用于培養(yǎng)來自正常人輸卵管卵巢上皮和人輸卵管卵巢腫瘤的細(xì)胞的組合物和方法
【專利摘要】本申請中描述了細(xì)胞培養(yǎng)基、用于制備細(xì)胞培養(yǎng)基的試劑盒和方法、以及用于培養(yǎng)細(xì)胞例如雌性生殖道細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的方法。
【專利說明】用于培養(yǎng)來自正常人輸卵管卵巢上皮和人輸卵管卵巢腫瘤的細(xì)胞的組合物和方法
[0001]相關(guān)申請的交叉引用
[0002]本申請要求2011年3月24日提交的美國臨時申請?zhí)?1/467，363和2011年3月25日提交的美國臨時申請?zhí)?1/467，949的權(quán)益，所述文獻(xiàn)的公開內(nèi)容通過引用的方式完整并入本文。
【背景技術(shù)】
[0003]離體細(xì)胞系培養(yǎng)物已經(jīng)大大促進(jìn)人類疾病的研究和治療。如今，許多疾病的機(jī)制性起源已經(jīng)在培養(yǎng)的細(xì)胞系中表征，并且已經(jīng)將細(xì)胞系用于篩選和制造治療藥。在癌癥和女性生殖健康領(lǐng)域，已經(jīng)通過培養(yǎng)來自女性生殖道的正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞增強(qiáng)研究工作。然而，許多細(xì)胞類型證明難以使用可獲得的培養(yǎng)基和現(xiàn)存技術(shù)培養(yǎng)。例如，用于培養(yǎng)正常卵巢細(xì)胞當(dāng)前方法不能在卵巢細(xì)胞亞型(如帶纖毛的與不帶纖毛的細(xì)胞或卵巢表面上皮與包涵囊腫上皮)之間區(qū)分。此外，未曾離體培養(yǎng)已經(jīng)被提示作為高等級乳頭狀漿液性腺癌的推定性細(xì)胞來源的輸卵管上皮細(xì)胞。源自卵巢腫瘤的腫瘤細(xì)胞也證明難以在培養(yǎng)物中培育。盡管存在少數(shù)巢癌細(xì)胞系(Verschraegen CF等人，Clin CancerRes.2003Feb;9(2):845-52和美國專利號5，710，038)，這些細(xì)胞系就群體倍增信息、原始腫瘤組織的臨床亞型、惡性來源驗(yàn)證或表型而言沒有進(jìn)行充分表征。因此，本領(lǐng)域中仍需要用于建立源自卵巢組織、輸卵管細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)基、試劑盒和方法。
[0004]發(fā)明簡述
[0005]本發(fā)明的一個方面涉及細(xì)胞培養(yǎng)基，或用于制備細(xì)胞培養(yǎng)基的試劑盒，其包含三磷酸腺苷；載體蛋白(例如，白蛋白，如牛血清白蛋白)；膽固醇、亞油酸和硫辛酸；谷胱甘肽；選自次黃嘌呤、黃嘌呤、腺嘌呤、鳥嘌呤和胸苷(優(yōu)選地，黃嘌呤和/或次黃嘌呤)的核苷酸補(bǔ)救途徑前體堿基；磷脂酰乙醇胺；硒；轉(zhuǎn)鐵蛋白；三碘甲腺原氨酸；維生素A、維生素C和維生素D;Zn、Mg和Cu;增加胞內(nèi)cAMP的試劑(優(yōu)選地，霍亂毒素)；表皮生長因子(EGF);氫化可的松；胰島素；和血清。這種細(xì)胞培養(yǎng)基也可以包含腺苷單磷酸、維生素E、維生素K3、煙酸和煙酰胺中的一種或多種。
[0006]在其中增加胞內(nèi)cAMP的試劑是霍亂毒素的某些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基可以包含在10ng/ml和70ng/ml之間、優(yōu)選地在15和30ng/ml之間，如在20ng/ml和25ng/ml之間的霍亂毒素。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含約20ng/mL的霍亂毒素。在其他優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含約25ng/mL的霍亂毒素。
[0007]在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含在3ng/ml和50ng/ml之間的EGF，優(yōu)選地約8_12ng/ml 如 10ng/ml 的 EGF。
[0008]在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含在0.005 μ g/mL和1.5 μ g/mL之間的氫化可的松和/或在1.0 μ g/mL和75.0 μ g/mL之間的胰島素。 [0009]在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含在0.2%和4.0%ν/ν之間的血清。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含在0.2%和10.0%ν/ν之間或在0.2%和5.0%ν/ν之間的血清。[0010]一些本發(fā)明的實(shí)施方案涉及一種細(xì)胞培養(yǎng)基，其適應(yīng)于培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞(如卵巢腫瘤細(xì)胞)并且包含在1.0%和10.0%ν/ν之間的血清、在1.0%和4.0%ν/ν之間的血清、優(yōu)選地在1.8%v/v和2%v/v之間的血清、最優(yōu)選地約1.8%v/V的血清。在一些此類實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含在0.15 μ g/mL和0.3 μ g/mL之間的氫化可的松、優(yōu)選地約0.15 μ g/mL的氫化可的松和/或在5.0 μ g/mL和50.0 μ g/mL之間的胰島素、優(yōu)選地約15.0 μ g/mL的胰島素。適應(yīng)于培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的示例性培養(yǎng)基是WIT-oc。
