具有一種或多種增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】提供了通過(guò)調(diào)節(jié)植物中編碼NEMTOP6多肽的核酸的表達(dá)增強(qiáng)植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法。還提供了具有編碼NEMTOP6多肽的核酸的受調(diào)節(jié)表達(dá)的植物，所述植物與對(duì)照植物相比具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀。還提供可用于增強(qiáng)植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀的NEMTOP6編碼核酸和包含所述核酸的構(gòu)建體。
【專(zhuān)利說(shuō)明】具有一種或多種增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物及其制備方法
[0001]本發(fā)明一般地涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域并且涉及用于通過(guò)調(diào)節(jié)植物中編碼POI (目的蛋白質(zhì))多肽的核酸表達(dá)而增強(qiáng)植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法。本發(fā)明還涉及具有編碼POI多肽的核酸的受調(diào)節(jié)表達(dá)的植物，所述植物相對(duì)于對(duì)應(yīng)野生型植物或其他對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀。本發(fā)明還提供用于本發(fā)明方法的構(gòu)建體，例如過(guò)表達(dá)構(gòu)建體。
[0002]常規(guī)的農(nóng)作物及園藝學(xué)改良手段利用選擇育種技術(shù)，以鑒定具有想要特性的植物。然而，此類(lèi)選擇育種技術(shù)具有幾個(gè)缺陷，即這些技術(shù)一般耗費(fèi)很多勞動(dòng)并且產(chǎn)生這樣的植物，其經(jīng)常含有異源性遺傳組分，其可能不總是導(dǎo)致從親本植物中傳遞的想要性狀。分子生物學(xué)進(jìn)展已經(jīng)允許人類(lèi)改良動(dòng)物及植物的種質(zhì)。植物的遺傳工程使得可以分離和操作遺傳物質(zhì)(一般處于DNA或RNA形式)并且隨后導(dǎo)入該遺傳物質(zhì)至植物中。此類(lèi)技術(shù)具有產(chǎn)生具備多種經(jīng)濟(jì)學(xué)、農(nóng)學(xué)或園藝學(xué)改良性狀的農(nóng)作物或植物的能力。 [0003]農(nóng)業(yè)上的一個(gè)性狀是增加的產(chǎn)量。產(chǎn)量通常定義為來(lái)自農(nóng)作物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值的可測(cè)量結(jié)果。該結(jié)果可以就數(shù)量和/或品質(zhì)方面進(jìn)行定義。產(chǎn)量直接取決于幾個(gè)因素，例如器官的數(shù)目和大小、植物構(gòu)造(例如枝的數(shù)目)、種子產(chǎn)生、葉衰老等。根發(fā)育、養(yǎng)分?jǐn)z入量、脅迫耐受性和早期萌發(fā)勢(shì)(early vigor)也可以是決定產(chǎn)量的重要因素。優(yōu)化前述因素因而可以對(duì)增加農(nóng)作物產(chǎn)量有貢獻(xiàn)。
[0004]種子產(chǎn)量是重要的性狀，因?yàn)樵S多植物的種子對(duì)人與動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)是重要的。農(nóng)作物如玉米、稻、小麥、卡諾拉油菜和大豆占超過(guò)一半的人類(lèi)總熱量攝入，無(wú)論通過(guò)直接消費(fèi)種子本身或通過(guò)消費(fèi)基于加工的種子而產(chǎn)生的肉產(chǎn)品。農(nóng)作物也是糖、油及工業(yè)加工中所用眾多類(lèi)型代謝物的來(lái)源。種子含有胚(新苗和新根的起源)和胚乳(萌發(fā)期間及幼苗早期生長(zhǎng)期間用于胚生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源)。種子發(fā)育涉及多種基因并且需要代謝物從根、葉和莖轉(zhuǎn)移至正在生長(zhǎng)的種子中。胚乳尤其同化糖類(lèi)、油和蛋白質(zhì)的代謝前體并且將它們合成為貯藏大分子以灌滿(mǎn)籽粒。
[0005]對(duì)于眾多農(nóng)作物的另一個(gè)重要性狀是早期萌發(fā)勢(shì)。改進(jìn)早期萌發(fā)勢(shì)是現(xiàn)代稻育種計(jì)劃在溫帶和熱帶稻品種上的重要目標(biāo)。長(zhǎng)根在水栽稻中對(duì)于正確土壤固定是重要的。在將稻直接播種至被淹沒(méi)田地的情況下，以及在植物必須從水中迅速出苗的情況下，較長(zhǎng)的苗與萌發(fā)勢(shì)相關(guān)。在實(shí)施條播的情況下，較長(zhǎng)的中胚軸和胚芽鞘對(duì)于良好出苗是重要的。將早期萌發(fā)勢(shì)人工改造到植物內(nèi)的能力將在農(nóng)業(yè)中是極其重要的。例如，不良的早期萌發(fā)勢(shì)已經(jīng)限制了基于玉米帶種質(zhì)(Corn Belt germplasm)的玉米(Zea mayes L.)雜種在歐洲大西洋地區(qū)的引種。
