用于預(yù)測(cè)與抗血管發(fā)生療法有關(guān)的高血壓的風(fēng)險(xiǎn)的方法
【專利摘要】本發(fā)明關(guān)注一種通過測(cè)定KDR基因和/或EGF基因的基因型來預(yù)測(cè)患者形成與抗血管發(fā)生治療諸如貝伐單抗有關(guān)的高血壓的易感性的方法。本發(fā)明還涉及一種包含血管發(fā)生抑制劑諸如貝伐單抗的藥物組合物，其用于基于KDR基因和/或EGF的基因型來治療患有癌癥的患者。本發(fā)明還涉及一種通過測(cè)定KDR基因和/或EGF基因的基因型在患有癌癥的患者中降低與抗血管發(fā)生療法諸如貝伐單抗有關(guān)的高血壓的風(fēng)險(xiǎn)的方法。
【專利說明】用于預(yù)測(cè)與抗血管發(fā)生療法有關(guān)的高血壓的風(fēng)險(xiǎn)的方法
發(fā)明領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明針對(duì)預(yù)測(cè)經(jīng)歷抗血管發(fā)生療法(包括使用貝伐單抗的療法)的患者中的高血壓風(fēng)險(xiǎn)的方法。
[0002]發(fā)明背景
[0003]血管發(fā)生有助于良性和惡性疾病諸如癌癥形成，而且尤其在癌癥中，是原發(fā)性腫瘤生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移所必需的。為了生長(zhǎng)，腫瘤必須進(jìn)行血管發(fā)生轉(zhuǎn)換。需要血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)來誘導(dǎo)此血管發(fā)生轉(zhuǎn)換。VEGF和VEGF途徑中的基因被視為癌癥進(jìn)展的重要介導(dǎo)物。VEGF基因家族包括VEGF基因(亦稱為VEGFA)，VEGF的同源物，包括胎盤生長(zhǎng)因子(PlGF)、VEGFB、VEGFC、VEGFD，VEGF 受體，包括 VEGFR-1 和 VEGFR-2 (亦分別稱為 FLTl 和FLKI/KDR)，VEGF誘導(dǎo)物，包括缺氧可誘導(dǎo)因子HIFl a、HIF2 α，和氧傳感器PHD1、PHD2和PHD3。
[0004]此途徑在癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中的重要性導(dǎo)致開發(fā)出用于癌癥療法的抗血管發(fā)生劑。這些療法包括貝伐單抗(bevacizumab)、哌加他尼(pegaptanib)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)和瓦他拉尼(vatalanib)。盡管用血管發(fā)生抑制劑諸如貝伐單抗獲得顯著延長(zhǎng)的存活，但患者仍然死于癌癥。另外，并非所有患者都響應(yīng)血管發(fā)生抑制劑療法。不響應(yīng)性的根本機(jī)制仍然是未知的。而且，血管發(fā)生抑制劑療法與副作用諸如胃腸穿孔、血栓形成、 出血、高血壓和蛋白尿有關(guān)。 [0005]因此，需要確定哪些患者對(duì)血管發(fā)生抑制劑療法響應(yīng)得特別好和/或哪些患者對(duì)與抗血管發(fā)生治療有關(guān)的副作用易感的方法。
[0006]發(fā)明概述
[0007]本發(fā)明涉及一種通過測(cè)定KDR中多態(tài)性rs2305949 (SEQ ID N0.3)和/或EGF中rs4444903 (SEQ ID N0.4)處與降低的高血壓風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)的基因型來確定患者形成與通過血管發(fā)生抑制劑如貝伐單抗的療法有關(guān)的高血壓的易感性的方法。本發(fā)明還涉及包含血管發(fā)生抑制劑如貝伐單抗的藥物組合物，其用于治療患有癌癥且在多態(tài)性rs2305949(SEQ IDN0.3)和/或rs4444903 (SEQ ID N0.4)處具有與降低的高血壓風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)的基因型的患者。本發(fā)明還涉及一種通過檢測(cè)rs2305949(SEQ ID N0.3)和/或rs4444903 (SEQ ID N0.4)處與降低的高血壓風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)的基因型在患有癌癥的患者中降低與抗血管發(fā)生療法如貝伐單抗有關(guān)的高血壓風(fēng)險(xiǎn)的方法。
[0008]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供確定患者形成與包含血管發(fā)生抑制劑的療法有關(guān)的高血壓的易感性的方法，其中所述血管發(fā)生抑制劑包括貝伐單抗或與貝伐單抗結(jié)合VEGF上基本相同表位的抗體。所述方法包括:(a)在自患有癌癥的患者衍生的樣品中測(cè)定多態(tài)性rs2305949(SEQ ID N0.3)處的基因型，并(b)基于所述基因型鑒定患者為更多地易感于或更少地易感于形成與通過血管發(fā)生抑制劑的療法有關(guān)的高血壓，所述血管發(fā)生抑制劑包括貝伐單抗或與貝伐單抗結(jié)合VEGF上基本相同表位的抗體，其中多態(tài)性rs2305949 (SEQ IDN0.3)處CC基因型的存在指示所述患者比在多態(tài)性rs2305949(SEQ ID N0.3)處具有CT或TT基因型的患者更多地易感于形成高血壓，或者多態(tài)性rs2305949 (SEQ ID N0.3)處CT或TT基因型的存在指示所述患者比在多態(tài)性rs2305949(SEQ ID N0.3)處具有CC基因型的患者更少地易感于形成高血壓。在一些實(shí)施方案中，所述方法是體外方法。在一些實(shí)施方案中，所述療法還包括化療劑或化療方案。在一些實(shí)施方案中，所述血管發(fā)生抑制劑與選自下組的一種或多種藥劑一起施用:紫杉燒、干擾素α、5_氟尿喃唳、亞葉酸(Ieucovorin)、伊立替康(irinotecan)、吉西他濱(gemcitabine)-厄洛替尼(erlotinib)和基于鉬的化療劑。在一些實(shí)施方案中，所述癌癥是胰腺癌、腎細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌或肺癌。在一些實(shí)施方案中，所述樣品是血液樣品。在一些實(shí)施方案中，所述基因型通過MALD1-T0F質(zhì)譜術(shù)測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括對(duì)所述患者施用所述療法。
[0009]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供包含如本文中限定的血管發(fā)生抑制劑的藥物組合物，其用于治療有此需要的患者，其中依照本文中描述的方法已確定所述患者為更少地易感于形成與包含所述血管發(fā)生抑制劑的療法有關(guān)的高血壓。
[0010]本發(fā)明的一個(gè)別的實(shí)施方案提供用于實(shí)施本文所述方法的試劑盒。所述試劑盒包含能夠測(cè)定多態(tài)性rs2305949(SEQ ID N0.3)處基因型的寡核苷酸。
[0011]本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案提供降低形成與包含血管發(fā)生抑制劑的療法有關(guān)的高血壓風(fēng)險(xiǎn)的方法，其中所述血管發(fā)生抑制劑包括貝伐單抗或與貝伐單抗結(jié)合VEGF上基本相同表位的抗體。所述方法包括:(a)在自患有癌癥的患者衍生的樣品中測(cè)定多態(tài)性rs2305949(SEQ ID N0.3)處的基因型；
[0012](b)鑒定患者為更少地易感于形成與通過血管發(fā)生抑制劑的療法有關(guān)的高血壓，所述血管發(fā)生抑制劑包括貝伐單抗或與貝伐單抗結(jié)合VEGF上基本相同表位的抗體，其中多態(tài)性rs2305949(SEQ ID N0.3)處CT或TT基因型的存在指示所述患者比在多態(tài)性rs2305949(SEQ ID N0.3)處具有CC基因型的患者更少地易感于形成高血壓；并(c)對(duì)在多態(tài)性rs2305949(SEQ ID N0.3)處具有CT或TT基因型、依照(b)鑒定為更少地易感于形成高血壓的患者施用所述血管發(fā)生抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述療法還包括化療劑或化療方案。在一些實(shí)施方案中，所述血管發(fā)生抑制劑與選自下組的一種或多種藥劑一起施用:紫杉烷、干擾素α、5_氟尿嘧啶、亞葉酸、伊立替康、吉西他濱-厄洛替尼和基于鉬的化療劑。在一些實(shí)施方案中，所述癌癥是胰腺癌、腎細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌或肺癌。在一些實(shí)施方案中，所述樣品是血液樣品。在一些實(shí)施方案中，所述基因型通過MALD1-T0F質(zhì)譜術(shù)測(cè)定。
[0013]本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案提供治療患者的方法。所述方法包括對(duì)所述患者施用包含血管發(fā)生抑制劑的療法，所述血管發(fā)生抑制劑包括貝伐單抗或與貝伐單抗結(jié)合VEGF上基本相同表位的抗體，其中已測(cè)定所述患者在多態(tài)性rs2305949(SEQ ID N0.3)處的基因型為CT或TT。
[0014]本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案提供確定患者形成與包含血管發(fā)生抑制劑的療法有關(guān)的高血壓的易感性的方法，所述血管發(fā)生抑制劑包括貝伐單抗或與貝伐單抗結(jié)合VEGF上基本相同表位的抗體。所述 方法包括:(a)在自患有癌癥的患者衍生的樣品中測(cè)定多態(tài)性rs4444903 (SEQ ID N0.4)處的基因型，并(b)基于所述基因型鑒定患者為更多地易感于或更少地易感于形成與通過血管發(fā)生抑制劑的療法有關(guān)的高血壓，所述血管發(fā)生抑制劑包括貝伐單抗或與貝伐單抗結(jié)合VEGF上基本相同表位的抗體，其中多態(tài)性rs4444903 (SEQ IDN0.4)處GA基因型的存在指示所述患者比在多態(tài)性rs4444903(SEQ ID N0.4)處具有GG或AA基因型的患者更多地易感于形成高血壓，或者多態(tài)性rs4444903 (SEQ ID N0.4)處GG或AA基因型的存在指示所述患者比在多態(tài)性rs4444903(SEQ ID N0.4)處具有GA基因型的患者更少地易感于形成高血壓。在一些實(shí)施方案中，所述方法是體外方法。在一些實(shí)施方案中，所述療法還包括化療劑或化療方案。在一些實(shí)施方案中，所述血管發(fā)生抑制劑與選自下組的一種或多種藥劑一起施用:紫杉烷、干擾素α、5_氟尿嘧啶、亞葉酸、伊立替康、吉西他濱-厄洛替尼和基于鉬的化療劑。在一些實(shí)施方案中，所述癌癥是胰腺癌、腎細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌或肺癌。在一些實(shí)施方案中，所述樣品是血液樣品。在一些實(shí)施方案中，所述基因型通過MALD1-TOF質(zhì)譜術(shù)測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括對(duì)所述患者施用所述療法。
[0015]本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案提供包含如本文中限定的血管發(fā)生抑制劑的藥物組合物，其用于治療有此需要的患者，其中依照本文中描述的方法已確定所述患者為更少地易感于形成與通過所述血管發(fā)生抑制劑的療法有關(guān)的高血壓。
[0016]本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案提供用于實(shí)施本文所述方法的試劑盒。所述試劑盒包含能夠測(cè)定多態(tài)性rs4444903(SEQ ID N0.4)處基因型的寡核苷酸。
[0017]本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方案提供降低形成與包含血管發(fā)生抑制劑的療法有關(guān)的高血壓風(fēng)險(xiǎn)的方法，其中所述血管發(fā)生抑制劑包括貝伐單抗或與貝伐單抗結(jié)合VEGF上基本相同表位的抗體。所述方法包括:(a)在自患有癌癥的患者衍生的樣品中測(cè)定多態(tài)性rs4444903 (SEQ ID N0.4)處的基因型；(b)鑒定患者為更少地易感于形成與通過血管發(fā)生抑制劑的療法有關(guān)的高血壓，所述血管發(fā)生抑制劑包括貝伐單抗或與貝伐單抗結(jié)合VEGF上基本相同表位的抗體，其中多態(tài)性rs4444903(SEQ ID N0.4)處GG或AA基因型的存在指示所述患者比在多態(tài)性rs4444903(SEQ ID N0.4)處具有GA基因型的患者更少地易感于形成高血壓；并(c)對(duì)在多態(tài)性rs4444903(SEQ ID N0.4)處具有GG或AA基因型、依照(b)鑒定為更少地易感于形成高血壓的患者施用所述血管發(fā)生抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述療法還包含化療劑或化療方案。在一些實(shí)施方案中，所述血管發(fā)生抑制劑與選自下組的一種或多種藥劑一起施用:紫杉烷、干擾素α、5_氟尿嘧唆、亞葉酸、伊立替康、吉西他濱-厄洛替尼和基于鉬的化療劑。在一些實(shí)施方案中，所述癌癥是胰腺癌、腎細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌或肺癌。在一些實(shí)施方案中，所述樣品是血液樣品。在一些實(shí)施方案中，所述基因型通過MALD1-TOF質(zhì)譜術(shù)測(cè)定。