[0011]在適應(yīng)于培養(yǎng)某些卵巢腫瘤細(xì)胞(如源自子宮內(nèi)膜樣腫瘤和粘液性腫瘤的那些)的這類實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基還包含雌激素，例如以等同效力在30nM和300nM之間17-β-雌二醇、優(yōu)選地等同效力約100ηΜ17-β-雌二醇的濃度包含雌激素(例如，17- β -雌二醇)。在其他實(shí)施方案中，如適應(yīng)于培養(yǎng)某些卵巢腫瘤細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞源自乳頭狀漿液性腫瘤、透明細(xì)胞腫瘤、癌肉瘤和無性細(xì)胞瘤的那些，細(xì)胞培養(yǎng)基基本上不含雌激素。示例性培養(yǎng)基WIT-oc可以包含括雌激素或可以基本上不含雌激素，這取決于其中待培養(yǎng)的細(xì)胞類型。
[0012]適應(yīng)于培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞如卵巢腫瘤細(xì)胞的WIT-oc和細(xì)胞培養(yǎng)基可以支持卵巢腫瘤細(xì)胞體外增殖至少約14、25或甚至35次群體倍增(PD)。
[0013]在適應(yīng)于培養(yǎng)正常卵巢細(xì)胞和輸卵管細(xì)胞的另外的其他實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含在0.25%和0.75%ν/ν之間的血清，優(yōu)選地約0.5%ν/ν的血清。在這種細(xì)胞培養(yǎng)基中，氫化可的松的濃度優(yōu)選地在0.25 μ g/mL和0.50 μ g/mL之間，例如，約0.5 μ g/mL的氫化可的松，和/或在5.0 μ g/mL和50.0 μ g/mL之間的、優(yōu)選地約20.00 μ g/mL的胰島素。適應(yīng)于培養(yǎng)正常卵巢細(xì)胞和輸卵管細(xì)胞如上皮細(xì)胞的示例性培養(yǎng)基是WIT-fo。
[0014]適應(yīng)于培養(yǎng)正常卵巢細(xì)胞和輸卵管細(xì)胞的WIT-fo和細(xì)胞培養(yǎng)基可以支持卵巢細(xì)胞和/或輸卵管細(xì)胞體外增殖 至少約14、25或甚至35次群體倍增(PD)。在一些實(shí)施方案中，卵巢細(xì)胞和/或輸卵管細(xì)胞是永生化細(xì)胞。永生化細(xì)胞可以過量表達(dá)端粒酶(例如人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT))的催化性亞基。本發(fā)明的一個方面是一種培養(yǎng)物，所述培養(yǎng)物包含其中hTERT已經(jīng)過量表達(dá)的細(xì)胞，其中hTERT的過量表達(dá)足以使得所述細(xì)胞能夠進(jìn)行至少14、25或35次群體倍增。在某些實(shí)施方案中，該培養(yǎng)物是基本上純化的細(xì)胞培養(yǎng)物。
[0015]本發(fā)明的一個方面涉及基本上純化的卵巢細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述卵巢細(xì)胞過量表達(dá)探針集合D0K5、CD47、HS6ST3、DPP6、0SBLP3 ;其中所述培養(yǎng)物包含至少IO3個細(xì)胞；并且所述細(xì)胞能夠發(fā)生至少14、25或35次群體倍增。類似地，一個方面涉及基本上純化的輸卵管細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述卵巢細(xì)胞過量表達(dá)探針集合STC2、SFRPU SLC35F3、SHMT2、TMEM164 ;其中所述培養(yǎng)物包含至少IO3個細(xì)胞；并且所述細(xì)胞能夠進(jìn)行至少14、25或35次群體倍增。本發(fā)明的另一個方面涉及用于制備本文所述的細(xì)胞培養(yǎng)基的試劑盒。在一些實(shí)施方案中，該試劑盒可以包含一個或多個第一容器，所述第一容器包含三磷酸腺苷；載體蛋白；膽固醇、亞油酸和硫辛酸；谷胱甘肽；選自次黃嘌呤、黃嘌呤、腺嘌呤、鳥嘌呤和胸苷的核苷酸補(bǔ)救途徑前體堿基；磷脂酰乙醇胺；硒；轉(zhuǎn)鐵蛋白；三碘甲腺原氨酸；維生素A、維生素C和維生素D ;Zn、Mg和Cu ;和一個或多個第二容器，所述第二容器包含增加胞內(nèi)cAMP的試劑；表皮生長因子(EGF);氫化可的松；胰島素；和血清；以及任選地雌激素，從而以適宜的比例混合第一容器和第二容器的內(nèi)容物(或第一容器和第二組容器)產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)基，例如，如本文以多種方式所定義。在一些實(shí)施方案中，這種試劑盒可以支持細(xì)胞體外增殖至少14、25或甚至至少35次群體倍增(PD)。