[0006]又一個(gè)重要性狀是改進(jìn)的非生物脅迫耐受性。非生物脅迫是世界范圍農(nóng)作物損失的主要原因，對(duì)于大多數(shù)主要農(nóng)作物植物而言降低平均產(chǎn)量超過(guò)50%(Wang等，Planta218，1-14, 2003)。非生物脅迫可以由干旱、鹽度、極端溫度、化學(xué)毒性和氧化脅迫引起。提高植物對(duì)非生物脅迫耐受性的能力將在世界范圍對(duì)農(nóng)民是極大經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)并且會(huì)允許在不利條件期間及在農(nóng)作物栽培否則是不可能的陸地上栽培農(nóng)作物。
[0007]農(nóng)作物產(chǎn)量因而可以通過(guò)優(yōu)化前述因素或其他因素而增加。
[0008]取決于最終用途，對(duì)某些產(chǎn)量性狀的改良可能優(yōu)先于其它產(chǎn)量性狀。例如對(duì)于應(yīng)用如飼料或木材生產(chǎn)或生物燃料資源而言，增加植物營(yíng)養(yǎng)體部分可能是希望的，而對(duì)于應(yīng)用如面粉、淀粉或油生產(chǎn)而言，增加種子參數(shù)可能是尤其希望的。即便在種子參數(shù)當(dāng)中，某些參數(shù)可以更優(yōu)先于其它參數(shù)，這取決于應(yīng)用。多種機(jī)制可以對(duì)增加種子產(chǎn)量有貢獻(xiàn)，無(wú)論形式為增加的種子大小或是增加的種子數(shù)目。
[0009]現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可以通過(guò)調(diào)節(jié)植物中編碼POI (目的蛋白質(zhì))多肽的核酸在植物中的表達(dá)而改進(jìn)植物中多種產(chǎn)量相關(guān)性狀。
[0010]發(fā)明背景
[0011]0嫩拓?fù)洚悩?gòu)酶￥10'0卩63.(:.5.99.1.3)屬于僅在植物和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的IIB型亞類(lèi)的II型DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶并且是A和B亞基的異源二聚體(Forterre P, GadelleD.Phylogenomics of DNA topoisomerases: their origin and putative roles inthe emergence of modern organisms.Nucleic Acids Res.2009Feb;37(3):679-92)。拓?fù)洚悩?gòu)酶VI為倍性依賴(lài)性細(xì)胞生長(zhǎng)所需并且參與染色質(zhì)組裝和轉(zhuǎn)錄沉默(KirikV,Schrader A,Uhrig JFj Hulskamp M.MIDGET unravels functions of the Arabidopsistopoisomerase VI complex in DNA endoreduplication, chromatin condensation, andtranscriptional silencing.Plant Cell.20070ct;19 (10):3100-10)。
[0012]除T0P6A和T0P6B亞基的酶異源二聚體外，提示T0P6復(fù)合體包含其他非酶蛋白質(zhì)。實(shí)例為稱(chēng)為RHLl和BIN4的蛋白質(zhì)(Breuer C，Stacey NJj West CE，ZhaoY, Chory Jj Tsukaya H, Azumi Y, Maxwell A，Roberts Kj Sugimoto-Shirasu Κ.BIN4, anovel component of the plant DNA topoisomerase VI complex, is required forendoredupIication in Arabidopsis.Plant Cell.2007Nov; 19 (11):3655-68)?；诮湍鸽p雜交實(shí)驗(yàn)以及與來(lái)自動(dòng)物和細(xì)菌的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶IIA類(lèi)型蛋白質(zhì)的部分具有低序列同源性，這些蛋白質(zhì)之一(稱(chēng)為BIN4)與T0P6復(fù)合體結(jié)合(Breuer C，Stacey NJj West CE，ZhaoY，Chory Jj Tsukaya H，Azumi Y，Maxwell A，Roberts K，Sugimoto-Shirasu Κ.ΒΙΝ4，anovel component of the plant DNA topoisomerase VI complex, is required forendoreduplication in Arabidopsis.Plant Cell.2007Nov;19(11):3655-68)。