[0018]本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供治療患者的方法。所述方法包括對(duì)所述患者施用包含血管發(fā)生抑制劑的療法，所述血管發(fā)生抑制劑包括貝伐單抗或與貝伐單抗結(jié)合VEGF上基本相同表位的抗體，其中已測(cè)定所述患者在多態(tài)性rs4444903(SEQ ID N0.4)處的基因型為GG或AA。
[0019]附圖簡(jiǎn)述
[0020]圖1:臨床數(shù)據(jù)的終點(diǎn)分布。無進(jìn)展存活(PFS)的卡普蘭-邁耶(Kaplan-Meier)圖。
[0021]圖2:臨床數(shù)據(jù)的終點(diǎn)分布?？傮w存活(OS)的卡普蘭-邁耶圖。
[0022]圖3:臨床數(shù)據(jù)的終點(diǎn)分布。最佳總體響應(yīng)(BOR)的柱形圖。BOR比率在用BEV治療的受試者中為49% ,而在用PBO治療的受試者中為46%。
[0023]圖4:臨床數(shù)據(jù)的終點(diǎn)分布。與研究藥物并非無關(guān)的高血壓的柱形圖。高血壓比率在用BEV治療的受試者中為18%，而在用PBO治療的受試者中為7%。
[0024]圖5 =Leuven功效集合分析中VEGFA和PFS的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果。
[0025]圖6:在測(cè)試對(duì) PFS 的關(guān)聯(lián)性時(shí) VEGFA 中 rs699946 (SEQ ID N0.1)的 Forest 圖。
[0026]圖7:在用BEV治療的白種人受試者中rsl2505758 (SEQ ID N0.2)與OS關(guān)聯(lián)性的Forest 圖。
[0027]圖8:rsl2505758(SEQ ID N0.2)和OS之間關(guān)聯(lián)性的卡普蘭-邁耶圖。
[0028]圖9:rs2305949(SEQ ID N0.3) (KDR)相關(guān)高血壓頻率。
[0029]圖10:在用BEV治療的白種人受試者中對(duì)于高血壓，KDR中rs2305949 (SEQ IDN0.3)的 Forest 圖。
[0030]圖11:rs4444903(SEQ ID N0.4) (EGF)相關(guān)高血壓頻率。
[0031]圖 12:EGF 中 rs4444903 (SEQ ID N0.4)與 PGx-SP-BEV-白種人中高血壓的 Forest圖。
[0032]圖13:在用BEV治療的白種人受試者中rsl1133360 (SEQ ID N0.5)與PFS關(guān)聯(lián)性的 Forest 圖。
[0033]圖14:在元分 析中測(cè)定基因型且與貝伐單抗結(jié)果有關(guān)的SNP序列。SEQ ID N0.1對(duì)應(yīng)于rs699946，其中位置51是A或G。SEQ ID N0.2對(duì)應(yīng)于rsl2505758，其中位置51是C或T0 SEQ ID N0.3 對(duì)應(yīng)于 rs2305949，其中位置 51 是 C 或 T。SEQ ID N0.4 對(duì)應(yīng)于 rs4444903，其中位置51是A或G。SEQ ID N0.5對(duì)應(yīng)于rslll33360，其中位置51是C或T。
[0034]發(fā)明詳述
[0035]1.定義
[0036]術(shù)語“施用”意指對(duì)患者施用藥物組合物，如血管發(fā)生抑制劑。例如，根據(jù)所治療
的癌癥類型，2.5mg/kg體重至15mg/kg體重的貝伐單抗(Avastin?)可每周、每2周或每3周
施用。具體的劑量包括5mg/kg、7.5mg/kg、10mg/kg和15mg/kg。甚至更具體的劑量為5mg/kg每2周、10mg/kg每2周和15mg/kg每3周。
[0037]術(shù)語“血管發(fā)生抑制劑”在本發(fā)明的背景中指改變血管發(fā)生(例如形成血管的過程)的所有藥劑，并且包括抑制血管發(fā)生(包括但不限于腫瘤血管發(fā)生)的藥劑。在此背景中，抑制可指阻斷血管形成并停止或延遲血管的生長(zhǎng)。血管發(fā)生抑制劑的例子包括貝伐單抗(亦稱為Avasthr? )、哌加他尼、舒尼替尼、索拉非尼和瓦他拉尼。貝伐單抗是一種重組的人源化單克隆IgGl抗體，其在體外和體內(nèi)測(cè)定系統(tǒng)中結(jié)合并抑制人VEGFA的生物學(xué)活性。術(shù)語“貝伐單抗”涵蓋滿足在選自美國、歐洲和日本的國家或地區(qū)中獲得作為相同或生物相似產(chǎn)品的銷售授權(quán)必需的要求的所有相應(yīng)的抗VEGF抗體。在本發(fā)明的背景中，血管發(fā)生抑制劑包括一種與貝伐單抗結(jié)合VEGF上基本相同表位的抗體，更具體地結(jié)合與貝伐單抗結(jié)合VEGF上相同表位的抗體。當(dāng)兩種抗體識(shí)別相同或空間上重疊的表位時(shí)，抗體與參照抗體結(jié)合“基本相同的表位”。用于測(cè)定兩種抗體是否結(jié)合相同或空間上重疊的表位的最廣泛使用和快速的方法是競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法，其可以使用經(jīng)標(biāo)記的抗原或經(jīng)標(biāo)記的抗體以所有數(shù)目的不同形式配置。通常地，將抗原固定化在96孔板上，并使用放射性或酶標(biāo)記物來測(cè)量未標(biāo)記抗體阻斷經(jīng)標(biāo)記抗體的結(jié)合的能力。
[0038]術(shù)語“癌癥”指哺乳動(dòng)物中特征通常為細(xì)胞增殖不受調(diào)控的生理學(xué)疾患。癌癥的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病。此類癌癥的更具體例子包括鱗狀細(xì)胞癌、肺癌(包括小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺的腺癌和肺的鱗癌)、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃癌(包括胃腸癌)、胰腺癌(包括轉(zhuǎn)移性胰腺癌)、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌(liver c ancer)、膀胱癌、肝瘤(h印atoma)、乳腺癌(包括局部晚期的、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性的HER-2陰性乳腺癌)、結(jié)腸癌、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌(livercancer)、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)及各種類型的頭和頸癌、以及B細(xì)胞淋巴瘤(包括低級(jí)/濾泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴細(xì)胞性(SL) NHL、中級(jí)/濾泡性NHL、中級(jí)彌漫性NHL、高級(jí)成免疫細(xì)胞性NHL、高級(jí)成淋巴細(xì)胞性NHL、高級(jí)無裂性小細(xì)胞NHL、貯積病(bulky disease) NHL、套細(xì)胞淋巴瘤、AIDS相關(guān)淋巴瘤、和瓦爾登斯特倫氏(Waldenstrom)巨球蛋白血癥)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、急性成淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)、毛細(xì)胞性白血病、慢性成髓細(xì)胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病癥(PTLD)、以及與瘢疲病(phakomatoses)、水腫(如與腦瘤有關(guān)的)和梅格斯氏(Meigs)綜合征有關(guān)的異常血管增殖。
[0039]術(shù)語“化療劑”或“化療方案”包括可以提供抗癌治療效果，并且可以是化學(xué)藥劑或生物學(xué)藥劑，特別是能夠干擾癌或腫瘤細(xì)胞的化學(xué)藥劑或生物學(xué)藥劑的任何活性劑。具體的活性劑是那些充當(dāng)抗贅生物(化學(xué)毒性或化學(xué)抑制性)藥劑的，其抑制或阻止惡性細(xì)胞的形成、成熟或增殖?；焺┑睦影ㄍ榛瘎?alkylating agents)諸如氮芥類(nitrogen mustards)(例如，雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、環(huán)憐酸胺(cyclophosphamide)、異環(huán)憐酸胺(ifosfamide)、美法侖(melphalan)和苯丁酸氮芥(chlorambucil))、亞硝服類(nitrosoureas)(例如，卡莫司汀(carmustine) (BCNU)、洛莫司汀(1mustine) (CCNU)、和司莫司汀(semustine)(甲基-CCNU))、乙撐亞胺類(ethylenimines) / 甲基蜜胺類(methylamelamines)(例如，三乙撐蜜胺(thriethylenemelamine) (TEM)、三乙烯(triethylene)、硫代磷酰胺(thiophosphoramide)(塞替派(thiotepa))、六甲蜜胺(hexamethylmelamine) (HMM,六甲蜜胺(altretamine))、磺酸烷基酯類(alkyl sulfonates)(例如，白消安(busulfan))、和三嗪(triazines)(例如，達(dá)卡巴嗪(dacarbazine) (DTIC));抗代謝物諸如葉酸類似物(例如，甲氨蝶呤(methotrexate)、三甲曲沙(trimetrexate))、嘧唳類似物(例如，5-氟尿喃唳、卡培他濱、氟脫氧尿喃唳(fluorodeoxyuridine)、吉西他濱、阿糖胞苷(cytosine arabinoside) (AraC,阿糖胞苷)、5_ 氮胞苷(azacytidine)、2，2’ -二氟脫氧胞苷(2,2，-difluorodeoxycytidine)、和嘌呤類似物(例如,6-巰嘌呤、6_硫鳥嘌呤、硫唑嘌呤(azathioprine)、2’ -脫氧助間型霉素(deoxycoformycin)(噴司他丁(pentostatin))、紅羥基壬基腺嘌呤(erythrohydroxynonyladenine, EHNA)、憐酸氟達(dá)拉濱(fludarabine phosphate)、和 2_ 氯脫氧腺苷(克拉屈濱(cladribine), 2_CdA));白天然產(chǎn)物開發(fā)的抗有絲分裂藥物(例如，帕利他塞、長(zhǎng)春花生物堿類(vinca alkaloids)(例如，長(zhǎng)春堿(vinblastine, VLB)、長(zhǎng)春新堿(vincristine)、和長(zhǎng)春瑞濱(vinorelbine))、多西他賽(docetaxel)、雌莫司汀(estramustine)、和磷酸雌莫司汀)、表鬼白毒素類(epipodophy1toxins)(例如，依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide))、抗生素(例如，放線菌素(actimomycin)D、道諾霉素(daunomycin)(柔紅霉素(rubidomycin))、daunorubicon、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、伊達(dá)比星(idarubicin)、博來霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicamycin)(光神霉素(mithramycin))、絲裂霉素(mitomycin)C、放線菌素(actinomycin))、酶(例如，L-門冬酰胺酶)、和生物反應(yīng)修飾劑 (biological response modifier)(例如，干擾素-a、IL-2、G-CSF, GM-CSF);混雜的藥劑，包括鉬配位復(fù)合物(例如，順鉬、卡鉬、奧沙利鉬)、蒽二酮類(anthracenediones)(例如,米托蒽醌(mitoxantrone))、取代的脲(即，輕基脲(hydroxyurea))、甲基肼(methyIhydrazine)衍生物(例如，N-甲基肼(MIH)、丙卡巴肼(procarbazine))、腎上腺皮質(zhì)抑制劑(例如,米托坦(mitotane) (0，p’ -DDD)、氨魯米特(aminoglutethimide));激素和拮抗劑,包括腎上腺皮質(zhì)類固醇拮抗劑(例如，潑尼松(prednisone)和等同物，地塞米松(dexamethasone)、氨魯米特(aminoglutethimide))、黃體酮(progestin)(例如，己酸輕孕酮(hydroxyprogesterone caproate)、醋酸甲輕孕酮(medroxyprogesterone acetate)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate))、雌激素(例如，己烯雌酹(diethylstilbestrol)、乙炔基雌二醇(ethinyl estradiol)及其等同物)；抗雌激素(例如，他莫昔芬(tamoxifen))、雄激素(例如，丙酸睪酮(testosterone propionate) >氟甲睪酮(fluoxymesterone)及其等同物)、抗雄激素(例如，氟他胺(flutamide)、促性腺素釋放素類似物、亮丙瑞林(Ieuprolide))、非類固醇抗雄激素(例如，氟他胺)、表皮生長(zhǎng)因子抑制劑(例如厄洛替尼、拉帕替尼(Iapatinib)、吉非替尼(gefitinib))、抗體(例如曲妥單抗(trastuzumab))、伊立替康(irinotecan)和其他藥劑如亞葉酸。對(duì)于轉(zhuǎn)移性胰腺癌的治療，用于與貝伐單抗一起施用的化療劑包括吉西他濱和厄洛替尼及其組合(亦見本文中提供的例子)。對(duì)于腎細(xì)胞癌的治療，用于與貝伐單抗一起施用的化療劑包括干擾素α (亦見本文中提供的例子)。