[0016]本發(fā)明的又一個方面是細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)充物，其中所述補(bǔ)充物以這樣的相對濃度包含增加胞內(nèi)cAMP的試劑；表皮生長因子(EGF);氫化可的松；胰島素；血清；和任選地，雌激素，從而向基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基添加適宜比例的補(bǔ)充物產(chǎn)生本文所述的細(xì)胞培養(yǎng)基。例如，向細(xì)胞培養(yǎng)基添加補(bǔ)充物可以產(chǎn)生0-70ng/ml增加胞內(nèi)cAMP的試劑，至少3ng/ml的EGF、0.015-0.5 μ g/mL的氫化可的松；至少10.00 μ g/mL的胰島素，0.2%_4.0%ν/ν的血清補(bǔ)充物，以及任選地，30-300nM的雌激素，例如，如本文多樣描述。
[0017]本發(fā)明的又一個方面涉及制備本文所述的細(xì)胞培養(yǎng)基的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括混合三磷酸腺苷；載體蛋白；膽固醇、亞油酸和硫辛酸；谷胱甘肽；選自次黃嘌呤、黃嘌呤、腺嘌呤、鳥嘌呤和胸苷的核苷酸補(bǔ)救途徑前體堿基；磷脂酰乙醇胺；硒；轉(zhuǎn)鐵蛋白；三碘甲腺原氨酸；維生素A、維生素C和維生素D ;Zn、Mg和Cu ;增加胞內(nèi)cAMP的試劑；表皮生長因子(EGF);氫化可的松；胰島素；和血清；以及任選地雌激素，從而以適宜的比例混合內(nèi)容物產(chǎn)生了如本文多樣描述的細(xì)胞培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，從一個或多個第一容器添加一種或多種成分(例如，前11種成分，三磷酸腺苷；載體蛋白；膽固醇、亞油酸和硫辛酸；谷胱甘肽；選自次黃嘌呤、黃嘌呤、腺嘌呤、鳥嘌呤和胸苷；磷脂酰乙醇胺的核苷酸補(bǔ)救途徑前體堿基；硒；轉(zhuǎn)鐵蛋白；三碘甲腺原氨酸；維生素A、維生素C和維生素D ;Zn、Mg和Cu),并且從一個或多個第二容器添加一種或多種額外成分,例如,后5種成分和任選地雌激素。
[0018]本發(fā)明的又一個方面是一種用于培養(yǎng)卵巢上皮細(xì)胞和輸卵管上皮細(xì)胞的方法。這種方法包括從卵巢的或輸卵管獲得卵巢上皮細(xì)胞和輸卵管上皮細(xì)胞；并且在本文所述的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，其中所述卵巢上皮細(xì)胞和輸卵管上皮細(xì)胞可以在細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行至少14、25或甚至35次群體倍增。所述細(xì)胞可以是卵巢上皮細(xì)胞，如源自卵巢表面的那些。所述細(xì)胞可以是輸卵管上皮細(xì)胞，如源自輸卵管纓飾表面的那些。
[0019]類似地，本發(fā)明的一個方面涉及一種用于培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的方法。這種方法包括獲得腫瘤細(xì)胞；在如本文所述并由WIT-oc例舉的適應(yīng)于培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞，其中增加胞內(nèi)cAMP的試劑是霍亂毒素，并且該細(xì)胞培養(yǎng)基包含25ng/ml的霍亂毒素、10ng/ml的表皮生長因子(EGF)、0.15 μ g/mL的氫化可的松；15.00 μ g/mL的胰島素；和1.8%的血清補(bǔ)充物(和優(yōu)選地基本上不含雌激素)，并且其中所述腫瘤細(xì)胞可以在該細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行至少14、25或甚至35次群體倍增。在一些實(shí)施方案中，該方法還包括對于前1-5代細(xì)胞用胰蛋白酶處理培養(yǎng)平板，因而富集癌細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，腫瘤細(xì)胞是卵巢癌細(xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、腺樣囊性癌細(xì)胞和/或來自肺或胃腸道的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(類癌)細(xì)胞。例如，腫瘤細(xì)胞可以是卵巢癌細(xì)胞。這些卵巢癌細(xì)胞可以從患者的原代實(shí)體卵巢組織或腹水獲得，或從動物模型中培育的腫瘤異體移植物獲得。在其他實(shí)施方案中，腫瘤細(xì)胞是乳頭狀漿液性腫瘤細(xì)胞、透明細(xì)胞腫瘤細(xì)胞、癌肉瘤細(xì)胞或無性細(xì)胞瘤細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，例如，為了培養(yǎng)子宮內(nèi)膜樣腫瘤細(xì)胞或粘液性腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)基還可以包含IOOnM的17-β-雌二醇或等效力量的另一種雌激素。