`[0013]在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，BIN4 由基因 At5g24630 編碼(BreuerC，Stacey NJj West CE，Zhao Yj Chory Jj Tsukaya Hj Azumi Yj Maxwell A，RobertsK，Sugimoto-Shirasu Κ.BIN4, a novel component of the plant DNA topoisomeraseVI complex， is required for endoreduplication in Arabidopsis.PlantCell.2007Nov; 19(11):3655-68)。擬南芥bin4突變體顯示嚴(yán)重的矮化表型(Yin Y，CheongH，F(xiàn)riedrichsen D，Zhao Y，Hu Jj Mora-Garcia Sj Chory J.A crucial role for theputative Arabidopsis topoisomerase VI in plant growth and development.ProcNatl Acad Sci U S A.2002Jul23; 99 (15): 10191-6)。已經(jīng)顯示這些突變體中減小的器官大小是由減少的細(xì)胞膨脹引起，所述減少的細(xì)胞膨脹與通過(guò)核內(nèi)再?gòu)?fù)制(即染色體DNA擴(kuò)增但沒(méi)有相應(yīng)的有絲分裂)而增加的倍性中的缺陷相關(guān)(Sugimoto-Shirasu K, RobertsK.〃Big it up〃:endoreduplication and cell-size control in plants.Curr Opin PlantBiol.2003Dec ; 6 (6): 544-53 ; Breuer Cj Stacey NJj West CE，Zhao Yj Chory Jj TsukayaHj Azumi Yj Maxwell A，Roberts Kj Sugimoto-Shirasu Κ.BIN4, a novel component ofthe plant DNA topoisomerase VI complex, is required for endoreduplication inArabidopsis.Plant Cell.2007Nov; 19 (11):3655-68)。bin4 的細(xì)胞大小和倍性表型與缺少拓?fù)洚悩?gòu)酶VI復(fù)合體組分(例如AtSPOl 1/RHL2/BIN5和RHL1/HYP7)的其他矮化突變體(Yin Y，Cheong H, Friedrichsen Dj Zhao Y，Hu Jj Mora-Garcia S，Chory J.A crucial rolefor the putative Arabidopsis topoisomerase VI in plant growth and development.Proc Natl Acad Sci U S A.2002Jul23; 99 (15): 10191-6;)或 rhll、rhl2 和 top6B 突變體(Kirik V，Schrader A, Uhrig JF，Hulskamp M.MIDGET unravels functions ofthe Arabidopsis topoisomerase VI complex in DNA endoreduplication, chromatincondensation, and transcriptional silencing.Plant Cell.20070ct;19 (10):3100-10，Breuer Cj Stacey NJj West CE，Zhao Yj Chory Jj Tsukaya Hj Azumi Yj MaxwellA, Roberts K，Sugimoto-Shirasu Κ.BIN4，a novel component of the plant DNAtopoisomerase VI complex, is required for endoreduplication in Arabidopsis.PlantCell.2007Nov; 19(11):3655-68)的表型相似。
[0014]AtBIM的氨基酸序列分析鑒定了與高迀移率組(HMG)蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合域相似的短基序(RGR基序，也稱(chēng)為AT hook)和蛋白質(zhì)C末端部分中推測(cè)的核定位信號(hào)(KRGRPSKEKQPPAKKAR) (Breuer C，Stacey NJj West CE，Zhao Y,Chory Jj Tsukaya H, AzumiY, Maxwell A，Roberts Kj Sugimoto-Shirasu Κ.BIN4, a novel component of the plantDNA topoisomerase VI complex, is required for endoreduplication in Arabidopsis.Plant Cell.2007Nov;19 (II):3655-68;Kirik V，Schrader A，Uhrig JFjHulskampM.MIDGET unravels functions of the Arabidopsis topoisomerase VI complex in DNAendoreduplication, chromatin condensation, and transcriptional silencing.PlantCell.20070ct;19 (10):3100-10)。
[0015]已經(jīng)提示擬南芥中的BIN4以同一基因座編碼的兩個(gè)蛋白質(zhì)變體存在，稱(chēng)為BIN4和MID。除了前31個(gè)N末端氨基酸，兩者在功能和序列上均相同(KirikV,Schrader A,Uhrig JFj Hulskamp M.MIDGET unravels functions of the Arabidopsistopoisomerase VI complex in DNA endoreduplication, chromatin condensation, andtranscriptional silencing.Plant Cell.20070ct;19(10):3100-10;Forterre P，GadelleD.Phylogenomics of DNA topoisomerases: their origin and putative roles in theemergence of modern organisms.Nucleic Acids Res.2009Feb;37(3):679-92)。