[0040]術(shù)語“等位基因”指感興趣基因的核苷酸序列變體。
[0041]術(shù)語“基因型”指對(duì)個(gè)體或樣品中含有的基因的等位基因的描述。在本發(fā)明的背景中，在個(gè)體的基因 型和源自該個(gè)體的樣品的基因型之間沒有產(chǎn)生差異。盡管通常從二倍體細(xì)胞的樣品測(cè)定基因型，但也可從單倍體細(xì)胞如精子細(xì)胞的樣品測(cè)定基因型。
[0042]術(shù)語“寡核苷酸”和“多核苷酸”可交換使用，且指包含2個(gè)或更多個(gè)脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸(優(yōu)選超過3個(gè))的分子。它的確切大小將取決于許多因素，其相應(yīng)地取決于該寡核苷酸的最終功能或用途。寡核苷酸可合成或通過克隆得到。脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的嵌合體也可在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0043]術(shù)語“多態(tài)性”指群體內(nèi)存在基因的兩種或更多種遺傳測(cè)定的備選序列。通常而言，第一鑒定的等位形式被隨意稱為參照形式，而其他等位形式被稱為備選的或變異等位基因。在選定群體中最頻繁存在的等位形式有時(shí)稱為野生型形式。
[0044]術(shù)語“單核苷酸多態(tài)性”或“SNP”是在等位基因之間變化的一個(gè)核苷酸位點(diǎn)。單核苷酸多態(tài)性可發(fā)生在基因的任何區(qū)域。在一些情況中，所述多態(tài)性可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)序列中的變化。所述蛋白質(zhì)序列中的變化可能影響或不影響蛋白質(zhì)功能。
[0045]術(shù)語“高血壓(hypertension)” 指較高的血壓(high blood pressure)?！芭c治療/療法有關(guān)的高血壓”可測(cè)量為根據(jù)國家癌癥研究院的用于不良事件的常用術(shù)語標(biāo)準(zhǔn)(Common Terminology Criteria for Adverse Events) (CTCAE v2_3)的不同級(jí)別。如本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)領(lǐng)會(huì)，如果患者屬于與另一個(gè)亞組的患者相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的形成高血壓的可能性的患者亞組，那么該患者更多地易感于形成高血壓。類似地，如果患者屬于與另一個(gè)亞組的患者相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的不形成高血壓的可能性的患者亞組，那么該患者更少地易感于形成高血壓。
[0046]術(shù)語“患者”指期望治療的任何單個(gè)動(dòng)物，更具體地是哺乳動(dòng)物(包括非人動(dòng)物如例如犬、貓、馬、家兔、動(dòng)物園動(dòng)物、牛、豬、綿羊和非人靈長(zhǎng)類)。甚至更具體地，本文中所述患者是人。在本發(fā)明的背景中，所述患者可以是白種人受試者。
[0047]術(shù)語“受試者”在本文中是任何單個(gè)人受試者，包括適于接受治療的患者，他正經(jīng)受或者已經(jīng)經(jīng)受血管生成性病癥的一種或多種體征、癥狀、或其它指標(biāo)。意圖作為受試者包括的有參加臨床研究試驗(yàn)而沒有顯示出任何疾病臨床體征的任何受試者、或參加流行病學(xué)研究的受試者、或曾經(jīng)用作對(duì)照的受試者。受試者先前可能已用抗癌劑治療過，或沒有如此治療過。當(dāng)啟動(dòng)本文中治療時(shí)，受試者可能是初始接觸使用的另外的藥劑，即受試者先前可能沒有在“基線”處(即在本文治療方法中的第一劑抗癌物施用之前的設(shè)定時(shí)間點(diǎn)，如在開始治療之前的受試者篩選日)用例如抗贅生藥劑、化療劑、生長(zhǎng)抑制劑、細(xì)胞毒性劑治療過。這類“初始”受試者一般視為用此類另外的藥劑治療的候選。
[0048]術(shù)語“患有…的患者”指顯示關(guān)于特定惡性疾病如癌癥(一種牽涉生理學(xué)和病理學(xué)血管發(fā)生和/或腫瘤性疾病的疾病)的臨床體征的患者。
[0049]如本文中使用的，“療法”或“治療/處理”指試圖改變所治療個(gè)體或細(xì)胞的自然進(jìn)程的臨床干預(yù)，可以是為了預(yù)防或在臨床病理學(xué)的進(jìn)程中進(jìn)行。治療的期望效果包括預(yù)防疾病的發(fā)生或復(fù)發(fā)、緩解癥 狀、削弱疾病的任何直接或間接病理學(xué)后果、預(yù)防轉(zhuǎn)移、減緩疾病進(jìn)展的速率、改善或減輕疾病狀態(tài)、及免除或改善預(yù)后。
[0050]術(shù)語“總體存活”指治療期間和治療后患者存活的時(shí)間長(zhǎng)度。
[0051]術(shù)語“無進(jìn)展存活”指治療期間和治療后，依照治療內(nèi)科醫(yī)生或調(diào)查人員的評(píng)估，患者的疾病不變壞，即不進(jìn)展的時(shí)間長(zhǎng)度。
[0052]術(shù)語“藥物組合物”指其形式容許藥物的生物學(xué)活性是有效的，且不含對(duì)會(huì)施用該配制劑的受試者產(chǎn)生不可接受的毒性的別的成分的無菌制備物。
[0053]2.詳細(xì)的實(shí)施方案
[0054]在本發(fā)明中，令人驚訝地鑒定出KDR和EGF基因中的變異為對(duì)于形成與通過血管發(fā)生抑制劑治療有關(guān)的高血壓的易感性的標(biāo)志物/預(yù)測(cè)物。術(shù)語“標(biāo)志物”和“預(yù)測(cè)物”可交換使用，并且指基因的特定等位基因變體。所述變異或標(biāo)志物還可稱為單核苷酸多態(tài)性(SNP)。
[0055]依照本發(fā)明的方法，使用源自5項(xiàng)使用貝伐單抗的II期和III期試驗(yàn)的樣品來進(jìn)行對(duì)SNP的元分析，所述試驗(yàn)即N016966(晚期原發(fā)性結(jié)直腸癌，參見 Saltz et al., 2008, J.Clin.0ncol.26:2013-2019 和 Hurwitz et al., 2004, N.Engl.J.Med.350:2335-2342)、AVITA(胰腺癌，參見 Van Cutsem, J.Clin.0ncol.200927:2231-2237)、AVAiL(非小細(xì)胞肺癌，參見 Reck et al., J.Clin.0ncol.200927:1227)、AVOREN(腎癌，參見 Escudier et al.，J.Clin.0ncol.201028:2144)和 AVADO(乳腺癌，參見 Miles, J.Clin.0ncol.201028:3239)。
[0056]如實(shí)施例中顯示的，10種SNP與貝伐單抗誘導(dǎo)的高血壓有關(guān)(p〈0.05)，但其中沒有一種超過多重檢驗(yàn)的閾值(p〈0.0003)。顯示最強(qiáng)烈關(guān)聯(lián)性(p〈0.01)的兩種SNP為:KDR 中的 rs2305949(SEQ ID N0.3)(等位 0R0.93，95 % C10.88-0.98，p = 0.0067)和EGF 中的 rs4444903(SEQ ID N0.4)(等位 0R1.06，95% CIl.02-1.11，p = 0.0052)。對(duì)于rs2305949(SEQ ID N0.3) (KDR)，CC攜帶者(野生型)在用BEV治療時(shí)顯示更高的形成高血壓的頻率，而用安慰劑治療的患者確實(shí)顯示相當(dāng)對(duì)立的結(jié)果，其在攜帶TT的患者中顯示最高的高血壓頻率。對(duì)于rs4444903 (SEQ ID N0.4) (EGF)，雜合子GA攜帶者顯示最高的高血壓頻率，一種在用安慰劑治療的患者中未看到的效應(yīng)，因?yàn)樵诓煌蛐椭g沒有看到差異。有意思的是，rs2305949(SEQ ID N0.3)和 rs4444903 (SEQ ID N0.4)與發(fā)生在 KDR和EGF位置273和708上的氨基酸變化緊密相關(guān)，表明這些變化可能功能性地影響兩種基因并由此作用于高血壓。
[0057]因此，本發(fā)明提供一種測(cè)定患者形成與通過血管發(fā)生抑制劑的療法有關(guān)的高血壓的易感性的體外方法，其中所述血管發(fā)生抑制劑包括貝伐單抗或與貝伐單抗結(jié)合VEGF上基本相同表位的抗體，所述方法包括:
[0058](a)在自患有癌癥的患者衍生的樣品中測(cè)定多態(tài)性rs2305949 (SEQ ID N0.3)處的基因型，并
[0059](b)基于所述基因型鑒定患者為更多地易感于或更少地易感于形成與通過血管發(fā)生抑制劑的療法有關(guān)的高血壓，所述血管發(fā)生抑制劑包括貝伐單抗或與貝伐單抗結(jié)合VEGF上基本相同表位的抗體，其中多態(tài)性rs2305949(SEQ ID N0.3)處CC基因型的存在指示所述患者比在多態(tài)性rs2305949(SEQ ID N0.3)處具有CT或TT基因型的患者更多地易感于形成高血壓，或者多態(tài)性rs2305949(SEQ ID N0.3)處CT或TT基因型的存在指示所述患者比在多態(tài)性rs2305949(SEQ ID N0.3)處具有CC基因型的患者更少地易感于形成高血壓。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥選自下組:結(jié)直腸癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、腎癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌和肺癌，更具體地結(jié)直腸癌、腎癌、乳腺癌、胰腺癌和肺癌，甚至更具體地結(jié)直腸癌、腎癌和肺癌。
[0060]本發(fā)明進(jìn)一步提供包含血管發(fā)生抑制劑的藥物組合物用于治療有此需要的患者，所述血管發(fā)生抑制劑包括貝伐單抗或與貝伐單抗結(jié)合VEGF上基本相同表位的抗體，其中依照一種體外方法已確定所述患者為更少地易感于形成與通過所述血管發(fā)生抑制劑的療法有關(guān)的高血壓，所述體外方法包括:
[0061](a)在自患有癌癥的患者衍生的樣品中測(cè)定多態(tài)性rs2305949(SEQ ID N0.3)處的基因型，并
[0062](b)基于所述基因型鑒定患者為更多地易感于或更少地易感于形成與通過血管發(fā)生抑制劑的療法有關(guān)的高血壓，所述血管發(fā)生抑制劑包括貝伐單抗或與貝伐單抗結(jié)合VEGF上基本相同表位的抗體，其中多態(tài)性rs2305949(SEQ ID N0.3)處CC基因型的存在指示所述患者比多態(tài)性rs2305949(SEQ ID N0.3)處具有CT或TT基因型的患者更多地易感于形成高血壓，或者多態(tài)性rs2305949(SEQ ID N0.3)處CT或TT基因型的存在指示所述患者比在多態(tài)性rs2305949(SEQ ID N0.3)處具有CC基因型的患者更少地易感于形成高血壓。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥選自下組:結(jié)直腸癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、腎癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌和肺癌，更具體地結(jié)直腸癌、腎癌、乳腺癌、胰腺癌和肺癌，甚至更具體地結(jié)直腸癌、腎癌和肺癌。
[0063]本發(fā)明進(jìn)一步提供一種降低形成與通過血管發(fā)生抑制劑的療法有關(guān)的高血壓風(fēng)險(xiǎn)的方法，其中所述血管發(fā)生抑制劑包括貝伐單抗或與貝伐單抗結(jié)合VEGF上基本相同表位的抗體，所述方法包括:[0064](a)在自患有癌癥的患者衍生的樣品中測(cè)定多態(tài)性rs2305949 (SEQ ID N0.3)處的
基因型；
[0065](b)鑒定患者為更少地易感于形成與通過血管發(fā)生抑制劑的療法有關(guān)的高血壓，所述血管發(fā)生抑制劑包括貝伐單抗或與貝伐單抗結(jié)合VEGF上基本相同表位的抗體，其中多態(tài)性rs2305949(SEQ ID N0.3)處CT或TT基因型的存在指示所述患者比在多態(tài)性rs2305949(SEQ ID N0.3)處具有CC基因型的患者更少地易感于形成高血壓；并
[0066](c)對(duì)在多態(tài)性rs2305949 (SEQ ID N0.3)處具有CT或TT基因型、依照(b)鑒定為更少地易感于形成高血壓的患者施用所述血管發(fā)生抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥選自下組:結(jié)直腸癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、腎癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌和肺癌，更具體地結(jié)直腸癌、腎癌、乳腺癌、胰腺癌和肺癌，甚至更具體地結(jié)直腸癌、腎癌和肺癌。