[0020]本發(fā)明的一個額外方面涉及鑒定候選治療藥的方法，所述方法包括培養(yǎng)細(xì)胞(即，源自原發(fā)性腫瘤，如作為乳頭狀漿液性腫瘤、透明細(xì)胞腫瘤、癌肉瘤、無性細(xì)胞瘤、子宮內(nèi)膜樣腫瘤或粘液性腫瘤中至少一種的卵巢腫瘤的細(xì)胞)；使細(xì)胞與藥物接觸；并測量細(xì)胞的生理學(xué)；其中調(diào)節(jié)所述細(xì)胞的生理學(xué)的藥物是候選治療藥。在一些實(shí)施方案中，該方法還包含在使細(xì)胞與藥物接觸之前在試驗(yàn)動物中培育所述細(xì)胞。
[0021]附圖簡述
[0022]圖1顯示卵巢和輸卵管的解剖學(xué)。圖1A和IB圖顯示其中產(chǎn)生卵母細(xì)胞(卵細(xì)胞)的雌性生殖器官-卵巢。卵巢借助韌帶與子宮連接并且靠近輸卵管的傘端。圖1C顯示在薄上皮中覆蓋的卵巢表面。在排卵期間，卵母細(xì)胞突破卵巢表面并釋放至輸卵管的傘端中。在接下來7天期間，卵母細(xì)胞沿輸卵管上行至子宮的子宮內(nèi)膜腔中。圖1D顯示排卵部位在正常情況下修復(fù)，但是有時以上皮內(nèi)襯的小包涵囊腫留在卵巢表面下。這些圖改編自 Baba Al, Catol C., Comparative Oncology.Bucharest:The Publishing House ofthe Romanian Academy; 2007和互聯(lián)網(wǎng)上國際癌癥研究所關(guān)于治療卵巢上皮癌的網(wǎng)站www.cancer, gov/cancertopics/ovarianepitheIial。
[0023]圖2顯示在WIT-fo培養(yǎng)基中正常卵巢上皮細(xì)胞和輸卵管上皮細(xì)胞的長期培養(yǎng)物的結(jié)果。圖2A顯示輸卵管上皮(FTE)細(xì)胞在WIT-fo培養(yǎng)基中(?藍(lán)色曲線)或在對照培養(yǎng)基中(紅色曲線)的生長。作為對照培養(yǎng)基，使用Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)和Ham F12的1:1混合物，其補(bǔ)充有5%血清。在WIT-fo培養(yǎng)基中，F(xiàn)TE細(xì)胞在其增殖速率不下降的情況下連續(xù)分裂至少120天并且實(shí)現(xiàn)24次群體倍增(籲藍(lán)色曲線)。相比之下，來自相同供體的匹配細(xì)胞在對照培養(yǎng)基(紅色曲線)中在14天內(nèi)生長停滯。圖2B顯示卵巢上皮(OSE)細(xì)胞在WIT-fo培養(yǎng)基中(籲藍(lán)色曲線)或在對照培養(yǎng)基中(紅色曲線)的生長。作為對照培養(yǎng)基，使用含10%胎牛血清、2mm L-谷氨酰胺和10ng/ml表皮生長因子的MCDB105/培養(yǎng)基199的1:1混合物。在WIT-fo培養(yǎng)基中，OSE細(xì)胞在其增殖速率不下降的情況下連續(xù)分裂至少40天并且實(shí)現(xiàn)15次群體倍增(?藍(lán)色曲線)。相比之下，來自相同供體的匹配細(xì)胞在對照培養(yǎng)基(紅色曲線)中生長停滯數(shù)周并且從未實(shí)現(xiàn)3次群體倍+?
>曰ο
[0024]圖3顯示PAX8、CK7和F0XJ1鑒定正常人卵巢的和輸卵管上皮中的特定細(xì)胞亞型。圖3A-3D顯示正常人卵巢組織；采用PAX8的福爾馬林固定石蠟包埋的(FFPE)切片的免疫過氧化物酶染色。審查來自不同患者的許多樣品表明，大部分卵巢包涵囊腫襯有PAX8+上皮(A和B中的棕色核染色)。相比之下，卵巢表面上皮幾乎總是PAX8陰性(A、C)，伴隨也可以呈PAX8陰性的偶爾包涵囊腫上皮(D)。圖3E顯示正常人輸卵管組織；FFPE切片的雙重免疫過氧化物酶染色。帶纖毛的細(xì)胞為F0XJ1+(胞核棕色)并且不帶纖毛的細(xì)胞為PAX8+(胞核紅色)。圖3F顯示正常人輸卵管組織；FFPE切片的雙重免疫過氧化物酶染色。帶纖毛的細(xì)胞為F0XJ1+ (胞核棕色)，并且不帶纖毛的細(xì)胞為角蛋白7+ (胞質(zhì)紅色)。通過依次F0XJ1-HRP (棕色)染色，隨后PAX8/CK7堿性磷酸酶(紅色)染色進(jìn)行雙重免疫染色(E，F(xiàn))(比例尺=20 μ M)。圖3G顯示培養(yǎng)的細(xì)胞系顯示出與卵巢胞囊上皮(OSE)和不帶纖毛的輸卵管上皮(FNE) —致的免疫譜。