[0016]然而，根據(jù)Interpro數(shù)據(jù)庫(kù)，AtBIM蛋白質(zhì)序列、稱(chēng)為MID序列的變體及其同源物不含有任何已知的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，即認(rèn)為它們不直接與拓?fù)洚悩?gòu)酶VI的酶功能相關(guān)，例如切割活性或參與ATP更新或傳遞。
[0017]認(rèn)為不直接有助于拓?fù)洚悩?gòu)酶VI酶促作用的擬南芥拓?fù)洚悩?gòu)酶VI復(fù)合體的另一種蛋白質(zhì)是AtRHLl及其同源物。因此，可以認(rèn)為拓?fù)洚悩?gòu)酶VI復(fù)合體的蛋白質(zhì)，像BIN4或RHLl是拓?fù)洚悩?gòu)酶VI復(fù)合體的非酶成員。在蛋白質(zhì)復(fù)合體中，一些蛋白質(zhì)參與催化反應(yīng)，而其他蛋白質(zhì)可能暫時(shí)地或永久地與復(fù)合體結(jié)合，但不直接有助于酶反應(yīng)。這些可能是增加或降低復(fù)合體的酶促蛋白質(zhì)活性的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，但是不參與核心功能性的這些蛋白質(zhì)還可以是改變蛋白質(zhì)復(fù)合體的細(xì)胞內(nèi)定位、更新和分解速率、保護(hù)復(fù)合體免于例如自由基損傷的蛋白質(zhì)，或者這些非酶蛋白質(zhì)可以用作支架以允許更快、更穩(wěn)定或更有效地裝配復(fù)合體的酶活性核心部分，其執(zhí)行所述復(fù)合體的主要功能。[0018]一些證據(jù)提示，DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶VI的酶活性還在植物的脅迫適應(yīng)中起作用。在擬南芥植物中過(guò)表達(dá)推測(cè)的稻亞基A基因0sT0P6A3或推測(cè)的稻亞基B基因0sT0P6B導(dǎo)致對(duì)高鹽和脫水的耐受性增加，其不需要同時(shí)過(guò)表達(dá)提示與T0P6復(fù)合體結(jié)合的其他非酶蛋白質(zhì)(Jain, M., Tyagi, A.K.和 Khurana, J.P.(2006), Overexpression ofputative topoisomerase6genes from rice confers stress tolerance in transgenicArabidopsis plants.FEBS Journal, 273:5245 - 5260)。從利用拓?fù)洚悩?gòu)酶 VI 的突變體的工作看出，復(fù)合體的非酶活性成員為形成和/或維持活性復(fù)合體所需，但是發(fā)現(xiàn)為了在植物中增加該復(fù)合體的活性，調(diào)節(jié)復(fù)合體酶活性成員的表達(dá)是足夠的。在Jain和同事的報(bào)告中，不需要同時(shí)調(diào)節(jié)復(fù)合體的非酶成員的表達(dá)(Jain, Μ.，Tyagi, A.K.和 Khurana,J.P.(2006), Overexpression of putative topoisomerase6genesfrom rice confers stress tolerance in transgenic Arabidopsis plants.FEBSJournal, 273:5245 - 5260)。
[0019]發(fā)明概述
[0020]令人驚訝地，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)編碼如本文定義的POI多肽的核酸表達(dá)產(chǎn)生了在非脅迫和/或脅迫條件下相對(duì)于對(duì)照植物具有一種或多種增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀，特別是增加的產(chǎn)量的植物。出人意料地，提示與T0P6復(fù)合體結(jié)合的非酶蛋白質(zhì)的過(guò)表達(dá)足以在非脅迫和/或脅迫條件下相對(duì)于對(duì)照植物增加產(chǎn)量相關(guān)性狀，不需要同時(shí)過(guò)表達(dá)任何酶T0P6亞基,如但不限于T0P6A或T0P6B。
[0021]根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，提供了用于相對(duì)于對(duì)照植物在植物中改善如本文提供的一種或多種產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括調(diào)節(jié)植物中編碼如本文定義的POI多肽的核酸的表達(dá)。
[0022]該說(shuō)明書(shū)的部分題目和標(biāo)題僅為便利和參考目的，并不應(yīng)該以任意方式影響該說(shuō)明書(shū)的意思或解釋。
[0023]定義
`[0024]將在本說(shuō)明書(shū)中自始至終使用以下定義。
[0025]多肽/蛋白質(zhì)
[0026]術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用并且指由肽鍵連接在一起的任意長(zhǎng)度的聚合形式的氨基酸。
[0027]多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列
[0028]術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可互換地使用并且指任意長(zhǎng)度的聚合非分支形式的核苷酸:核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或這二者的組合。
