糖、低聚寡糖(如低聚木糖、甘露寡糖等)等混合使用，效果更佳，最佳重量比例為1:1-100:1-100。
[0012]所述的高粘附性丁酸梭菌，用于水產(chǎn)養(yǎng)殖或改善水質(zhì)，所用濃度為IO4個/毫升。
[0013]在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒等。
[0014]在本發(fā)明中，術(shù)語“任何轉(zhuǎn)基因方法”包括電擊法基因轉(zhuǎn)化、超聲波介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、顯微注射介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、激光微束介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、基因槍法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化等。
[0015]在本發(fā)明中，術(shù)語“在特定的條件下篩選和鑒定丁酸梭菌轉(zhuǎn)化子”是指用培養(yǎng)基平板培養(yǎng)的條件下用抗生素(四環(huán)素、卡那霉素、氨芐青霉素等)選擇出有抗生素抗性的陽性轉(zhuǎn)化子，并使用PCR、Northern雜交等方式來鑒定丁酸梭菌的陽性轉(zhuǎn)化子。
[0016]在本發(fā)明中，術(shù)語“在適合的條件下培養(yǎng)丁酸梭菌陽性克隆”是指對鑒定后的陽性丁酸梭菌轉(zhuǎn)化子進行培養(yǎng)基平板培養(yǎng)，并檢測乳桿菌粘附蛋白的表達水平，篩選出優(yōu)良的轉(zhuǎn)化子進行培養(yǎng)。
[0017]在本發(fā)明中，我們從乳桿菌中克隆出了粘附蛋白基因序列，利用基因克隆技術(shù)構(gòu)建了重組表達載體，并遺傳轉(zhuǎn)化丁酸梭菌，使得丁酸梭菌可自體產(chǎn)生具有粘附功能的蛋白，提高了丁酸梭菌的粘附能力，并通過篩選重組子進行培養(yǎng)獲得了基因重組的丁酸梭菌菌株。
[0018]蛋白電泳分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)誘導(dǎo)后高效表達相對分子量為9.5 KD的蛋白。
[0019]動物實驗結(jié)果表明，重組后的丁酸梭菌對抗生素引起的小白鼠腹瀉具有較強的治療作用，使用量為IO6個/千克體重時的治愈率達100%。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1是本發(fā)明的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，泳道M是DNA marker;泳道I是為PCR產(chǎn)物。
[0021]圖2是本發(fā)明構(gòu)建載體的示意圖。
[0022]圖3是本發(fā)明的重組質(zhì)粒pHY300PLK-AP的雙酶切鑒定圖譜，泳道M為DNAmarker;泳道I為Eco R I和BamH I雙酶切產(chǎn)物；泳道2為EcoR I單酶切產(chǎn)物；泳道3為BamH 1:單酶切產(chǎn)物。
[0023]圖4是本發(fā)明的重組丁酸梭菌蛋白表達的SDS-PAGE分析圖，泳道M為標準分子量蛋白；泳道I為重組后的丁酸梭菌表達蛋白；泳道2為未基因重組的丁酸梭菌表達蛋白；可見泳道I比泳道2多了一條約9.5kD的蛋白條帶，如圖中箭頭所示。
[0024]
序列I (SEQ ID N0.1)是乳桿菌粘附蛋白的氨基酸序列。
[0025]序列2 (SEQ ID N0.2)乳桿菌粘附蛋白基因的核苷酸序列
【具體實施方式】
[0026]下面結(jié)合具體實施例及附圖，進一步對本發(fā)明進行闡述。應(yīng)理解，實施例部分僅用于理解本發(fā)明而不用限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法，通常按章常規(guī)的條件，例如《分子克隆》(New York;Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件或按照制造廠商所建議的條件。
[0027]實施例1乳桿菌粘附蛋白基因序列的克隆
豐艮據(jù)文獻i己載(Complete genome sequence of Lactobacillus kefiranofaciensZW3.Journal of Bacteriology, 2011，193(16): 4280-4281)和 NCBI (美國國立生物技術(shù)信息中心)(GeneBank登錄號:NC_015602)所記載的乳桿菌粘附蛋白基因序列，并根據(jù)枯草芽孢桿菌質(zhì)粒PHY300PLK的多克隆酶切位點，設(shè)計攜帶相應(yīng)酶切位點的基因特異性引物對目的基因(乳桿菌粘附蛋白基因)進行擴增，用于構(gòu)建重組表達載體。