[0025]圖4顯示正常卵巢包涵囊腫(OC)和輸卵管不帶纖毛的上皮(FN)細(xì)胞在WIT-fo培養(yǎng)基中僅存在hTERT 情況時永生化。圖4A顯示表達(dá)hTERT-gfp的OC細(xì)胞，活細(xì)胞成像(比例尺=50 μ M)。圖4Β顯示表達(dá)hTERT-gfp的FN細(xì)胞，活細(xì)胞成像(比例尺=50 μ Μ)。圖4C顯示熒光細(xì)胞輔助分選(FACS)，其中與親本卵巢上皮細(xì)胞(黑色曲線)相比，幾乎全部培養(yǎng)細(xì)胞為gfp陽性(紅色和藍(lán)色曲線)。圖4D顯示了表達(dá)hTERT (OCE)的卵巢包涵囊腫上皮細(xì)胞，所述上皮細(xì)胞在WIT-f0培養(yǎng)基(?藍(lán)色曲線)中或在對照培養(yǎng)基(含有10%胎牛血清、2mmL-谷氨酰胺和10ng/ml表皮生長因子的MCDB105/培養(yǎng)基199 (1:1混合物))( 紅色曲線)中培育。在WIT-O培養(yǎng)基中，OCE細(xì)胞在其增殖速率不下降的情況下連續(xù)分裂至少150天并且實(shí)現(xiàn)70次群體倍增(藍(lán)色線)。相比之下，來自相同供體的匹配細(xì)胞在對照培養(yǎng)基 紅色曲線)中在數(shù)天內(nèi)生長停滯。圖4E顯示了表達(dá)hTERT (FNE)的不帶纖毛的輸卵管上皮細(xì)胞，所述上皮細(xì)胞在WIT-fo培養(yǎng)基中或在對照培養(yǎng)基(Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)和Ham F12的1:1混合物，其補(bǔ)充有0.1%BSA、5%血清)( 紅色曲線)中培育。在WIT-fo培養(yǎng)基中，F(xiàn)NE細(xì)胞在其增殖速率不下降的情況下連續(xù)分裂至少150天并且實(shí)現(xiàn)40次群體倍增(?藍(lán)色曲線)。相比之下，來自相同供體的匹配細(xì)胞在對照培養(yǎng)基( 紅色曲線)中在數(shù)天內(nèi)生長停滯。
[0026]圖5顯示正常人卵巢(OCE)細(xì)胞和輸卵管(FNE)細(xì)胞的致腫瘤轉(zhuǎn)化。圖5A顯示從相同供體分離并且在步驟I中用單獨(dú)hTERT而永生化，分別產(chǎn)生OCEl和FNEl細(xì)胞的OC和FN細(xì)胞。將這些細(xì)胞在步驟2中用SV40T/t (SV40ER)并在步驟3中用突變體H_RasV12轉(zhuǎn)化成致瘤細(xì)胞，產(chǎn)生致腫瘤卵巢上皮細(xì)胞(0CLER1)和致腫瘤輸卵管上皮細(xì)胞(FNLERl)。這些實(shí)驗(yàn)用來自第二供體的細(xì)胞重復(fù)，產(chǎn)生0CLER2和FNLER2細(xì)胞。圖5B是蛋白質(zhì)免疫印跡，其與僅表達(dá)hTERT的OCE和FNE細(xì)胞中負(fù)染色相比，顯示在0CLER1/FNLER1對子(供體I)和0CLER2/FNLER2對子(供體2)中SV40LT和H-Ras蛋白的表達(dá)。圖5C顯示免疫熒光法圖像，其表明3￥40大了48(1^，胞核綠色)和H-Ras (Ras，胞質(zhì)綠色)蛋白在OCLER和FNLER細(xì)胞中相似表達(dá)。DAPI核染色；40X放大率，比例尺=50 μ M0 OCLER和FNLER細(xì)胞中的大TAg(LT，胞核綠色)和H-Ras (Ras，胞質(zhì)綠色)蛋白表達(dá)。DAPI核染色；40 X放大率，比例尺=50 μ Mo
[0027]圖6顯示免疫受損的裸鼠中的OCLER和FNLER腫瘤組織病理學(xué)。圖6Α和6Β顯示來自卵巢OCLER (a)和輸卵管FNLER (b)腫瘤異體移植物的代表性腫瘤切片的蘇木精和伊紅(H&E)染色。兩種腫瘤均優(yōu)勢地為高等級并且不良分化，然而，存在提示乳頭狀漿液性腺癌的局灶性罕見微乳頭狀結(jié)構(gòu)。圖6C和6D顯示來自O(shè)CLER(A)和FNLER(B)異體移植物的代表性FFPE腫瘤切片的PAX8免疫過氧化物酶染色證實(shí)這些腫瘤的OC和FN來源。組織學(xué)切片從福爾馬林固定、石蠟包埋(FFPE)的腫瘤組織制備，其中將所述腫瘤組織在腹內(nèi)和皮下注射細(xì)胞后5至9周外植(比例尺=20 μ Μ)。
[0028]圖7顯示FNLER腫瘤比OCLER腫瘤轉(zhuǎn)移性更強(qiáng)。圖7Α和7Β顯示福爾馬林固定、石蠟包埋(FFPE)的異體移植腫瘤的蘇木精和伊紅染色，其顯示FNLER(a)和OCLER(b)侵入小鼠胰。(比例尺=250 μ M)。圖7C顯示在熒光解剖顯微鏡上起初作為GFP陽性腫瘤結(jié)節(jié)觀察到的FNLER腫瘤從腹內(nèi)或皮下注射部位轉(zhuǎn)移至小鼠肺(比例尺=250 μ Μ)。圖7D和7Ε顯示通過Η&Ε在FFPE小鼠肺中鑒定的轉(zhuǎn)移性FNLER細(xì)胞(d)以及SV40LT陽性(e)和P53陽性(f)的染色細(xì)胞。(比例尺=50 μ M)。圖7G顯示肺轉(zhuǎn)移頻率，與OCLER腫瘤相比，該頻率對于FNLER腫瘤是顯著較高的(Ρ〈0.05,雙尾Mann-Whitney檢驗(yàn))。在總腫瘤負(fù)荷>0.5g的小鼠當(dāng)中，在體內(nèi)孵育腫瘤5-9周后比較OCLER和FNLER之間從腹內(nèi)和皮下注射部位轉(zhuǎn)移至肺的頻率。在FNLER和OCLER之間不存在腫瘤負(fù)荷或孵育時間的顯著差異。