[0029]同源物
[0030]蛋白質(zhì)的“同源物”包括這樣的肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)及酶，它們相對(duì)于非修飾的上述蛋白質(zhì)具有氨基酸取代、缺失和/或插入并且與所述肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)及酶來(lái)源的非修飾蛋白質(zhì)具有相似生物學(xué)活性和功能活性。
[0031]缺失指從蛋白質(zhì)中移除一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
[0032]插入指一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基在蛋白質(zhì)中預(yù)定位點(diǎn)內(nèi)的導(dǎo)入。插入可以包含單個(gè)或多個(gè)氨基酸的氨基端融合和/或羧基端融合以及序列內(nèi)插入。通常，在氨基酸序列內(nèi)部的插入會(huì)比氨基端融合或羧基端融合更小，約1-10個(gè)殘基級(jí)別。氨基端或羧基端融合蛋白或融合肽的實(shí)例包括如酵母雙雜交系統(tǒng)中所用轉(zhuǎn)錄激活物的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或激活結(jié)構(gòu)域、噬菌體外殼蛋白、(組氨酸)-6-標(biāo)簽、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶-標(biāo)簽、蛋白A、麥芽糖結(jié)合蛋白、二氫葉酸還原酶、Tag.100表位、c-myc表位、FlLAG⑩_表位、lacZ、CMP( |丐調(diào)蛋白結(jié)合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。
[0033]取代指以具有相似特性(如相似疏水性、親水性、抗原性、形成或破壞α -螺旋結(jié)構(gòu)或折疊結(jié)構(gòu)的傾向)的其它氨基酸替換蛋白質(zhì)的氨基酸。氨基酸取代一般是單個(gè)殘基的，不過(guò)可以是簇集性的，這取決于置于多肽的功能性約束并且可以為I到10個(gè)氨基酸；插入通常會(huì)是約1-10個(gè)氨基酸殘基級(jí)別。氨基酸取代優(yōu)選地是保守性氨基酸取代。保守性取代表是本領(lǐng)域眾所周知的(見(jiàn)例如Creighton (1984)Proteins.W.H.Freeman andCompany (編著)和下表1)。
[0034]表1:保守性氨基酸取代的實(shí)例
[0035]
【權(quán)利要求】
1.用于相對(duì)于對(duì)照植物在農(nóng)作物植物中增強(qiáng)一種或多種產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括在一種或多種農(nóng)作物植物中增加編碼NEMT0P6多肽的核酸的表達(dá)，優(yōu)選過(guò)表達(dá)，更優(yōu)選通過(guò)重組方法過(guò)表達(dá)，其中所述NEMT0P6多肽在其原始物種中，優(yōu)選植物物種，或在體外是拓?fù)洚悩?gòu)酶VI復(fù)合體的一部分或與其結(jié)合，但并不酶促參與拓?fù)洚悩?gòu)酶VI活性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述多肽不含有選自以下的任意一種特征:
(i) Toprim 結(jié)構(gòu)域； (?)組合有ATP水解活性的切割-閉合活性，或超扭曲活性；
(iii)(Interpro 數(shù)據(jù)庫(kù)版本 31.0, 2011 年 2 月 9 日的)Interpro 結(jié)構(gòu)域 IPR003594、IPR014721、IPR015320、IPR020568 的組合；
(iv)(Interpro 數(shù)據(jù)庫(kù)版本 31.0, 2011 年 2 月 9 日的)Interpro 結(jié)構(gòu)域 IPR002815、IPR004085、IPR013049 的組合； (V)在Jain等的附圖SI中為0sT0P6A3或0ST0P6B公開(kāi)的基序和結(jié)構(gòu)域的組合(Jain, M., Tyagi, A.K.和 Khurana, J.P.(2006), Overexpression of putativetopoisomerase6genes from rice confers stress tolerance in transgenicArabidopsis plants.FEBS Journal, 273:5245 — 5260);和任選地 (vi)從N末端甲硫氨酸開(kāi)始前50個(gè)氨基酸內(nèi)GAASG的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)的方法，其中所述NEMT0P6多肽包含以下基序中的一個(gè)或多個(gè):
(i)基序I:[DE] [LM]LLDLKGT[IV]YK[TS]TIVPSRTFCVV[SN]VGQ[TS]EAK[IV]E[AS]IM[DN]DFIQL[ΕΚ]P[QH]SN[LV][FY](SEQ ID NO:35)
(ii)基序2:[QS]RLPL[VIT] [ILF] [APS] [DE]K[IV] [QN]R[ST]K[AV]L[VI]EC[DE]GDSIDLS⑶[VM]GAVGR[IV] [VI] [IV] S [ND] (SEQ ID NO:36),
(iii)基序3:[QN] [RK] [TS]K[AV]L[IVL]EC[DE]G[DE] [SA] [IL]DLS⑶[MLIV]G[AS]VGR(SEQ ID NO:37) (iv)基序4:
LDLKG [VT] [VI] Y [KR] [TS] [TS] I [VL] P [SC] [RN] T [YF] [CF] [VL] V [NS] [VF] GQ [MST]EAK[VI]E[SA]IM[NDST]DF[MVI]QL(SEQ ID NO:38)。
4.權(quán)利要求1、2或3的方法，其中所述增加的表達(dá)由在農(nóng)作物植物中導(dǎo)入，優(yōu)選重組導(dǎo)入，并表達(dá)編碼所述NEMT0P6多肽的所述核酸實(shí)現(xiàn)。
5.權(quán)利要求1、2、3或4的方法，其中所述增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀包含相對(duì)于對(duì)照植物增加的產(chǎn)量，并優(yōu)選包含相對(duì)于對(duì)照植物增加的生物量和/或增加的種子產(chǎn)量。
6.權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的方法，其中編碼NEMT0P6的所述核酸編碼表A中列出的任一多肽，或是該核酸的一部分，或是能夠與該核酸的互補(bǔ)序列雜交的核酸。
7.權(quán)利要求1至6任一項(xiàng)的方法,其中所述核酸序列編碼表A中給出的任一多肽的直向同源物或旁系同源物。
8.核酸分子，其選自: (i)SEQID NO:3、5或7代表的核酸; (ii)SEQID NO:3、5或7代表的核酸的互補(bǔ)核酸； (iii)編碼NEMT0P6多肽的核酸，所述多肽以遞增優(yōu)選順序與SEQID N0:4、6或8所代表的氨基酸序列具有至少 67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或99%序列同一性，并且額外地包含以遞增優(yōu)選順序與SEQ ID NO:35至SEQ ID NO:38中給出的任意一個(gè)或多個(gè)基序具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%,99%或更高序列同一性的一個(gè)或多個(gè)基序，并且還優(yōu)選相對(duì)于對(duì)照植物賦予增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀，其中所述核酸不編碼SEQ ID NO: 10,26或30的序列的多肽； (iv)優(yōu)選因遺傳密碼的簡(jiǎn)并性編碼SEQ ID N0:4、6或8 (任一項(xiàng))所代表的多肽的核酸，所述分離的核酸可來(lái)自SEQ ID N0:4、6或8 (任一項(xiàng))所代表的多肽序列，并還優(yōu)選相對(duì)于對(duì)照植物賦予增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀； (V)核酸分子，其與(ii)的核酸分子或(iii)或(iv)的序列的互補(bǔ)序列在高度嚴(yán)格性雜交條件下雜交，并優(yōu)選相對(duì)于對(duì)照植物賦予增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀，其中所述核酸不編碼SEQ ID NO: 10,26或30的序列的多肽； (vi)上文(i)至(V)任一項(xiàng)的核酸，除了分別在圖6、7或8中用星號(hào)標(biāo)記的那些位置之外，所述核酸編碼在至少一個(gè)氨基酸位置上不同于SEQ ID NO: 10,30或26的多肽的多肽； (vii)編碼多肽的上文(i)至(V)任一項(xiàng)的核酸，所述多肽在分別在圖6、7或8中未用星號(hào)標(biāo)記的一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置上具有SEQ ID N0:4、6或8的序列的氨基酸。
9.多肽，其選自 (i)SEQID N0:4、6或8代表的氨基酸序列； (ii)氨基酸序列，其以遞增優(yōu)選順序與SEQID NO:Y所代表的氨基酸序列具有至少67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同一,注，并且額外地包含以遞增優(yōu)選順序與SEQ ID NO:35至SEQ ID NO:38中給出的任意一個(gè)或多個(gè)基序具有至少 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高序列同一性的一個(gè)或多個(gè)基序，并且還優(yōu)選相對(duì)于對(duì)照植物賦予增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀，其中所述多肽不是SEQ ID NO: 10,26或30的序列； (iii)上文(i)至(ii)任一項(xiàng)的氨基酸序列，除了分別在圖6、7或8中用星號(hào)標(biāo)記的那些位置，其在至少一個(gè)氨基酸位置上不同于SEQ ID NO: 10,30或26的多肽； (iv)上文(i)至(ii)任一項(xiàng)的氨基酸序列，其在分別在圖6、7或8中未用星號(hào)標(biāo)記的一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置上具有SEQ ID N0:4、6或8的序列的氨基酸。