[0067]本發(fā)明還提供測(cè)定患者形成與通過血管發(fā)生抑制劑的療法有關(guān)的高血壓的易感性的一種體外方法，其中所述血管發(fā)生抑制劑包括貝伐單抗或與貝伐單抗結(jié)合VEGF上基本相同表位的抗體，所述方法包括:
[0068](a)在自患有癌癥的患者衍生的樣品中測(cè)定多態(tài)性rs4444903 (SEQ ID N0.4)處的基因型，并
[0069](b)基于所述基因型鑒定患者為更多地易感于或更少地易感于形成與通過血管發(fā)生抑制劑的療法有關(guān)的高血壓，所述血管發(fā)生抑制劑包括貝伐單抗或與貝伐單抗結(jié)合VEGF上基本相同表位的抗體，其中多態(tài)性rs4444903(SEQ ID N0.4)處GA基因型的存在指示所述患者比在多態(tài)性rs4444903(SEQ ID N0.4)處具有GG或AA基因型的患者更多地易感于形成高血壓，或者多態(tài)性rs 4444903(SEQ ID N0.4)處GG或AA基因型的存在指示所述患者比在多態(tài)性rs4444903(SEQ ID N0.4)處具有GA基因型的患者更少地易感于形成高血壓。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥選自下組:結(jié)直腸癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、腎癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌和肺癌，更具體地結(jié)直腸癌、腎癌、乳腺癌、胰腺癌和肺癌，甚至更具體地結(jié)直腸癌、腎癌和乳腺癌。
[0070]本發(fā)明進(jìn)一步提供包含血管發(fā)生抑制劑的藥物組合物用于治療有此需要的患者，所述血管發(fā)生抑制劑包括貝伐單抗或與貝伐單抗結(jié)合VEGF上基本相同表位的抗體，其中通過一種體外方法已確定所述患者為更少地易感于形成與通過所述血管發(fā)生抑制劑的療法有關(guān)的高血壓，所述體外方法包括:
[0071](a)在自患有癌癥的患者衍生的樣品中測(cè)定多態(tài)性rs4444903 (SEQ ID N0.4)處的基因型，并
[0072](b)基于所述基因型鑒定患者為更多地易感于或更少地易感于形成與通過血管發(fā)生抑制劑的療法有關(guān)的高血壓，所述血管發(fā)生抑制劑包括貝伐單抗或與貝伐單抗結(jié)合VEGF上基本相同表位的抗體，其中多態(tài)性rs4444903(SEQ ID N0.4)處GA基因型的存在指示所述患者比在多態(tài)性rs4444903(SEQ ID N0.4)處具有GG或AA基因型的患者更多地易感于形成高血壓，或者多態(tài)性rs4444903(SEQ ID N0.4)處GG或AA基因型的存在指示所述患者比在多態(tài)性rs4444903(SEQ ID N0.4)處具有GA基因型的患者更少地易感于形成高血壓。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥選自下組:結(jié)直腸癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、腎癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌和肺癌，更具體地結(jié)直腸癌、腎癌、乳腺癌、胰腺癌和肺癌，甚至更具體地結(jié)直腸癌、腎癌和乳腺癌。[0073]本發(fā)明進(jìn)一步提供一種降低形成與通過血管發(fā)生抑制劑的療法有關(guān)的高血壓的風(fēng)險(xiǎn)的方法，其中所述血管發(fā)生抑制劑包括貝伐單抗或與貝伐單抗結(jié)合VEGF上基本相同表位的抗體，所述方法包括:
[0074](a)在自患有癌癥的患者衍生的樣品中測(cè)定多態(tài)性rs4444903 (SEQ ID N0.4)處的基因型；
[0075](b)鑒定患者為更少地易感于形成與通過血管發(fā)生抑制劑的療法有關(guān)的高血壓，所述血管發(fā)生抑制劑包括貝伐單抗或與貝伐單抗結(jié)合VEGF上基本相同表位的抗體，其中多態(tài)性rs4444903(SEQ ID N0.4)處GG或AA基因型的存在指示所述患者比在多態(tài)性rs4444903 (SEQ ID N0.4)處具有GA基因型的患者更少地易感于形成高血壓；并
[0076](c)對(duì)在多態(tài)性rs4444903 (SEQ ID N0.4)處具有GG或AA基因型、依照(b)鑒定為更少地易感于形成高血壓的患者施用所述血管發(fā)生抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥選自下組:結(jié)直腸癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、腎癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、胃癌和肺癌，更具體地，結(jié)直腸癌、腎癌、乳腺癌、胰腺癌和肺癌，甚至更具體地，結(jié)直腸癌、腎癌和肺癌。
[0077]在一個(gè)實(shí)施方案中，血管發(fā)生抑制劑作為共治療物與化療劑或化療方案一起施用。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，血管發(fā)生抑制劑與一種或多種選自下組的藥劑一起施用:紫杉燒如多西他賽(docetaxel)和帕利他賽(paclitaxel)、干擾素α、5_氟尿嘧唳、亞葉酸、伊利替康、吉西他濱-厄洛替尼和基于鉬的化療劑如卡鉬、順鉬和奧沙利鉬。另外，血管發(fā)生抑制劑可作為共治療物與放療一起施用。
[0078]在本發(fā)明的背景中，所述樣品是生物學(xué)樣品且可以是血液和/或組織樣品。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述樣品是血液樣品，更具體地是外周血樣品。在本發(fā)明的背景中，所述樣品是DNA樣品。所述DNA樣 品可以是種系DNA或體細(xì)胞DNA，更具體地是種系DNA。
[0079]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基因型通過MALD1-T0F質(zhì)譜術(shù)測(cè)定。除了下文對(duì)SNP檢測(cè)的詳細(xì)描述以外，以下參考文獻(xiàn)提供了對(duì)基于MALD1-T0F質(zhì)譜的SNP基因型分型的指導(dǎo)，例如 Storm et al., Methods Mol.Biol.212:241-62，2003。
[0080]3.核酸多態(tài)性的檢測(cè)
[0081]用于評(píng)估核酸中SNP存在的檢測(cè)技術(shù)牽涉分子遺傳學(xué)領(lǐng)域公知的規(guī)程。許多但并非所有方法牽涉核酸的擴(kuò)增。本領(lǐng)域中提供了實(shí)施擴(kuò)增的大量指導(dǎo)。例示性參考包括手冊(cè)如 PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification (Η.A.Erlich 編，F(xiàn)reeman Press, NY, N.Y., 1992) ；PCR Protocols:A Guide to Methods andApplications(Innis et al.,編,Academic Press,San Diego, Calif., 1990) ；CurrentProtocols in Molecular Biology, Ausubel, 1994-1999,包括補(bǔ)充更新至 2004 年 4 月；Sambrook&Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd Ed, 2001) ? 用于檢測(cè)單核昔酸多態(tài)性的一般方法披露于Single Nucleotide Polymorphisms:Methods andProtocols, Pu1-Yan Kwok 編,2003, Humana Press。
[0082]盡管所述方法通常采用PCR步驟，但也可以使用其他擴(kuò)增方案。合適的擴(kuò)增方法包括連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(參見例如Wu&Wallace，Genomics4:560-569, 1988);鏈置換測(cè)定法(參見例如 Walker et al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA89:392-396，1992 ;美國專利N0.5,455, 166);和數(shù)種基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)，包括記載于美國專利N0.5，437，990 ；5，409，818 ;和 5，399，491 的方法；轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增系統(tǒng)(TAS) (Kwoh et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:1173-1177, 1989);和自身持續(xù)(self-sustained)的序列復(fù)制(3SR) (Guatelliet al.，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87:1874-1878, 1990 ;W092/08800)?；蛘?，可使用將探針擴(kuò)增至可檢測(cè)水平的方法，如QP復(fù)制酶擴(kuò)增(Kramer&Lizardi, Nature339:401-402, 1989 ；LomeIi et al., Clin.Chem.35:1826-1831, 1989) ? 提供對(duì)已知擴(kuò)增方法的綜述，例如Abramson 和 Myers 于 Current Opinion in Biotechnology4:41_47, 1993。
[0083]可使用寡核苷酸引物和/或探針來實(shí)施對(duì)個(gè)體基因型、單體型、SNP、微衛(wèi)星或其他多態(tài)性的檢測(cè)。寡核苷酸可通過任何合適的方法制備，通常是化學(xué)合成。寡核苷酸可使用商品化的試劑和儀器合成?；蛘撸山?jīng)由商業(yè)性來源購買它們。合成寡核苷酸的方法是本領(lǐng)域中公知的(參見例如 Narang et al., Meth.Enzymol.68:90-99, 1979 ；Brown et al., Meth.Enzymol.68:109-151, 1979 ；Beaucage et al., Tetrahedron Lett.22:1859-1862，1981 ;和美國專利N0.4，458，066的固體支持物方法)。另外，可利用對(duì)上述合成方法的改良來期望性地影響關(guān)于合成的寡核苷酸的酶行為。例如，可利用將經(jīng)修飾的磷酸二酯連接(例如硫代磷酸、甲基膦酸酯、氨基磷酸酯或硼烷磷酸酯(boranophosphate))或除亞磷酸衍生物以外的連接摻入寡核苷酸中來防止在選定位點(diǎn)處的切割。另外，當(dāng)與也是用于合成新核酸鏈的模板的核酸雜交時(shí)，2’ -氨基經(jīng)修飾的糖的使用傾向于利于對(duì)寡核苷酸消化的置換。
[0084]可使用本領(lǐng)域公知的許多檢測(cè)方法來測(cè)定個(gè)體的基因型。大多數(shù)測(cè)定法需要數(shù)種一般性方案之一:使用等位基因特異性寡核苷酸的雜交、引物延伸、等位基因特異性連接、測(cè)序或電泳分離技術(shù)，例如單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)和異雙鏈體分析。例示性的測(cè)定法包括5’ -核酸酶測(cè)定法、模板指導(dǎo)的染料-終止子摻入、分子信標(biāo)等位基因特異性寡核苷酸測(cè)定、單堿基延伸測(cè)定、和通過實(shí)時(shí)焦磷酸序列的SNP打分。對(duì)擴(kuò)增序列的分析可使用各種技術(shù)進(jìn)行，如微芯片、熒光偏振測(cè)定法和MALD1-T0F(基質(zhì)輔助激光解吸離子化-飛行時(shí)間)質(zhì)譜。還可使用的兩種方法是基于使用Flap核酸酶的侵入性切割的測(cè)定法和采用掛鎖(padlock)探針的方法學(xué)。
[0085]對(duì)特定等位基因的存在或不存在的確定一般通過分析從要分析的個(gè)體獲得的核酸樣品來進(jìn)行。所述核酸樣品經(jīng)常包含基因組DNA。所述基因組DNA通常從血液樣品獲得，但也可從其他細(xì)胞或組織獲得。
[0086]還可能對(duì)RNA樣品分析多態(tài)性等位基因的存在。例如，mRNA可用于測(cè)定一個(gè)或多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)處個(gè)體的基因型。在此情況中，核酸樣品從其中表達(dá)靶核酸的細(xì)胞如脂肪細(xì)胞獲得。這類分析可通過以下進(jìn)行:首先逆轉(zhuǎn)錄靶RNA(使用例如病毒逆轉(zhuǎn)錄酶)，然后擴(kuò)增所得cDNA ;或使用組合的高溫逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)，如記載于美國專利N0.5，310，652 ;5，322，770 ;5，561，058 ;5，641，864 ;和 5，693，517 的。
[0087]簡(jiǎn)短描述了用于分析核酸樣品以檢測(cè)SNP的經(jīng)常使用的方法學(xué)。然而，可在本發(fā)明中使用本領(lǐng)域中已知的任何方法來檢測(cè)單核苷酸取代的存在。
[0088]a.等位基因特異性雜交