[0029]圖8表示OCE和FNE細(xì)胞的基因表達(dá)特征標(biāo)識鑒定了人卵巢腺癌組織中的卵巢樣和輸卵管樣基因表達(dá)模式。在兩個獨(dú)立的卵巢癌數(shù)據(jù)集中驗(yàn)證10個最顯著的卵巢/輸卵管細(xì)胞源基因。圖8A顯示W(wǎng)u數(shù)據(jù)集中每個基因和臨床變量之間的關(guān)聯(lián)(8個基因因陣列平臺差異而存在于Wu數(shù)據(jù)集中)。系數(shù)>0或〈O分別表示具有更高等級、分期或漿液性亞型的每個基因的上調(diào)或下調(diào)。來自線性對數(shù)回歸(等級和分期作為有序變量)的P-值相對于假發(fā)現(xiàn)率進(jìn)行修正。圖8B中的密度曲線顯示W(wǎng)u腫瘤樣品中OV/FT樣評分的或多或少的雙峰分布，這支持劃分成OV樣腫瘤簇和FT樣腫瘤簇。圖SC顯示W(wǎng)u數(shù)據(jù)中具有臨床特征的OV樣亞組和FT樣亞組的關(guān)聯(lián)(來自對數(shù)回歸的P-值(等級、分期作為有序變量)和Fisher精確檢驗(yàn)(組織學(xué)亞型)。圖8D中的密度曲線顯示Tothill數(shù)據(jù)中0V/FT樣評分的輕微左偏移，這表明OV樣腫瘤的小亞群(箭頭)。圖SE顯示Tothill數(shù)據(jù)中具有臨床特征的OV樣亞組和FT樣亞組的關(guān)聯(lián)(p-值如(C)中計(jì)算)。圖8F顯示,Kap I an-Meier曲線展示了 Tothill數(shù)據(jù)中OV樣亞組和FT樣亞組之間存活的顯著差異(Cox比例風(fēng)險(xiǎn)P-值相對于腫瘤等級、分期和組織學(xué)亞型進(jìn)行調(diào)節(jié))。
[0030]圖9顯示，轉(zhuǎn)化細(xì)胞樣特征標(biāo)識(TCS)和永生化細(xì)胞樣特征標(biāo)識(ICS)鑒定具有不同結(jié)局的人卵巢腺癌。圖9A顯示,KapIan-Meier生存曲線顯示帶有TSC+表達(dá)特征標(biāo)識(紅線)的人卵巢癌比帶有ICS+特征標(biāo)識(藍(lán)線)的人卵巢癌具有顯著更好的總生存期(p=0.046)。如預(yù)期，Limma模型(包括FDR多種檢驗(yàn)校正)鑒定到以p〈0.05顯著性水平差異性表達(dá)的許多探針(n=17，641)。相對于細(xì)胞系中的正常比較結(jié)果，我們從腫瘤選擇1，000個最高度顯著的探針，并且直接應(yīng)用這種基因特征標(biāo)識以便使用一致性k均值聚類法來鑒定“腫瘤樣”樣品和“正常樣”樣品的(k=2)聚類，在相同的兩個獨(dú)立數(shù)據(jù)集(Tothill)中對卵巢腫瘤分類。在Tothill數(shù)據(jù)集內(nèi)136個漿液性高等級(G3)、晚期(FIG0SIII/IV)腫瘤當(dāng)中，鑒定到分別包括51份和85份樣品的具有高聚類穩(wěn)定性的兩個聚類(聚類一致性=0.89和0.94)。圖9B顯示通過k均值聚類法，將Tothill數(shù)據(jù)集中的51份樣品鑒定為表達(dá)“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞特征標(biāo)識” (TSC)，并且將85份樣品鑒定為具有永生化細(xì)胞特征標(biāo)識(ICS)。從我們劃歸為TCS的51個病例中，僅3個病例由Tothill劃歸為不良預(yù)后(Cl)，并且46/85ISC腫瘤由Tothill劃歸為不良預(yù)后(Cl)。
[0031]圖10顯示卵巢腫瘤在新開發(fā)的WIT-OC培養(yǎng)基對常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基中的培養(yǎng)。在圖1OA中，將原發(fā)性卵巢乳頭狀漿液性癌組織(OC1-Ula)鋪種至WIT-oc (?藍(lán)色曲線)或含10%血清的MCDB-105/M199( Λ綠色曲線)或含10%血清的RPMI1640 ( 紅色曲線)中。將細(xì)胞每周計(jì)數(shù)并傳代至新瓶中。在?周后，MCDB-105/M199和RPM1-1640培養(yǎng)基中的幾乎全部細(xì)胞被殺死(綠線和紅線)。相比之下，在WIT-oc中的細(xì)胞以恒定速率生長并且當(dāng)實(shí)驗(yàn)停止時，實(shí)現(xiàn)至少30次群體倍增。一個克隆在約第90日出現(xiàn)在RPM1-1640中(紅線)并且被確立為永久細(xì)胞系。在圖1OB中，在WIT-oc和RPMI中培育的OC1-Ula腫瘤細(xì)胞的基因組DNA與原始腫瘤借助比較基因組雜交(CGH)陣列分析進(jìn)行比較。全基因組CGH跡線揭示出與未培養(yǎng)的腫瘤樣品(中部跡線)相比，在RPMI中培育的腫瘤細(xì)胞中獲得(擴(kuò)增，紅色箭頭)和失去(缺失，綠色箭頭)的幾個峰。相比之下，在WIT-oc中培育的腫瘤細(xì)胞的CGH樣式與未培養(yǎng)的腫瘤(分別地是底部和中部CGH跡線)顯著更相似。在圖1OC中，將卵巢透明細(xì)胞癌細(xì)胞(0C1-5CX)在WIT-oc培養(yǎng)基(?藍(lán)色曲線)中培育至少60次群體倍增。在對照培養(yǎng)基(含10%血清的DME:F12)中，細(xì)胞生長停滯并且在30-40日內(nèi)死亡 紅色曲線)。