10.構(gòu)建體，優(yōu)選表達(dá)或過(guò)表達(dá)構(gòu)建體，其包含: (i)權(quán)利要求8的核酸或編碼權(quán)利要求9的或如權(quán)利要求1、2、3、6或7任一項(xiàng)中定義的NEMTOP6多肽的核酸或SEQ ID NO:1代表的核酸或NEMTOP6編碼核酸，其以遞增優(yōu)選順序與SEQ ID NO:1代表的核酸序列，優(yōu)選在SEQ ID NO:1的序列編碼區(qū)全長(zhǎng)范圍內(nèi)具有至少 67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 序列同一,注，或編碼NEMTOP6多肽的核酸， 所述多肽以遞增優(yōu)選順序與SEQ ID NO: 2代表的氨基酸序列，優(yōu)選在SEQ ID 勵(lì):2的序列全長(zhǎng)范圍內(nèi)具有至少67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性，或與SEQ ID NO:1代表的核酸分子或SEQ ID NO:1代表的核酸序列的互補(bǔ)序列在高度嚴(yán)格雜交條件下雜交的核酸分子，或編碼SEQ ID N0:2、4、6或8代表的多肽的多肽部分的核酸序列，其中所述多肽部分與SEQ ID N0:2、4、6或8代表的任一全長(zhǎng)多肽具有基本上相同的生物學(xué)和功能活性； (ii)能夠驅(qū)動(dòng)(i)的核酸序列表達(dá)的一個(gè)或多個(gè)控制序列；和任選地 (iii)轉(zhuǎn)錄終止序列， 其中(ii)的至少一個(gè)控制序列是組成型啟動(dòng)子，優(yōu)選強(qiáng)或中等強(qiáng)度組成型啟動(dòng)子，更優(yōu)選中等強(qiáng)度組成型啟動(dòng)子，或在成熟種子、苗莖和根中有活性的啟動(dòng)子。
11.權(quán)利要求10的構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子不是花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子。
12.用于產(chǎn)生相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀，優(yōu)選相對(duì)于對(duì)照植物增加的產(chǎn)量，并且更優(yōu)選相對(duì)于對(duì)照植物增加的種子產(chǎn)量和/或增加的生物量的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物植物的方法，其包括: (i)在農(nóng)作物植物細(xì)胞或農(nóng)作物植物中導(dǎo)入并表達(dá)權(quán)利要求8的核酸或編碼權(quán)利要求9的或如權(quán)利要求1、2、3、6或7任一項(xiàng)中定義的NEMTOP6多肽的核酸或權(quán)利要求10或11的構(gòu)建體；和 (ii)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的條件下培育所述農(nóng)作物植物細(xì)胞或農(nóng)作物植物。
13.用于相對(duì)于對(duì)照植物改變農(nóng)作物植物的構(gòu)造的方法，其包括調(diào)節(jié)，優(yōu)選增加農(nóng)作物植物中編碼NEMTOP6多肽，優(yōu)選權(quán)利要求9的多肽或如在權(quán)利要求1、2、3、6、7或8任一項(xiàng)中定義的多肽的核酸的表達(dá) ，其中所述NEMTOP6多肽在其原始物種中，優(yōu)選植物或在體外是拓?fù)洚悩?gòu)酶VI復(fù)合體的一部分，但并不酶促參與拓?fù)洚悩?gòu)酶VI活性。
14.權(quán)利要求1至7、12和13任一項(xiàng)的方法或權(quán)利要求10或11的構(gòu)建體，其中所述核酸有效連接組成型啟動(dòng)子，優(yōu)選表2a的組成型啟動(dòng)子；更優(yōu)選中等強(qiáng)度的組成型啟動(dòng)子，優(yōu)選植物啟動(dòng)子，更優(yōu)選GOS2啟動(dòng)子，最優(yōu)選來(lái)自稻的GOS2啟動(dòng)子。
15.權(quán)利要求14的方法或構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子不是花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子。
16.權(quán)利要求1至7、12和13任一項(xiàng)的方法或權(quán)利要求10或11的構(gòu)建體，其中所述核酸有效連接在成熟種子、苗莖和根中有活性的啟動(dòng)子，優(yōu)選表2c和/或表2d的啟動(dòng)子，更優(yōu)選胚乳特異性啟動(dòng)子，優(yōu)選植物胚乳特異性啟動(dòng)子，甚至更優(yōu)選來(lái)自稻的啟動(dòng)子，仍然甚至更優(yōu)選稻醇溶蛋白啟動(dòng)子并最優(yōu)選SEQ ID NO:44的啟動(dòng)子或與SEQ ID N0:44的序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的啟動(dòng)子。
17.相對(duì)于對(duì)照植物具有增強(qiáng)的產(chǎn)量相關(guān)性狀，優(yōu)選相對(duì)于對(duì)照植物增加的產(chǎn)量，并且更優(yōu)選增加的種子產(chǎn)量和/或增加的生物量的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物植物，其得自權(quán)利要求8的核酸或編碼權(quán)利要求9的或權(quán)利要求1、2、3、6或7任一項(xiàng)中定義的NEMTOP6多肽的核酸的增加的表達(dá)，或來(lái)自所述轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物植物的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物植物細(xì)胞。