[0028]所用引物為:5' -CGCGGATCCATGAATACTGTTGCTCCTC-3 ;(作為上游引物，攜帶召amHI 酶切位點)和 5 ; -CCGGAATTCATTTTTTTTACGTTTTTTTT-3 ;(作為下游引物，攜帶萬coRI酶切位點，保護堿基分別為CGC和CCG)。
[0029]從開菲爾乳桿菌{Lactobacillus購于中國普通微生物菌種保藏管理中心)中抽提基因組DNA (上海生工生物工程公司的EZ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒)，以此基因組DNA為模板，進行PCR擴增(上海生工生物工程公司即用PCR擴增試劑盒，SK2081), PCR反應(yīng)體系為:20微升；反應(yīng)過程如下:
95 0C 30 s 55 0C 30 s 72 0C I min
進行30個循環(huán)。用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，獲得擴增目的基因(見圖1)。
[0030]實施例2構(gòu)建重組質(zhì)粒pHY300PLK-AP
電泳分離后，對目的基因的PCR產(chǎn)物(相對分子量為271bp)進行回收(SK8131，SanPr印柱式DNA膠回收試劑盒，上海生工生物工程公司)，取適量回收產(chǎn)物與枯草芽孢桿菌質(zhì)粒PHY300PLK (購于中國質(zhì)粒載體菌株細胞株基因保藏中心)用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI (限制性內(nèi)切酶購自于上海生工生物工程公司)進行酶切，然后用T4 DNA連接酶進行連接(載體構(gòu)建過程見附圖2)，轉(zhuǎn)化DH5 α，在含氨芐青霉素和四環(huán)素雙抗的LB平板上篩選得到單克隆，搖菌擴大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，AamHI和AcoRI雙酶切驗證(見圖3)并送上海生工生物工程公司測序進一步驗證(見圖5)，最終得到構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pHY300PLK-AP。
[0031]實施例3 丁酸梭菌的轉(zhuǎn)化
取培養(yǎng)至指數(shù)生長期的丁酸梭菌菌液(約培養(yǎng)16小時，丁酸梭菌由本實驗室分離、保存)制備感受態(tài)細胞，加入質(zhì)粒PHY300PLK-AP，混勻后以電擊法進行細胞轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的細胞以37°C培養(yǎng)，1.5小時后涂布含有四環(huán)素的LB培養(yǎng)基平板，37°C厭氧培養(yǎng)24小時后進行菌落PCR，電泳檢測獲得陽性克隆，排除未轉(zhuǎn)化成功的假陽性克隆，陽性克隆即為轉(zhuǎn)化后的丁酸梭菌。
[0032]實施例4乳桿菌粘附蛋白在丁酸梭菌中的表達情況(見圖4)
實驗過程如下:將轉(zhuǎn)化后的丁酸梭菌接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期(約16小時)，收集丁酸梭菌菌液，10000 r/min離心I min,沉淀加10 ml蒸懼水,進行超聲波破碎。超聲3s/off, 4 s/on, 50循環(huán)超聲破碎后的溶液12000 r/min離心10 min。取100 μ I上清液于一離心管中，此為上清樣品。未轉(zhuǎn)化的丁酸梭菌(起始丁酸梭菌)同樣處理，作對照。對這兩個樣品進行SDS-PAGE，電泳完畢后進行銀染染色，放入凝膠成像系統(tǒng)拍照。
[0033]實施例5動物實驗
本研究所用的丁酸梭菌經(jīng)急性毒理試驗(參照GB15193.3 Horn氏法操作)和Ames試驗檢驗，屬于安全無毒菌株，并對抗生素引起的小白鼠腹瀉，有較強的治療作用，最佳使用量為IO6個/千克體重。具體實驗步驟如下:
昆明種健康小鼠由浙江中醫(yī)學院動物中心提供，體重20~22克，飼養(yǎng)室溫度為20~25°C，相對濕度為40~60%。動物生產(chǎn)合格證號SCXK (滬)2002-0010，動物設(shè)施合格證號SYXK (浙)2003-0003，動物實驗合格證號(1996)第22-00223號。小鼠是無特定病原體(Specific pathogen free, SPF)。[0034]急性毒理試驗參照GB15193.3 Horn氏法操作，設(shè)劑量為1000 mg/kg、2150 mg/kg、4640 mg/kg> 10000 mg/kg,每組動物雌雄各5只，實驗前禁食16小時,經(jīng)口一次灌胃，每天稱重并觀察動物中毒及死亡情況。七天后結(jié)束實驗。本實驗在浙江中醫(yī)學院完成。