[0089]此技術(shù)(亦普遍稱為等位基因特異性寡核苷酸雜交(ASO))(例如Stonekinget al.，Am.J.Hum.Genet.48: 70-382，1991 ；Saiki et al.，Nature324, 163-166，1986 ；EP235, 726 ;和W089/11548)依賴于在僅有一個(gè)堿基不同的兩種DNA分子之間進(jìn)行區(qū)分，其通過將特異于變體之一的寡核苷酸探針與從擴(kuò)增核酸樣品獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物雜交。該方法通常采用短寡核苷酸，例如長(zhǎng)度為15-20個(gè)堿基。探針設(shè)計(jì)為對(duì)一種變體相對(duì)于另一種變體差異性雜交。設(shè)計(jì)這類探針的原理和指導(dǎo)是本領(lǐng)域中可獲的，例如在本文所引用的參考文獻(xiàn)中。雜交條件應(yīng)當(dāng)足夠嚴(yán)格從而在等位基因之間雜交強(qiáng)度有顯著差異，并產(chǎn)生基本二元性響應(yīng)，由此探針僅與一種等位基因雜交。一些探針設(shè)計(jì)為與靶DNA的區(qū)段雜交，從而多態(tài)性位點(diǎn)與探針的中心位置(例如在15個(gè)堿基的寡核苷酸中在位置7 ;在16個(gè)堿基的寡核苷酸中在位置8或9)聯(lián)配，但該設(shè)計(jì)不是必需的。
[0090]通過測(cè)量與樣品雜交的等位基因特異性寡核苷酸的量來測(cè)定等位基因的量和/或存在。典型地，將寡核苷酸用標(biāo)記物如熒光標(biāo)記物標(biāo)記。例如，將等位基因特異性寡核苷酸應(yīng)用于固定化的代表SNP序列的寡核苷酸。在嚴(yán)格的雜交和清洗條件后，對(duì)每種SNP寡核苷酸測(cè)量突光強(qiáng)度。
[0091]在一個(gè)實(shí)施方案中，鑒定在多態(tài)性位點(diǎn)處存在的核苷酸，其通過在序列特異性雜交條件下使用與涵蓋多態(tài)性位點(diǎn)的區(qū)域中的多態(tài)性等位基因之一準(zhǔn)確互補(bǔ)的寡核苷酸探針或引物的雜交。所述探針或引物雜交序列和序列特異性雜交條件選定為使得多態(tài)性位點(diǎn)處的單個(gè)錯(cuò)誤匹配將雜交雙鏈體充分去穩(wěn)定從而不能有效形成雙鏈體。如此，在序列特異性雜交條件下，穩(wěn)定的雙鏈體將僅在探針或引物與準(zhǔn)確互補(bǔ)的等位基因序列之間形成。如此，長(zhǎng)度為約10至約35個(gè)核苷酸(通常長(zhǎng)度為約15至約35個(gè)核苷酸)、與涵蓋多態(tài)性位點(diǎn)的區(qū)域中的等位基因序列準(zhǔn)確互補(bǔ)的寡核苷酸在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0092]在一個(gè)備選的實(shí)施方案中，鑒定在多態(tài)性位點(diǎn)處存在的核苷酸，其通過在足夠嚴(yán)格的雜交條件下使用與涵蓋多態(tài)性位點(diǎn)的區(qū)域中的SNP等位基因之一基本互補(bǔ)且與多態(tài)性位點(diǎn)處的等位基因準(zhǔn)確互補(bǔ)的寡核苷酸的雜交。由于存在于非多態(tài)性位點(diǎn)處的錯(cuò)誤匹配是對(duì)兩種等位基因序列的錯(cuò)誤匹配，與靶等位基因序列形成的雙鏈體中和與相應(yīng)的非靶等位基因序列形成的雙鏈體中錯(cuò)誤匹配數(shù)的差異與使用對(duì)靶等位基因序列準(zhǔn)確互補(bǔ)的寡核苷酸時(shí)相同。在該實(shí) 施方案中，雜交條件足夠松以允許與靶序列形成穩(wěn)定的雙鏈體，并維持足夠的嚴(yán)格性以排除與非靶序列形成穩(wěn)定雙鏈體。在這類充分嚴(yán)格的雜交條件下，穩(wěn)定的雙鏈體將僅在探針或引物與靶等位基因之間形成。如此，長(zhǎng)度為約10至約35個(gè)核苷酸(長(zhǎng)度通常為約15至約35個(gè)核苷酸)、與涵蓋多態(tài)性位點(diǎn)的區(qū)域中的等位基因序列基本互補(bǔ)且與多態(tài)性位點(diǎn)處的等位基因序列準(zhǔn)確互補(bǔ)的寡核苷酸在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0093]可能期望在其中限制雜交條件優(yōu)化的測(cè)定形式中使用基本而非準(zhǔn)確互補(bǔ)的寡核苷酸。例如，在典型的多靶物固定化的寡核苷酸測(cè)定形式中，每種靶物的探針或引物固定化于單個(gè)固體支持物上。通過使固體支持物與含有靶DNA的溶液接觸來同時(shí)實(shí)施雜交。由于所有雜交均在等同條件下進(jìn)行，因此雜交條件不能針對(duì)每種探針或引物分別優(yōu)化。當(dāng)測(cè)定形式排除調(diào)整雜交條件時(shí)，可利用錯(cuò)誤匹配到探針或引物中的摻入來調(diào)整雙鏈體穩(wěn)定性。引入的特定錯(cuò)誤匹配對(duì)雙鏈體穩(wěn)定性的影響是公知的，且雙鏈體穩(wěn)定性可常規(guī)地估測(cè)和經(jīng)驗(yàn)性測(cè)定，如上文描述的。可使用本文中提供和本領(lǐng)域中公知的指導(dǎo)來經(jīng)驗(yàn)性選擇依賴于探針或引物的確切大小和序列的適宜雜交條件。使用寡核苷酸探針或引物來檢測(cè)序列中的單堿基對(duì)差異記載于例如 Conner et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA80:278-282 以及美國專利N0.5，468，613和5，604, 099，其各自通過提述并入本文。
[0094]完美匹配的和單堿基錯(cuò)配的雜交雙鏈體之間穩(wěn)定性的成比例變化依賴于雜交的寡核苷酸的長(zhǎng)度。與更短的探針序列形成的雙鏈體由錯(cuò)誤匹配的存在成比例更多地去穩(wěn)定。長(zhǎng)度為約15至約35個(gè)核苷酸之間的寡核苷酸經(jīng)常用于序列特異性檢測(cè)。此外，由于雜交的寡核苷酸端經(jīng)歷連續(xù)的隨機(jī)解離和再退火(由于熱能量)，在任一端的錯(cuò)誤匹配比存在于內(nèi)部的錯(cuò)誤匹配使雜交雙鏈體更少地去穩(wěn)定。為了區(qū)分靶序列中的單堿基對(duì)變化，選擇與靶序列雜交的探針序列從而多態(tài)性位點(diǎn)存在于探針的內(nèi)部區(qū)域。
[0095]上文用于選擇與特定等位基因雜交的探針序列的標(biāo)準(zhǔn)適用于探針雜交區(qū)域，即涉及與靶序列雜交的探針部分。探針可結(jié)合額外的核酸序列，如用于固定化探針的聚T尾部，而不顯著改變探針的雜交特征。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)可對(duì)于在所述方法中的使用，結(jié)合額外的核酸序列、與靶序列不互補(bǔ)如此不涉及雜交的探針基本與不結(jié)合的探針等同。
[0096]用于檢測(cè)探針和樣品中靶核酸序列之間形成的雜合體的合適的測(cè)定形式是本領(lǐng)域中已知的且包括固定化的靶物(點(diǎn)印跡)形式和固定化的探針(反向點(diǎn)印跡或線印跡)測(cè)定形式。點(diǎn)印跡和反向點(diǎn)印跡測(cè)定形式記載于美國專利N0.5，310，893 ;5，451，512 ；5，468，613 ;和5，604，099 ;其各自通過提述并入本文。
[0097]在點(diǎn)印跡形式中，擴(kuò)增的靶DNA固定化于固體支持物如尼龍膜上。將膜-靶物復(fù)合物與經(jīng)標(biāo)記的探針在適宜的雜交條件下溫育，未雜交的探針通過在適宜嚴(yán)格條件下清洗除去，并對(duì)膜監(jiān)測(cè)結(jié)合的探針的存在。
[0098]在反向點(diǎn)印跡(或線印跡)形式中，探針固定化于固體支持物如尼龍膜或微滴定板上。靶DNA是經(jīng)標(biāo)記的，通常在擴(kuò)增期間通過摻入經(jīng)標(biāo)記的引物。可標(biāo)記引物之一或兩者。將膜-探針復(fù)合物與經(jīng)標(biāo)記的擴(kuò)增后靶DNA在適宜的雜交條件下溫育，通過在適宜的嚴(yán)格條件下清洗除去未雜交的靶DNA，并監(jiān)測(cè)膜上結(jié)合的靶DNA的存在。反向線印跡檢測(cè)測(cè)定法記載于實(shí)施例。
[0099]特異于多態(tài)性變體之一的等位基因特異性探針經(jīng)常連同針對(duì)其他多態(tài)性變體的等位基因特異性探針一起使用。在一些實(shí)施方案中，探針固定化于固體支持物上且同時(shí)使用兩種探針來分析個(gè)體中的靶序列。核酸陣列的例子由W095/11995描述。同一陣列或不同陣列可用于分析表征的多態(tài)性。W095/11995還描述了針對(duì)預(yù)表征的多態(tài)性變體形式的檢測(cè)優(yōu)化過的子陣列。這類子陣列可用于檢測(cè)本文中描述的多態(tài)性的存在。
[0100]b.等位基因特異性引物
[0101]多態(tài)性還普遍使用等位基因特異性擴(kuò)增或引物延伸方法檢測(cè)。這些反應(yīng)通常牽涉設(shè)計(jì)為特異性靶向多態(tài)性的引物的使用，所述靶向經(jīng)由引物3’端的錯(cuò)配。錯(cuò)配的存在影響聚合酶在缺少錯(cuò)誤校正活性時(shí)延伸引物的能力。例如，要使用基于等位基因特異性擴(kuò)增或延伸的方法來檢測(cè)等位基因序列，與多態(tài)性的一種等位基因互補(bǔ)的引物設(shè)計(jì)為使得3’末端核苷酸在多態(tài)性位置處雜交。特定等位基因的存在可由引物啟動(dòng)延伸的能力確定。如果3’末端錯(cuò)誤匹配，那么延伸受到阻礙。
[0102]在一些實(shí)施方案中，在擴(kuò)增反應(yīng)中引物連同第二引物一起使用。第二引物在與多態(tài)性位置不相關(guān)的位點(diǎn)雜交。擴(kuò)增從兩條引物前進(jìn)產(chǎn)生可檢測(cè)產(chǎn)物，表示存在特定的等位形式?；诘任换蛱禺愋詳U(kuò)增或延伸的方法記載于例如W093/22456 ;美國專利N0.5，137，806 ;5，595，890 ;5，639，611 ;和美國專利 N0.4，851，331。
[0103]使用基于等位基因特異性擴(kuò)增的基因型分型，對(duì)等位基因的鑒定僅需要檢測(cè)擴(kuò)增的靶序列的存在或不存在。用于檢測(cè)擴(kuò)增后靶序列的方法是本領(lǐng)域中公知的。例如，描述的凝膠電泳和探針雜交測(cè)定經(jīng)常用于檢測(cè)核酸的存在。
[0104] 在一個(gè)備選的探針較少(probe-less)的方法中，通過監(jiān)測(cè)反應(yīng)混合物中雙鏈DNA總量的增加來檢測(cè)擴(kuò)增的核酸，其記載于例如美國專利N0.5，994，056 ;和歐洲專利公開文本N0.487，218和512，334。雙鏈靶DNA的檢測(cè)依賴于增加的熒光，其由各種結(jié)合DNA的染料例如SYBR Green在結(jié)合雙鏈DNA時(shí)顯示。
[0105]如本領(lǐng)域技術(shù)人員領(lǐng)會(huì)的，可在采用多種等位基因特異性引物來靶向特定等位基因的反應(yīng)中進(jìn)行等位基因特異性擴(kuò)增方法。針對(duì)這類多重應(yīng)用的引物一般用可區(qū)分的標(biāo)記物標(biāo)記或選擇為使得從等位基因產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物可通過大小區(qū)分。如此，例如可使用單一擴(kuò)增通過對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠分析來鑒定單一樣品中的兩種等位基因。
[0106]如在等位基因特異性探針中的，等位基因特異性寡核苷酸引物可與雜交區(qū)中的多態(tài)性等位基因之一準(zhǔn)確互補(bǔ)，或者可在寡核苷酸3’末端以外的位置具有一些錯(cuò)誤匹配，該錯(cuò)誤匹配存在于兩種等位基因序列中的非多態(tài)性位點(diǎn)處。
[0107]c.可檢測(cè)探針
[0108]i) 5’ -核酸酶測(cè)定探針
[0109]基因型分型還可使用“TaqMan⑩”或“5’ -核酸酶測(cè)定法”，如記載于美國專利N0.5，210，015 ;5，487，972 ;和 5，804，375 ;和 Holland et al.，1988，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA88:7276-7280的實(shí)施。在TaqMan?測(cè)定中，在擴(kuò)增反應(yīng)期間添加在擴(kuò)增區(qū)內(nèi)雜交的經(jīng)標(biāo)記檢測(cè)探針。所述探針經(jīng)修飾以預(yù)防探針充當(dāng)DNA合成的引物。擴(kuò)增使用具有5’至3’外切核酸酶活性的DNA聚合酶進(jìn)行。在擴(kuò)增的每個(gè)合成步驟期間，任何與延伸的引物下游靶核酸雜交的探針均通過DNA聚合酶的5’至3’外切核酸酶活性降解。如此，新靶物鏈的合成還導(dǎo)致探針的降解，而降解產(chǎn)物的積累提供對(duì)靶序列合成的量度。
[0110]雜交探針可以是在SNP等位基因之間進(jìn)行區(qū)分的等位基因特異性探針?；蛘?，所述方法可使用等位基因特異性引物和結(jié)合擴(kuò)增產(chǎn)物的經(jīng)標(biāo)記探針進(jìn)行。
[0111]任何適用于檢測(cè)降解產(chǎn)物的方法可用于5’ -核酸酶測(cè)定。經(jīng)常將檢測(cè)探針用兩種熒光染料標(biāo)記，其中一種能將另一種染料的熒光猝滅。染料附接于探針，通常一種附接于5’末端而另一種附接于內(nèi)部位點(diǎn)，從而當(dāng)探針在未雜交狀態(tài)時(shí)發(fā)生猝滅且從而通過DNA聚合酶的5’至3’外切核酸酶活性對(duì)探針的切割發(fā)生在兩種染料之間。擴(kuò)增導(dǎo)致染料之間探針的切割，其伴隨有猝滅消除以及可從初始猝滅的染料觀察到的熒光中的增加。降解產(chǎn)物的積累通過測(cè)量反應(yīng)熒光中的增加來監(jiān)測(cè)。通過提述均并入本文的美國專利N0.5，491，063和5，571，673描述了用于檢測(cè)伴隨擴(kuò)增發(fā)生的探針降解的備選方法。