18.在農(nóng)作物植物的細(xì)胞中包含的非天然亞基組成的拓?fù)洚悩?gòu)酶VI蛋白質(zhì)復(fù)合體，其中所述拓?fù)洚悩?gòu)酶VI蛋白質(zhì)復(fù)合體包含一個(gè)或多個(gè)重組NEMTOP6多肽，優(yōu)選權(quán)利要求9的或權(quán)利要求1、2、3、6、7或8任一項(xiàng)中定義的一個(gè)或多個(gè)NEMTOP6多肽，其中所述一個(gè)或多個(gè)NEMTOP6多肽不是其天然組成的特定拓?fù)洚悩?gòu)酶VI蛋白質(zhì)復(fù)合體的一部分或與其結(jié)合，并且其中所述農(nóng)作物植物與不包含所述非天然拓?fù)洚悩?gòu)酶VI蛋白質(zhì)復(fù)合體的對(duì)照植物相比在脅迫條件和/或非脅迫條件下具有一種或多種產(chǎn)量相關(guān)性狀的增加。
19.用于在農(nóng)作物植物中產(chǎn)生非天然亞基組成的拓?fù)洚悩?gòu)酶VI蛋白質(zhì)復(fù)合體的方法，其中所述拓?fù)洚悩?gòu)酶VI蛋白質(zhì)復(fù)合體包含一個(gè)或多個(gè)重組NEMT0P6多肽，優(yōu)選權(quán)利要求9的或權(quán)利要求1、2、3、6、7或8任一項(xiàng)中定義的一個(gè)或多個(gè)NEMT0P6多肽，其中所述一個(gè)或多個(gè)NEMT0P6多肽不是其天然組成的特定拓?fù)洚悩?gòu)酶VI蛋白質(zhì)復(fù)合體的一部分或與其結(jié)合，所述方法包括以下步驟 a.在農(nóng)作物植物細(xì)胞或農(nóng)作物植物中重組導(dǎo)入并表達(dá)編碼NEMT0P6多肽的核酸；并 b.在促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的條件下培育所述農(nóng)作物植物細(xì)胞或農(nóng)作物植物。
20.權(quán)利要求17的農(nóng)作物植物的可收獲部分，其包含以下核酸 a.權(quán)利要求8的核酸，和/或 b.編碼權(quán)利要求9的NEMTOP6多肽的核酸，和/或 c.編碼權(quán)利要求1、2、3、6或7任一項(xiàng)中定義的NEMTOP6多肽的核酸， 和/或包含權(quán)利要求10或11的表達(dá)構(gòu)建體， 和/或權(quán)利要求18的拓?fù)洚悩?gòu)酶VI蛋白質(zhì)復(fù)合體， 和/或包含以下所述NEMTOP6多肽 a.權(quán)利要求9的NEMTOP6多肽，和/或 b.權(quán)利要求1、2、3、6或7任一項(xiàng)中定義的NEMTOP6多肽， 其中所述可收獲部分優(yōu)選為地上生物量，更優(yōu)選苗和/或莖生物量，和/或種子。
21.從權(quán)利要求17的農(nóng)作物植物制備的和/或來(lái)自權(quán)利要求20的農(nóng)作物植物的可收獲部分的產(chǎn)品。
22.權(quán)利要求21的產(chǎn)品，其中所述產(chǎn)品包含以下核酸 a.權(quán)利要求8的核酸，和/或 b.編碼權(quán)利要求9的NEMTOP6多肽的核酸，和/或 c.編碼權(quán)利要求1、2、3、6或7任一項(xiàng)中定義的NEMTOP6多肽的核酸， 和/或包含權(quán)利要求10或11的構(gòu)建體， 和/或權(quán)利要求18的拓?fù)洚悩?gòu)酶VI蛋白質(zhì)復(fù)合體， 和/或包含以下所述NEMTOP6多肽 a.權(quán)利要求9的NEMTOP6多肽，和/或 b.權(quán)利要求1、2、3、6或7任一項(xiàng)中定義的NEMTOP6多肽， 其中所述多核苷酸、表達(dá)構(gòu)建體和/或所述多肽是產(chǎn)品質(zhì)量，優(yōu)選與從不過(guò)表達(dá)所述NEMTOP6編碼核酸和/或所述NEMTOP6多肽的農(nóng)作物植物中制備的產(chǎn)品相比提高的產(chǎn)品質(zhì)量的標(biāo)志物。
23.以下核酸 a.權(quán)利要求8的核酸，和/或 b.編碼權(quán)利要求9的NEMTOP6多肽的核酸，和/或 c.編碼權(quán)利要求1、2、3、6或7任一項(xiàng)中定義的NEMTOP6多肽的核酸， 和/或權(quán)利要求10或11的構(gòu)建體， 和/或權(quán)利要求18的拓?fù)洚悩?gòu)酶VI蛋白質(zhì)復(fù)合體， 和/或以下所述NEMTOP6多肽 a.權(quán)利要求9的NEMTOP6多肽，和/或b.權(quán)利要求1、2、3、6或7任一項(xiàng)中定義的NEMT0P6多肽， 用于相對(duì)于對(duì)照植物增加農(nóng)作物植物中的一種或多種產(chǎn)量相關(guān)性狀的用途。
24.任一前述權(quán)利要求，其中所述農(nóng)作物植物細(xì)胞來(lái)自或所述農(nóng)作物植物是單子葉農(nóng)作物植物如甘蔗或雙子葉農(nóng)作物植物如甜菜、苜蓿、三葉草、菊苣、胡蘿卜、木薯、棉花、大豆、卡諾拉油菜，或谷物如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、黑小麥、高粱、二粒小麥、斯佩爾特小麥、黑麥、單粒小麥、畫(huà)眉草、蜀黍和燕麥，并更優(yōu)選玉米、小麥、稻、大豆、棉花、油菜包括卡諾拉油菜、甘蔗、甜 菜和苜蓿。
【文檔編號(hào)】C12N15/29GK103619163SQ201280029725
【公開(kāi)日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2012年4月13日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月18日
【發(fā)明者】C·勒佐, S·范德納比利 申請(qǐng)人:巴斯夫植物科學(xué)有限公司