[0035]Ames試驗采用平板滲入法。用四株菌株的非代謝活化系統(tǒng)進行預(yù)試，結(jié)果在劑量為5000 μ g/皿時未出現(xiàn)增菌或抑菌現(xiàn)象。故正式試驗時選擇8、40、200、1000和5000 μ g/皿五個劑量組，稱取0.8 g加16毫升蒸餾水，121°C 20分鐘滅活即配成5000 yg/皿。以此為最高劑量，分別做5倍稀釋，配成1000 μ g/皿、200 μ g/皿、40 yg/皿、8 μ g/皿各劑量，備檢。同時設(shè)空白對照組和陽性對照組，每種菌株每個測試濃度設(shè)三皿平行，在加S9和不加S9條件下進行試驗。重復(fù)測試一次。觀察指標是直接計數(shù)培養(yǎng)基上各菌株的回變圃落數(shù)。本實驗在浙江省疾病預(yù)防控制中心完成。
[0036]選用60只雄性昆明種小白鼠隨機分成6組，每組10只，其中I組為正常對照組，另5組每天腹腔注射青霉素鈉(0.9 mg/g.bw) 一次，連續(xù)7天，隨機選I組為模型組，檢驗小鼠菌群失調(diào)情況(正常組和模型組此時測掉);隨機選取I組以樣品稀釋液灌胃，作為自然恢復(fù)組；其余3組以丁酸梭菌每天灌胃一次，劑量分別為IO5個/天(低劑量組)、IO6個/天(中劑量組)、IO7個/天(高劑量組)，灌胃5天。
[0037]給各組小鼠最后一次腹腔注射青霉素鈉或灌胃益生菌24小時后，稱重，將小鼠頸椎脫臼處死，無菌采取盲腸內(nèi)容物0.2克溶于10 mL稀釋液中，37°C水浴振蕩15分鐘，再依次10倍梯度稀釋，選擇合適的稀釋度，分別取50 μ I稀釋液滴加在各培養(yǎng)基上(每種菌每個稀釋度重復(fù)三塊平板)，測定糞便中腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌和擬桿菌的變化情況，結(jié)合革蘭氏染色、細胞顯微形態(tài)和菌落形態(tài)來進行菌種確定。
[0038]注:雞、豬的實驗中，未用青霉素鈉造菌群失調(diào)模型，直接用腹瀉病雞、病豬進行實驗，取糞便迅速檢測。
[0039]
表1動物實驗(對象:雞)的實驗結(jié)果(logCFU/g)
【權(quán)利要求】
1.高粘附性丁酸梭菌，其特征在于，該重組菌株是攜帶重組質(zhì)粒的丁酸梭菌，所述的重組質(zhì)粒是含乳桿菌粘附蛋白基因的枯草芽孢桿菌質(zhì)粒PHY300PLK。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳桿菌粘附蛋白基因，其特征是:該基因的核苷酸序列為SEQID No:2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的乳桿菌粘附蛋白基因編碼的粘附蛋白，其特征是:所述的蛋白的氨基酸序列為SEQ ID No:l。
4.一種利用基因工程技術(shù)制備高粘附性丁酸梭菌的方法，特征在于利用攜帶乳桿菌粘附蛋白基因編碼區(qū)的重組表達載體，采用轉(zhuǎn)基因方法在丁酸梭菌中表達乳桿菌粘附蛋白，從而提高丁酸梭菌的粘附能力，其步驟如下: (1)采用基因克隆的方法獲得乳桿菌粘附蛋白基因編碼區(qū)； (2)把乳桿菌粘附蛋白基因編碼區(qū)連于表達調(diào)控序列，形成重組表達載體； (3)將重組表達載體轉(zhuǎn)化至丁酸梭菌中； (4)篩選和鑒定丁酸梭菌轉(zhuǎn)化子； (5)培養(yǎng)丁酸梭菌陽性克隆，獲得基因重組后的丁酸梭菌。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高粘附性丁酸梭菌，其特征在于它導(dǎo)入了乳桿菌的粘附蛋白基因序列，可表達粘附蛋白，從而提聞了粘附能力，可大大提聞其在動物腸道中的定植能力。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高粘附性丁酸梭菌，對于抗生素引起的雞、豬腹瀉，有較強的治療作用，最佳使用量為1O6個/千克體重。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高粘附性丁酸梭菌，與殼聚糖、低聚寡糖(如低聚木糖、甘露寡糖等)等混合使用，效果更佳，最佳重量比例為1: 1！ 100: 1！ 100。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高粘附性丁酸梭菌，用于水產(chǎn)養(yǎng)殖或改善水質(zhì)，所用濃度為IO4個/毫升。
【文檔編號】C12N15/74GK103911337SQ201310007380
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2013年1月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月9日
【發(fā)明者】孔青, 遲晨, 管斌, 林洪 申請人:中國海洋大學