[0112]ii) 二級(jí)結(jié)構(gòu)探針
[0113]在二級(jí)結(jié)構(gòu)變化時(shí)可檢測(cè)的探針也適用于檢測(cè)多態(tài)性，包括SNP。例示性的二級(jí)結(jié)構(gòu)或莖環(huán)結(jié)構(gòu)探針包括分子信標(biāo)或Scorpion?引物/探針。分子信標(biāo)探針是單鏈寡核酸探針， 其可形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中熒光團(tuán)和猝滅劑通常位于寡核苷酸的相反端。在探針的任一端，短互補(bǔ)序列允許形成分子內(nèi)的莖，其使得熒光團(tuán)和猝滅劑進(jìn)入緊密臨近。分子信標(biāo)的環(huán)部分與感興趣的靶核酸互補(bǔ)。該探針對(duì)感興趣的其靶核酸的結(jié)合形成迫使莖分開的雜合體。這導(dǎo)致將熒光團(tuán)和猝滅劑彼此移開的構(gòu)象變化且導(dǎo)致更強(qiáng)烈的熒光信號(hào)。然而，分子信標(biāo)探針對(duì)探針靶物中的小序列變化高度敏感(Tyagi S.和 Kramer F.R., Nature Biotechnology, Vol.14, 303-308 頁(1996) ；Tyagi et al., Nature Biotechnology, Vol.16, 49-53 頁(1998) ；Piatek etal., Nature Biotechnology, Vol.16,359-363 頁(1998) ；Marras S.et al., GeneticAnalysis:Biomolecular Engineering,Vol.14, 151-156 頁(1999) ；Tpp 1.etal.，BioTechniques, Vol28, 732-738 頁(2000))。Scorpknt? 引物 / 探針包含共價(jià)連接于
引物的莖環(huán)結(jié)構(gòu)探針。
[0114]d.DNA測(cè)序和單堿基延伸
[0115]SNP還可通過直接測(cè)序檢測(cè)。方法包括例如基于雙脫氧測(cè)序的方法和其他方法如Maxam和Gilbert序列(參見例如Sambrook和Russell,見上文)。
[0116]其他檢測(cè)方法包括寡核苷酸長(zhǎng)度產(chǎn)物的Pyrosequencing?。這類方法經(jīng)常采用擴(kuò)增技術(shù)如PCR。例如，在焦磷酸測(cè)序中，將測(cè)序引物雜交到單鏈的PCR擴(kuò)增的DNA模板；并與酶DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、螢光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶，以及底物腺苷5’磷酸硫酸(APS)和螢光素溫育。將4種脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)的第一種添加到反應(yīng)。如果脫氧核苷酸三磷酸與模板鏈中的堿基互補(bǔ)的話，DNA聚合酶催化其摻入DNA鏈中。每個(gè)摻入事件均伴隨有焦磷酸(PPi)的釋放，其以與摻入的核苷酸量等摩爾的量。ATP硫酸化酶在存在腺苷5’磷酸硫酸的情況下定量地將PPi轉(zhuǎn)化成ATP。該ATP驅(qū)動(dòng)螢光素酶介導(dǎo)的螢光素到氧化螢光素的轉(zhuǎn)化，其生成量與ATP量成比例的可見光。螢光素酶催化的反應(yīng)中產(chǎn)生的光由電荷耦合裝置(CCD)照相機(jī)檢測(cè)到并在Pyrogram?中看到為一個(gè)峰。每個(gè)光信號(hào)均與摻入的核苷酸數(shù)目成比例。腺苷三磷酸雙磷酸酶，一種核苷酸降解酶，連續(xù)降解未摻入的dNTP和過量的ATP。當(dāng)降解完 成時(shí)，添加另一種dNTP。
[0117]另一種用于表征SNP的類似方法不需要使用完整的PCR，但通常僅使用通過與要研究的核苷酸互補(bǔ)的單一的、用熒光標(biāo)記的雙脫氧核糖核酸分子(ddNTP)的引物延伸。多態(tài)性位點(diǎn)處的核苷酸可經(jīng)由對(duì)已延伸一個(gè)堿基且經(jīng)熒光標(biāo)記的引物的檢測(cè)來鑒定(例如Kobayashi et al.，Mol.Cell.Probes, 9:175-182，1995)。
[0118]e.電泳
[0119]可通過使用變性梯度凝膠電泳分析使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)生成的擴(kuò)增產(chǎn)物。不同的等位基因可基于不同序列依賴性解鏈特性和DNA在溶液中的電泳遷移來鑒定(參見例如Erlich 編，PCR Technology, Principles and Applications for DNA Amplification, ff.H.Freeman and Co, New York, 1992, Chapter7)。
[0120]對(duì)微衛(wèi)星多態(tài)性的區(qū)分可使用毛細(xì)管電泳完成。毛細(xì)管電泳便利地允許鑒定出特定微衛(wèi)星等位基因中的重復(fù)數(shù)。對(duì)DNA多態(tài)性分析應(yīng)用毛細(xì)管電泳是本領(lǐng)域中技術(shù)人員公知的(參見例如 Szantai et al., J Chromatogr A.(2005) 1079 (1-2): 41-9 ;Bjorheim和 Ekstrom, Electrophoresis(2005)26(13):2520-30 和 Mitchelson, Mol Biotechnol.(2003)24(1):41-68)。
[0121]f.單鏈確認(rèn)多態(tài)性分析
[0122]可使用單鏈確認(rèn)多態(tài)性分析來區(qū)分靶序列的等位基因，該分析通過單鏈PCR產(chǎn)物的電泳遷移變化來識(shí)別堿基差異，如記載于例如Orita et al., Proc.Nat.Acad.Sc1.86，2766-2770(1989)的。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物可如上文所述的生成，并加熱或變性以形成單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物。單鏈核酸可重折疊或形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，其部分取決于堿基序列。單鏈擴(kuò)增產(chǎn)物的不同電泳遷移性可與靶物等位基因之間的堿基序列差異相關(guān)。
[0123]SNP檢測(cè)方法經(jīng)常采用經(jīng)標(biāo)記的寡核苷酸。可通過摻入標(biāo)記物來標(biāo)記寡核苷酸，所述標(biāo)記物可通過光譜、光化學(xué)、生化、免疫化學(xué)或化學(xué)手段檢出。可用的標(biāo)記物包括熒光染料、放射性標(biāo)記物例如32P、電子致密性試劑、酶如過氧化物酶或堿性磷酸酶、生物素、或?qū)ζ淇色@得抗血清或單克隆抗體的半抗原和蛋白質(zhì)。標(biāo)記技術(shù)是本領(lǐng)域中公知的(參見例如Current Protocols in Molecular Biology,見上；Sambrook&Russell,見上)。
[0124]4.治療方法
[0125]依照EMEA用貝伐單抗(Avastin?:)來治療特定癌癥的劑量如下。對(duì)于轉(zhuǎn)移性結(jié)
腸或直腸癌(mCRC),推薦的劑量為5mg/kg或10mg/kg體重每2周給藥一次，或7.5mg/kg或15mg/kg體重每3周給藥一次，對(duì)于轉(zhuǎn)移性乳腺癌(mBC)，推薦的劑量為以靜脈輸注10mg/kg體重每2周給藥一次或15mg/kg體重每3周給藥一次，而對(duì)于非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)，推薦的劑量為以靜脈輸注7.5mg/kg或15mg/kg體重每3周給藥一次。在NSCLC患者中的臨床受益已用7.5mg/kg和15mg/kg兩種劑量證明。詳情見5.1PharmacodynamicProperties, Non-small cell lung cancer (NSCLC)部分。對(duì)于晚期和/或轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌(mRCC)，優(yōu)選的劑量為以靜脈輸注10mg/kg體重每2周給藥一次(除了長(zhǎng)達(dá)6個(gè)治療周期
的基于鉬的化療之外繼之以作為單藥劑的貝伐單抗(Avastin ')直至疾病進(jìn)展)。對(duì)于成膠
質(zhì)細(xì)胞瘤，具體的劑量為10mg/kg每2周。
[0126]在本發(fā)明的背景中，所述血管發(fā)生抑制劑可另外地施用或作為共療法或共治療物與一種或多種為本領(lǐng)域中已知的標(biāo)準(zhǔn)化療方案一部分的化療劑一起施用。這類標(biāo)準(zhǔn)化療方案中包含的藥劑的例子包括5-氟尿嘧啶、亞葉酸、伊立替康、吉西他濱、厄洛替尼、卡培他濱、紫杉烷如多西他賽 和帕利他賽、干擾素α、長(zhǎng)春瑞濱和基于鉬的化療劑如帕利他賽、卡鉬、順鉬和奧沙利鉬。用于轉(zhuǎn)移性胰腺癌的共治療物的例子包括吉西他濱-厄洛替尼加劑量為5mg/kg或10mg/kg體重每?jī)芍芙o藥一次或7.5mg/kg或15mg/kg體重每三周給藥一次的貝伐單抗。用于腎細(xì)胞癌的共治療物的例子包括干擾素α加劑量為10mg/kg體重每?jī)芍芙o藥一次的貝伐單抗。此外，可用伊立替康、5-氟尿嘧啶、亞葉酸的組合(亦稱為IFL)如例如推注-1FL，用奧沙利鉬、亞葉酸和5-氟尿嘧啶的組合(亦稱為F0LF0X4方案)，或用卡培他濱和奧沙利鉬的組合(亦稱為XEL0X)共治療患者。因此，在本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，將患有惡性疾病或牽涉生理學(xué)和病理學(xué)血管發(fā)生的疾病的患者用一種或多種化療劑如5-氟尿嘧啶、亞葉酸、伊立替康、吉西他濱-厄洛替尼、卡培他濱、和/或基于鉬的化療劑如帕利他賽、卡鉬和奧沙利鉬治療。共療法或共治療物的例子包括5mg/kg貝伐單抗(Avasthis)每?jī)芍芘c推注IFL —起，或10mg/kg貝伐單抗(Avastin*+)每2周與F0LF0X4 —
起用于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌，15mg/kg貝伐單抗3周與卡鉬/帕利他賽一起用于非
鱗狀非小細(xì)胞肺癌，以及10mg/kg貝伐單抗(Avastinw)每2周和帕利他賽一起用于轉(zhuǎn)移性
乳腺癌。另外，要施用的血管發(fā)生抑制劑可作為共療法或共治療物與放療一起施用。
[0127]5.試劑盒
[0128]本發(fā)明還涉及診斷用組合物或試劑盒，其包含任一種提及的寡核苷酸和任選地用于檢測(cè)的適宜工具。
[0129]本發(fā)明的試劑盒可有利地用于實(shí)施本發(fā)明的方法且可以在多種應(yīng)用中例如在診斷領(lǐng)域或作為研究工具等等采用。本發(fā)明試劑盒的各部分可以是分別在管形瓶中的包裝或組合于容器或多容器單元中。試劑盒的制備依照本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的優(yōu)選標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程。所述試劑盒或診斷用組合物可用于依照本發(fā)明的所述方法檢測(cè)一種或多種變異等位基因，其采用例如如本文中描述的擴(kuò)增技術(shù)。
[0130]因此， 本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案提供可用于實(shí)施本文所述方法的試劑盒，其包含能測(cè)定一種或多種SNP基因型的寡核苷酸或多核苷酸。所述寡核苷酸或多核苷酸可包含引物和/或探針。
[0131]本發(fā) 明通過提述以下非限制性的附圖和實(shí)施例進(jìn)一步描述。
實(shí)施例
[0132]實(shí)施例1:
[0133]遺傳決定能影響內(nèi)皮對(duì)VEGF的敏感性。據(jù)此且在本發(fā)明的背景中，我們探索了根本信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的遺傳變異性以發(fā)現(xiàn)抗血管發(fā)生治療和在此治療方案下形成高血壓的預(yù)測(cè)模式。在該分析中，在5項(xiàng)不同試驗(yàn)中評(píng)估了 VEGF-A信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的遺傳變異性與具有不同晚期原發(fā)性癌癥的患者的臨床結(jié)果的相關(guān)性。所有5項(xiàng)試驗(yàn)均為隨機(jī)化的平行試驗(yàn)，其調(diào)查具有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌(N016966)、轉(zhuǎn)移性胰腺癌(AVITA)、晚期或復(fù)發(fā)的非鱗狀非小細(xì)胞肺癌(AVAIL)、轉(zhuǎn)移性腎癌(AVOREN)和HER2陰性轉(zhuǎn)移性乳腺癌(AVADO)的受試者中BEV(貝伐單抗)的功效和安全性。