[0032]圖11顯示輸卵管卵巢腫瘤細(xì)胞系(OCI)不能在ATCC/ECACC推薦的標(biāo)準(zhǔn)卵巢腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)。圖1IA顯示在WIT-OC培養(yǎng)基對補(bǔ)充有15%血清的McCoy’ s5A、MCDB105/M199或RPM1-1640培養(yǎng)基中鋪種的相等數(shù)目的OCI系(706、29和4)。細(xì)胞在培養(yǎng)5天后計(jì)數(shù)。OCI細(xì)胞系在這些標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中迅速致死并且不可能進(jìn)行培養(yǎng)。圖1lB顯示在WIT-oc培養(yǎng)基對補(bǔ)充有15%血清的McCoy’ s5A、MCDB105/M199或RPM1-1640培養(yǎng)基中鋪種的相等數(shù)目的ATCC/ECACC卵巢癌細(xì)胞系(SK0V-3、0V-90和A2780)。細(xì)胞在培養(yǎng)5天后計(jì)數(shù)。全部ATCC/ECACC卵巢癌細(xì)胞系均在WIT-oc培養(yǎng)基以及它們的推薦培養(yǎng)基中增殖。A2780細(xì)胞在WIT-oc中比推薦的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中增殖得更好。
[0033]圖12顯示了概括原始腫瘤的OCI異體移植物的組織病理學(xué)。福爾馬林固定石蠟包埋的原發(fā)性腫瘤和異體移植腫瘤組織切片用蘇木精和伊紅染色。圖12A顯示ECACC卵巢癌細(xì)胞系SK0V3的腫瘤異體移植物切片。圖12B顯示ATCC卵巢癌細(xì)胞系0V90的腫瘤異體移植物切片。不存在源自ATCC系的異體移植腫瘤(A-B)的特定構(gòu)造。不存在人腺癌的常見特征如腺體、乳突、間質(zhì)芯、黏蛋白或激素受體表達(dá)、促結(jié)締組織增生性基質(zhì)。這些腫瘤幾乎完全由腫瘤細(xì)胞片組成并且具有與組織培養(yǎng)中的細(xì)胞相似的外觀。圖12C顯示源自人乳頭狀漿液性腺癌(PSC)的0C1-P9a系的腫瘤異體移植物切片。注意間質(zhì)芯和乳頭狀構(gòu)造的清晰存在。圖12D顯示源自人子宮內(nèi)膜樣腺癌的OC1-Elp系的腫瘤異體移植物切片。注意腺體的清晰存在。插圖:免疫組織化學(xué)證實(shí)在這些異體移植腫瘤中與子宮內(nèi)膜樣表型一致的雌激素受體和黏蛋白表達(dá)。圖12E顯示0C1-P9a源自其中的人PSC腫瘤組織的原始腫瘤切片。注意間質(zhì)芯和乳頭狀構(gòu)造。圖12F顯示OC1-Elp系源自其中的人子宮內(nèi)膜樣腺癌組織的原始腫瘤切片。
[0034]圖13顯示采用SNP陣列分析的OCI系對原始腫瘤組織的比較。來自12種原發(fā)性未培養(yǎng)腫瘤(T，黑色)和在WIT-oc培養(yǎng)基中源自這些腫瘤的12個連續(xù)輸卵管卵巢細(xì)胞系(0CI，紅色)以及9個ATCC/ECACC系(藍(lán)色)的基因組DNA雜交至25OAffymetrix SNP陣列，并且用Genechip分析 結(jié)果。藍(lán)色=拷貝數(shù)改變或雜合性喪失，黃色=DNA改變不可檢。注意在這個非監(jiān)督層次聚類分析中，每個OCI細(xì)胞系聚類相鄰于其未培養(yǎng)的親本原發(fā)性腫瘤樣品。因此，將每個細(xì)胞系正確地鑒定為最相似于其親本的原始腫瘤組織。與ATCC/ECACC卵巢癌細(xì)胞系相比，OCI系中的絕大部分改變涉及顯著較短的染色體區(qū)段。盡管OC1-Ulp和0C1-P3a具有巨大的區(qū)段改變，但是這似乎是衍生它們的原始腫瘤的特征并且不是細(xì)胞培養(yǎng)人為假象的結(jié)果(分別地是TUl和TP3)。
[0035]圖14顯示OCI系的基因表達(dá)譜概括了培養(yǎng)下的人卵巢腺癌的臨床亞組。用Affymetrix U133Plus芯片測量OCI系、正常卵巢-輸卵管細(xì)胞和ATCC/ECACC卵巢癌系的mRNA表達(dá)水平的非監(jiān)督層次聚類(紅色=高表達(dá)，藍(lán)色=表達(dá))。注意正常卵巢細(xì)胞和輸卵管細(xì)胞(藍(lán)色比例尺)、源自乳頭狀漿液性(紅色比例尺)腫瘤和透明細(xì)胞(綠色)腫瘤的OCI系形成不同的聚類。ATCC/ECACC卵巢癌細(xì)胞系形成與其他OCI系分離的不同聚類(黑色)，例外是幾種透明細(xì)胞OCI系(粉紅色)。
[0036]圖15顯示OCI系的蛋白質(zhì)組圖譜概括了培養(yǎng)下的人卵巢腺癌的臨床亞組。實(shí)施OCI系的反相蛋白質(zhì)驗(yàn)定(RPPA)分，檢查>200個蛋白質(zhì)的表達(dá)。RPPA是一種高通量和定量性蛋白質(zhì)組技術(shù)，它允許同時定量分析數(shù)百種蛋白質(zhì)的差異性表達(dá)。通過將來自細(xì)胞的蛋白質(zhì)提取物的連續(xù)稀釋物以陣列方式印刷在載玻片或膜上并用單一抗體探測該陣列，實(shí)施這些測定法。將抗體對陣列上每個點(diǎn)的特異性結(jié)合定量和作圖。OCI系的RPPA分析揭示，從不同腫瘤類型建立的細(xì)胞系形成單獨(dú)的聚類，類似于mRNA表達(dá)譜。這些結(jié)果表明，培養(yǎng)的細(xì)胞必須在培養(yǎng)時保留顯著水平的細(xì)胞生物學(xué)信息，所述細(xì)胞生物學(xué)信息允許它們的分子特征被識別為正常卵巢細(xì)胞和輸卵管細(xì)胞(藍(lán)色比例尺)、透明細(xì)胞腫瘤(綠色比例尺)、子宮內(nèi)膜樣腫瘤(粉紅色比例尺)和乳頭狀漿液性腫瘤(紅色比例尺)。一些OCI系不與其自身的組織型聚類；這可能反映迄今未認(rèn)識的分子亞型或這些主要組織型的變體。由于這個數(shù)據(jù)集中僅存在一個示例粘液癌、癌肉瘤和繆勒氏管癌(黃色)，不能評估這些細(xì)胞類型根據(jù)腫瘤來源聚類的能力。這些實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果相似。