[0134]在所有5項(xiàng)試驗(yàn)中，納入任選的DNA生物標(biāo)志物取樣用于SNP分析。總共從1346位患者可獲得種系DNA。基于參考文獻(xiàn)并使用SNP標(biāo)記辦法(f∑0.1和r2 ≤0.8)選擇位于缺氧可誘導(dǎo)因子Ia和2 a、VEGF_A、其受體(VEGFR-1和2)和其他相關(guān)基因中的常見單核苷酸多態(tài)性(SNP)。使用MALD1-TOF質(zhì)譜術(shù)成功測(cè)定157種SNP的基因型。使用Cox回歸分析計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)和存活估測(cè)。
[0135]進(jìn)行兩種類型的分析。
[0136]1.遺傳標(biāo)志物對(duì)PFS和OS的相關(guān)性。
[0137]2.遺傳標(biāo)志物對(duì)不歸類為“與研究藥物無關(guān)”的高血壓的相關(guān)性。
[0138]位于VEGF-A啟動(dòng)子中的rs699946 (SEQ ID N0.1) SNP與用bev治療的受試者中改進(jìn)的PFS有關(guān)，等位基因HR為1.26 (95% CIl.07-1.48,p = 0.005)。在安慰劑受試者中未看到影響，表明rs699946(SEQ ID N0.1)可能是用貝伐單抗治療的有利結(jié)果中的預(yù)測(cè)性標(biāo)志物。此外，位于VEGFR2中的rslll33360(SEQ ID N0.5) SNP與用貝伐單抗治療的受試者中改進(jìn)的 PFS 有關(guān)，等位基因 HR 為 1.15(95% CIl.02-1.30，p = 0.02)。就 OS 而言，VEGFR2中的rsl2505758(SEQ ID N0.2) SNP與用bev治療的患者中改進(jìn)的OS最顯著相關(guān)(等位基因 HRl.50,95% CIl.21-1.86，p = 0.0002)。在安慰劑患者中未看到 rsl2505758 (SEQ IDN0.2)的影響。
[0139]10種SNP與貝伐單抗誘發(fā)的高血壓有關(guān)(p〈0.05)，但其中沒有一種超過多重檢驗(yàn)的閾值(Ρ〈0.0003)。顯示最強(qiáng)烈關(guān)聯(lián)性(ρ〈0.01)的兩種SNP為:KDR中的rs2305949 (SEQID N0.3)(等位基因 0R0.93,95% CI0.88-0.98，p = 0.0067)和 EGF 中的 rs4444903 (SEQID N0.4)(等位基因 0R1.06,95% CIl.02-1.11,p = 0.0052)。有意思的是，rs2305949 (SEQID N0.3)和rs4444903 (SEQ ID N0.4)與在KDR和EGF位置273和708上發(fā)生的氨基酸變化有密切聯(lián)系，表明這些變化可能功能性地影響這兩種基因并由此促成高血壓。特別地，WNKl中的rsll064560也與貝伐單抗誘發(fā)的高血壓有關(guān)(等位基因ORl.06,95%CIl.01-1.10，p = 0.02)，由此支持了先前在有限數(shù)目的患者中的觀察結(jié)果[Frey et al.，JClin 0ncol26:2008(May20suppl ;abstrl1003)]。
[0140]患者和方法
[0141]樣品
[0142]所有5項(xiàng)試驗(yàn)方案均得到每個(gè)地方的機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)(institutional reviewboard)批準(zhǔn),并依照赫爾辛基宣言(Declaration of Helsinki)、目前的美國食品和藥品管理局優(yōu)良臨床實(shí)踐(Good Clinical Practices)、和地方倫理和法律要求進(jìn)行?？偣矊?duì)1346位受試者測(cè)定基因型。在這些受試者中，1225位為白種人而121位為非白種人。由于非白種人患者與白種人患者遺傳不同且SNP頻率在兩個(gè)種族組之間可能不同，進(jìn)一步的分析省去非白種人患者。所有患者對(duì)于遺傳生物標(biāo)志物測(cè)試均提供分別的書面知情同意書。
[0143]評(píng)估
[0144]依照如在下列參考文獻(xiàn)中記載的研究方案來評(píng)估患者:
[0145]-AVITA:Van Cutsem et al., J.Cline.0ncol.27, 2231-7 (2009)
[0146]-AVAIL:Reck M, von Pawel J, Zatloukal P et al., Phase III trial ofcisplatin plus gemcitabine with either placebo or bevacizumab as first-linetherapy for nonsquamous non-small-cell lung cancer:AVAiL.J Clin 0ncol2009 ；27(8):1227-34 [0147]-AVOREN:Escudier B, Pluzanska A, Koralewski P, Ravaud A, BracardaS, Szczylik C et al., Bevacizumab plus interferon alfa~2a for treatment ofmetastatic renal cell carcinoma:a randomised, double-blind phase III trial.Lancet.2007 ；370(9605):2103-2111
[0148]-AVADO:Miles Dff et al., J Clin 0ncol2010a ;28 (20):3239-47
[0149]-N016966:Saltz LB, Clarke S, Diaz-Rubio E et al., Bevacizumab incombination with oxalipIatin-based chemotherapy as first-line therapy inmetastatic colorectal cancer:a randomized phase III study.J Clin 0ncol2008 ；26(12):2013-2019
[0150]單核苷酸多態(tài)性選擇
[0151]分析考慮兩種標(biāo)志物集合:Roche集合和Leuven集合。Roche集合由通過對(duì)BEV治療的潛在相關(guān)性的文獻(xiàn)審查選定的35種遺傳多態(tài)性組成。該集合由位于以下基因中的SNP和重復(fù)多態(tài)性構(gòu)成:VEGFA、N0S3、FLT1 (VEGFRl)、KDR (VEGFR2)、WNKl、IL8、IL8R 和 IFNAR2。Leuven集合由來自VEGF信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)或來自已知的副作用(高血壓或血栓形成)的候選基因的186種標(biāo)簽SNP組成，且包括以下基因:VEGF配體、VEGF同源物(胎盤生長(zhǎng)因子或P1GF、VEGF-B 和-C、以及 VEGF-D 或 F1GF)、VEGF 受體 2 (KDR 或 VEGFR-2)和 VEGF 受體 I (FLTI或VEGFR-1)。使用每個(gè)基因翻譯起始位點(diǎn)上游5kb直至3’ polyA腺苷酸化位點(diǎn)的基因組序列來從 HapMap 數(shù)據(jù)庫(HapMapData Rel24/II 階段，08 年 11 月，NCBI B36 組裝，dbSNPbl26)選擇 SNP。使用如在 HAPL0VIEW 軟件包(Barrett, J.C.et al., Bioinformatics.21, 263-5 (2005))中提供的 Tagger (Pe，er, 1.et al.，Nat.Genet.38，663-7 (2006))來選擇標(biāo)記SNP。僅考慮普遍存在(即具有次要等位基因頻率f≤0.1和最小r2閾值≤0.8)的SNP。遵循這些標(biāo)準(zhǔn)總共選出167種標(biāo)記SNP。另外，從dbSNP數(shù)據(jù)庫中選出位于外顯子序列中并以f≥0.1的頻率誘導(dǎo)非同義氨基酸變化的11種SNP，以及VEGF中的4種SNP(rs699947、rs83306Urs2010963 和 rs3025039)、VEGFR-1 中的 I 種 SNP(rsTP53_R_l)和 VEGFR-2 中的I種SNP(rs2071559)，它們先前已報(bào)告為影響這些基因的功能或表達(dá)。
[0152]這兩種集合的標(biāo)志物之間有一些重疊，且集合的大小在6項(xiàng)試驗(yàn)的持續(xù)期間已稍微增加，因此較早期的試驗(yàn)可獲得較少的標(biāo)志物。目前的元分析限定于在研究的至少兩項(xiàng)試驗(yàn)中測(cè)定了基因型的標(biāo)志物。
[0153]如下定義4種標(biāo)志物套組:
[0154].‘所有標(biāo)志物’由測(cè)定的獲得至少一種基因型的所有標(biāo)志物組成。
[0155].‘Roche標(biāo)志物’由來自Roche集合的標(biāo)志物組成，其通過質(zhì)量檢查(見下文)并在白種人受試者中具有大于1%的頻率。
[0156].‘Leuven功效標(biāo)志物’由來自Leuven集合的那些位于牽連VEGF途徑的基因座中的標(biāo)志物組成，其通過質(zhì)量檢查(見下文)并在白種人受試者中具有大于I %的頻率。
[0157].‘Leuven安全性標(biāo)志物’由來自Leuven集合的那些位于涉及高血壓或血栓形成的候選基因中的標(biāo)志物組成，其通過質(zhì)量檢查(見下文)并在白種人受試者中具有大于1%的頻率。
[0158]測(cè)定基因型
[0159]將外周血取樣到K2EDTA塑料Vacutainer管中。離心后,依照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程從沉淀的白血球細(xì)胞級(jí)分提取種系DNA。
[0160]對(duì)于Roche集合的SNP，以盲測(cè)方式在Roche翻譯研究科學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室(Translational Research Sciences Genetics laboratories)(Basel, Switzerland)實(shí)施基因型測(cè)定，其使用等位基因特異性PCR擴(kuò)增、Sanger測(cè)序和片段分析平臺(tái)進(jìn)行(AVAIL、AVITA、AVOREN、AVADO, N016966)。
[0161]對(duì)于Leuven集合的SNP,以盲測(cè)方式在Vesalius研究中心(Leuven, Belgium)實(shí)施基因型測(cè)定,其使用 Sequenom iPLEX 平臺(tái)(Sequenom Inc, San Diego, CA, USA)進(jìn)行。將任何不能在第一輪基因型測(cè)定中提供有力基因型的SNP使用不同的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物套組重新設(shè)計(jì)并重新測(cè)試?？偣灿?57種(85.3% )成功進(jìn)行基因型測(cè)定，總體成功率為98.5%。第二次設(shè)計(jì)仍失敗的27種SNP視為失敗。
[0162]設(shè)計(jì)以下擴(kuò)增引物用于SNPrs699946 (SEQ ID N0.1)、rsl2505758 (SEQ ID N0.2),rs2305949(SEQ ID N0.3)、rs4444903 (SEQ ID N0.4) rsl1133360 (SEQ ID N0.5)。對(duì)于rs699946(SEQ ID N0.1)，使用 ACGTTGGATGCTACCACTAGTGTTGGCTTG (SEQ ID N0.6)和 ACGTTGGATGTGAGCTCCACACTGCCTTC (SEQ ID N0.7)。對(duì)于 SNPrsl2505758 (SEQ ID N0.2)，使用 ACGTTGGATGCTTTACTCTGCCAAATCTATG(SEQ ID N0.8)和ACGTTGGATGGCTAATAAGCTTATACATTTG(SEQ ID N0.9)。對(duì)于 rs2305949 (SEQ ID N0.3)，使用 ACGTTGGATGATCCTATACCCTAGAGCAAG (SEQ ID N0.10)和 ACGTTGGATGATCTGTGCAAAGTTATAGGC (SEQ ID N0.11)。對(duì)于 rs4444903 (SEQID N0.4)，使用 ACGTTGGATGTCTTCTTTCAGCCCCAATCC (SEQ ID N0.12)和 ACGTTGGATGAAGAAAGGAAGAACTGATGG (SEQ ID N0.13) ? 對(duì)于 rsl 1133360 (SEQ ID N0.5)，使用 ACGTTGGATGTTTCACATTGCTATGCCCAA(SEQ ID N0.14)和 ACGTTGGATGCTCTTTCTTCACTTTGACTG(SEQ ID N0.15)。[0163]設(shè)計(jì)以下非延伸引物(探針)用于SNP rs699946(SEQ ID N0.1)、rsl2505758 (SEQID N0.2)、rs2305949(SEQ ID N0.3)、rs4444903 (SEQ ID N0.4)和 rslll33360 (SEQ IDN0.5) o 對(duì)于 rs699946(SEQ ID N0.1)，使用 ATTAGTCAATTCTCTGACAGAGACA (SEQ ID N0.16)。對(duì)于 rsl2505758(SEQ ID N0.2),使用 TTACTCTGCCAAATCTATGATGCCA(SEQ ID N0.17)。對(duì)于 rs2305949(SEQ ID N0.3),使用 CTAGAGCAAGTAAATTGAAAAAA(SEQ ID N0.18)。對(duì)于 rs4444903(SEQ ID N0.4),使用 GCATCTCCAATCCAAGGGTTGT(SEQ ID N0.19)。對(duì)于rsl 1133360 (SEQ ID N0.5)，使用 CACATTGCTATGCCCAACACATC (SEQ ID N0.20) ?
[0164]質(zhì)量檢查
[0165]如下檢查數(shù)據(jù)質(zhì)量:
[0166]?確保測(cè)定鏈的均一性
[0167]?匯總?cè)笔?shù)據(jù)的水平
[0168].排除具有次要等位基因頻率(MAF〈1% )的標(biāo)志物
[0169].排除對(duì)于等位基因頻率同質(zhì)性測(cè)試失敗的標(biāo)志物
[0170].進(jìn)行Hardy Weinberg平衡(HWE)檢驗(yàn)來協(xié)助解讀
[0171]在質(zhì)量檢查后，將25種Roche標(biāo)志物、133種Leuven功效標(biāo)志物和22種Leuven安全性標(biāo)志物進(jìn)行合并關(guān)聯(lián)性分析。
[0172]統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0173]對(duì)所有具有同質(zhì)性頻率的標(biāo)志物應(yīng)用通過研究分層的個(gè)體患者數(shù)據(jù)的合并分析。對(duì)于功效候選標(biāo)志物測(cè)試與PFS和OS的關(guān)聯(lián)性，其使用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸(ProportionalHazards Regression)進(jìn)行。對(duì)于安全性候選標(biāo)志物測(cè)試與高血壓的關(guān)聯(lián)性，其使用邏輯回歸(Logistic Regression)進(jìn)行。在適宜時(shí),主要分析牽涉來自ITT(對(duì)于功效終點(diǎn))和SP(高血壓)的用BEV治療的白種人受試者。在所有關(guān)聯(lián)性測(cè)試中對(duì)以下協(xié)變量進(jìn)行調(diào)整:區(qū)域、研究和劑量以及背景化療方案。還調(diào)整使用后向逐步回歸(backward stepwiseregression)通過終點(diǎn)選定的以下變量子集:EC0G表現(xiàn)狀態(tài)(O對(duì)I)、性別(男性對(duì)女性)、年齡、LDH、堿性磷酸酶水平(正常范圍以內(nèi)對(duì)正常范圍之上)、血清清蛋白(〈2.9g/dL對(duì)>=2.9g/dL)和轉(zhuǎn)移性部位的基線數(shù)目(>2對(duì)〈=2)。為了調(diào)查任何檢出的關(guān)聯(lián)性是否反映暫時(shí)的而非治療效果，還在用安慰劑治療的白種人受試者中進(jìn)行關(guān)聯(lián)性測(cè)試。為了進(jìn)一步表征任何檢出的關(guān)聯(lián)性，還在白種人受試者中進(jìn)行基因型X治療相互作用分析。
[0174]數(shù)據(jù)
[0175]26種Roche標(biāo)志物、136種Leuven功效標(biāo)志物和22種Leuven安全性標(biāo)志物通過質(zhì)量檢查并進(jìn)行同質(zhì)性分析。表1顯示要納入元分析的受試者的數(shù)目。注意到ITT中的3位受試者不在SP中，且3位受試者對(duì)于隨機(jī)化的每周劑量具有缺失值(RNDWD)。
[0176]表1:用于分析的受試者套組和大小
[0177]
【權(quán)利要求】
1.一種確定患者形成與通過血管發(fā)生抑制劑的療法有關(guān)的高血壓的易感性的方法，其中所述血管發(fā)生抑制劑包含貝伐單抗或與貝伐單抗結(jié)合VEGF上基本相同表位的抗體，所述方法包括: (a)在自患有癌癥的患者衍生的樣品中測(cè)定多態(tài)性rs2305949(SEQID N0.3)處的基因型，并 (b)基于所述基因型鑒定患者為更多地易感于或更少地易感于形成與通過血管發(fā)生抑制劑的療法有關(guān)的高血壓，所述血管發(fā)生抑制劑包含貝伐單抗或與貝伐單抗結(jié)合VEGF上基本相同表位的抗體，其中多態(tài)性rs2305949(SEQ ID N0.3)處CC基因型的存在指示所述患者比在多態(tài)性rs2305949(SEQ ID N0.3)處具有CT或TT基因型的患者更多地易感于形成高血壓，或者多態(tài)性rs2305949(SEQ ID N0.3)處CT或TT基因型的存在指示所述患者比在多態(tài)性rs2305949(SEQ ID N0.3)處具有CC基因型的患者更少地易感于形成高血壓。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述療法進(jìn)一步包含化療劑或化療方案。
3.權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)的方法，其中所述血管發(fā)生抑制劑與選自下組的一種或多種藥劑一起施用:紫杉燒、干擾素α、5-氟尿喃唳、亞葉酸(Ieucovorin)、伊立替康(irinotecan)、吉西他濱(gemcitabine)-厄洛替尼(erlotinib)和基于鉬的化療劑。
4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法，其中所述癌癥是胰腺癌、腎細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌或肺癌。
5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品是血液樣品。
6.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法，其中所述基因型通過MALD1-T0F質(zhì)譜術(shù)測(cè)定。
7.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括對(duì)所述患者施用所述療法。
8.—種藥物組合物，其包含如權(quán)利要求1至7中限定的血管發(fā)生抑制劑，用于治療有此需要的患者，其中依照權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的方法已確定所述患者為更少地易感于形成與包含所述血管發(fā)生抑制劑的療法有關(guān)的高血壓。
9.一種用于實(shí)施權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的方法的試劑盒，其包含能夠測(cè)定多態(tài)性rs2305949(SEQ ID N0.3)處基因型的寡核苷酸。
10.一種降低形成與包含血管發(fā)生抑制劑的療法有關(guān)的高血壓的風(fēng)險(xiǎn)的方法，其中所述血管發(fā)生抑制劑包含貝伐單抗或與貝伐單抗結(jié)合VEGF上基本相同表位的抗體，所述方法包括: (a)在自患有癌癥的患者衍生的樣品中測(cè)定多態(tài)性rs2305949(SEQID N0.3)處的基因型； (b)鑒定患者為更少地易感于形成與通過血管發(fā)生抑制劑的療法有關(guān)的高血壓，所述血管發(fā)生抑制劑包含貝伐單抗或與貝伐單抗結(jié)合VEGF上基本相同表位的抗體，其中多態(tài)性rs2305949(SEQ ID N0.3)處CT或TT基因型的存在指示所述患者比在多態(tài)性rs2305949(SEQ ID N0.3)處具有CC基因型的患者更少地易感于形成高血壓；并 (c)對(duì)在多態(tài)性rs2305949(SEQID N0.3)處具有CT或TT基因型、依照(b)鑒定為更少地易感于形成高血壓的患者施用所述血管發(fā)生抑制劑。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述療法進(jìn)一步包含化療劑或化療方案。
12.權(quán)利要求10至11中任一項(xiàng)的方法，其中所述血管發(fā)生抑制劑與選自下組的一種或多種藥劑一起施用:紫杉烷、干擾素α、5_氟尿嘧啶、亞葉酸、伊立替康、吉西他濱-厄洛替尼和基于鉬的化療劑。
13.權(quán)利要求10至12中任一項(xiàng)的方法，其中所述癌癥是胰腺癌、腎細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌或肺癌。
14.權(quán)利要求10至13中任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品是血液樣品。
15.權(quán)利要求10至14中任一項(xiàng)的方法，其中所述基因型通過MALD1-TOF質(zhì)譜術(shù)測(cè)定。
16.一種治療患者的方法，所述方法包括對(duì)所述患者施用包含血管發(fā)生抑制劑的療法，所述血管發(fā)生抑制劑包含貝伐單抗或與貝伐單抗結(jié)合VEGF上基本相同表位的抗體，其中已測(cè)定所述患者在多態(tài)性rs2305949(SEQ ID N0.3)處的基因型為CT或TT。
17.一種確定患者形成與包含血管發(fā)生抑制劑的療法有關(guān)的高血壓的易感性的方法，所述血管發(fā)生抑制劑包含貝伐單抗或與貝伐單抗結(jié)合VEGF上基本相同表位的抗體，所述方法包括: (a)在自患有癌癥的患者衍生的樣品中測(cè)定多態(tài)性rs4444903(SEQID N0.4)處的基因型，并 (b)基于所述基因型鑒定患者為更多地易感于或更少地易感于形成與通過血管發(fā)生抑制劑的療法有關(guān)的高血壓，所述血管發(fā)生抑制劑包含貝伐單抗或與貝伐單抗結(jié)合VEGF上基本相同表位的抗體，其中多態(tài)性rs4444903(SEQ ID N0.4)處GA基因型的存在指示所述患者比在多態(tài)性rs4444903(SEQ ID N0.4)處具有GG或AA基因型的患者更多地易感于形成高血壓，或者多態(tài)性rs4444903(SEQ ID N0.4)處GG或AA基因型的存在指示所述患者比在多態(tài)性rs4444903(SEQ ID N0.4)處具有GA基因型的患者更少地易感于形成高血壓。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述療法進(jìn)一步包含化療劑或化療方案。
19.權(quán)利要求17至18中任一項(xiàng)的方法，其中所述血管發(fā)生抑制劑與選自下組的一種或多種藥劑一起施用:紫杉烷、干擾素α、5_氟尿嘧啶、亞葉酸、伊立替康、吉西他濱-厄洛替尼和基于鉬的化療劑。
20.權(quán)利要求17至19中任一項(xiàng)的方法，其中所述癌癥是胰腺癌、腎細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌或肺癌。
21.權(quán)利要求17至20中任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品是血液樣品。
22.權(quán)利要求17至21中任一項(xiàng)的方法，其中所述基因型通過MALD1-T0F質(zhì)譜術(shù)測(cè)定。
23.權(quán)利要求17至22中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括對(duì)所述患者施用所述療法。
24.一種藥物組合物，其包含如權(quán)利要求17至23中限定的血管發(fā)生抑制劑，用于治療有此需要的患者，其中依照權(quán)利要求17至23中任一項(xiàng)的方法已確定所述患者為更少地易感于形成與通過所述血管發(fā)生抑制劑的療法有關(guān)的高血壓。
25.一種用于實(shí)施權(quán)利要求17至23中任一項(xiàng)的方法的試劑盒，其包含能夠測(cè)定多態(tài)性rs4444903 (SEQ ID N0.4)處基因型的寡核苷酸。
26.—種降低形成與包含血管發(fā)生抑制劑的療法有關(guān)的高血壓的風(fēng)險(xiǎn)的方法，其中所述血管發(fā)生抑制劑包含貝伐單抗或與貝伐單抗結(jié)合VEGF上基本相同表位的抗體，所述方法包括: (a)在自患有癌癥的患者衍生的樣品中測(cè)定多態(tài)性rs4444903(SEQID N0.4)處的基因型； (b)鑒定患者為更少地易感于形成與通過血管發(fā)生抑制劑的療法有關(guān)的高血壓，所述血管發(fā)生抑制劑包含貝伐單抗或與貝伐單抗結(jié)合VEGF上基本相同表位的抗體，其中多態(tài)性rs4444903(SEQ ID N0.4)處GG或AA基因型的存在指示所述患者比在多態(tài)性rs4444903 (SEQ ID N0.4)處具有GA基因型的患者更少地易感于形成高血壓；并 (c)對(duì)在多態(tài)性rs4444903 (SEQ ID N0.4)處具有GG或AA基因型、依照 (b)鑒定為更少地易感于形成高血壓的患者施用所述血管發(fā)生抑制劑。
27.權(quán)利要求26的方法，其中所述療法進(jìn)一步包含化療劑或化療方案。
28.權(quán)利要求26至27中任一項(xiàng)的方法，其中所述血管發(fā)生抑制劑與選自下組的一種或多種藥劑一起施用:紫杉烷、干擾素α、5_氟尿嘧啶、亞葉酸、伊立替康、吉西他濱-厄洛替尼和基于鉬的化療劑。
29.權(quán)利要求26至28中任一項(xiàng)的方法，其中所述癌癥是胰腺癌、腎細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌或肺癌。
30.權(quán)利要求26至29中任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品是血液樣品。
31.權(quán)利要求26至30中任一項(xiàng)的方法，其中所述基因型通過MALD1-TOF質(zhì)譜術(shù)測(cè)定。
32.—種治療患者的方法，所述方法包 括對(duì)所述患者施用包含血管發(fā)生抑制劑的療法，所述血管發(fā)生抑制劑包含貝伐單抗或與貝伐單抗結(jié)合VEGF上基本相同表位的抗體，其中已測(cè)定所述患者在多態(tài)性rs4444903(SEQ ID N0.4)處的基因型為GG或AA。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103946395SQ201280053021
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2012年8月28日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月31日
【發(fā)明者】S.L.德哈斯, P.德爾馬, D.拉姆布雷赫茨, S.謝爾 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司, Vib研究所, 生命科學(xué)研究合伙研究所