[0037]圖16顯示與ATCC/ECACC系相比，OCI系中顯著差異的藥物反應(yīng)。圖16A顯示在96孔平板中的WIT-oc培養(yǎng)基(5000個細(xì)胞/孔)中一式三份鋪種的ATCC/ECACC卵巢腫瘤系(SK0V3、0V90、T0V-1120 和 A2780)和 OCI 卵巢腫瘤系(C5x、P9al、P7a 和 FC1-Plp)。次日，將MAPK抑制劑U0126的連續(xù)稀釋物添加至該平板。與藥物孵育144小時后，用阿爾瑪藍(lán)測定法將活細(xì)胞數(shù)度量為590/530熒光。在MAPK抑制劑對OCI細(xì)胞系與ATCC/ECACC細(xì)胞系的影響方面存在顯著差異。如預(yù)期，在OCI中減少細(xì)胞目50% (LD5tl)的U0126濃度對于大部分ATCC/ECACC細(xì)胞是大約5uM。然而，令人驚訝地大部分OCI系至少5_6時倍地抵抗MAPK抑制作用(LD5Q>30uM)。圖16B顯示在平板中的WIT-oc培養(yǎng)基(5000個細(xì)胞/孔)中一式三份鋪種的OCI卵巢腫瘤系(P7a、P2a、C2p)和ATCC/ECACC卵巢腫瘤系(ES2和0V90)。次日，將紫杉醇的連 續(xù)稀釋物添加至該平板。與藥物孵育72小時后，用阿爾瑪藍(lán)測定法將活細(xì)胞度量為590/530熒光。圖16C顯示在平板中的WIT-oc培養(yǎng)基(5000個細(xì)胞/孔)中一式三份鋪種的OCI卵巢腫瘤系(P7a、P2a、C2p)和ATCC/ECACC卵巢腫瘤系(ES2和0V90)。次日，將順鉬的連續(xù)稀釋物添加至該平板。與藥物孵育72小時后，用阿爾瑪藍(lán)測定法將活細(xì)胞度量為590/530熒光。在紫杉醇或順鉬對OCI細(xì)胞系與ATCC/ECACC細(xì)胞系的影響方面存在明顯差異。與ATCCC/ECACC系相比，這些藥物的導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞數(shù)目下降50%的濃度(LD90)在OCI系中高出超過6倍。
[0038]圖17是OCI和ATCC/ECACC卵巢腫瘤細(xì)胞系基因表達(dá)與人卵巢腫瘤的比較。圖17A顯示37種細(xì)胞和285種人組織的基因表達(dá)數(shù)據(jù)的層次聚類。選擇至少4種細(xì)胞中表達(dá)水平相對于組織之間的中位數(shù)值具有至少2倍差異的基因用于層次聚類分析(3，831個基因特征)。數(shù)據(jù)以其中列代表各個基因并且行代表每種組織的矩陣格式展示。矩陣中的每個小室代表個體組織中基因特征的表達(dá)水平。小室中的紅色和綠色分別反映相對高和低的表達(dá)水平，如以比例尺指示(對數(shù)2轉(zhuǎn)換比例尺)。紫色比例尺=人腫瘤樣品，紅色比例尺為OCI腫瘤系，藍(lán)色比例尺為ATCC卵巢腫瘤系+與ATCC系共聚類的OCI系。圖17B顯示小圖a中人卵巢腫瘤的臨床總生存期分析數(shù)據(jù)。具有類似于OCI系的基因表達(dá)譜的人腫瘤擁有比具有類似于ATCC系的基因表達(dá)譜的人腫瘤更差的結(jié)局。
[0039]圖18顯示已經(jīng)在WIT-oc培養(yǎng)基中成功培育的其他腫瘤類型的幾種例子。在圖18A-18B中，是已經(jīng)從乳腺的人浸潤性導(dǎo)管癌的兩個不同樣品中建立的腫瘤細(xì)胞系的顯微鏡圖像。在圖18C-18D中，是已經(jīng)從頭頸腫瘤腺樣囊性癌的兩個不同樣品中建立的腫瘤細(xì)胞系的顯微鏡圖像。在圖18E-18F中，是已經(jīng)從肺的人神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(類癌)的兩個不同樣品中建立的腫瘤細(xì)胞系的顯微鏡圖像。
[0040]詳細(xì)說明
[0041]1.細(xì)胞培養(yǎng)物[0042]A.培養(yǎng)基的組成
[0043]本發(fā)明涉及支持原代細(xì)胞(包括卵巢上皮細(xì)胞和輸卵管上皮細(xì)胞)和腫瘤細(xì)胞(包括卵巢腫瘤細(xì)胞)體外長期生長和增殖的細(xì)胞培養(yǎng)基。短語“細(xì)胞培養(yǎng)基”、“培養(yǎng)基”(復(fù)數(shù)形式“多種培養(yǎng)基”在每種情況下)和“培養(yǎng)基制劑”指用于培育細(xì)胞的營養(yǎng)溶液并且可以互換地使用。
[0044]在本文所述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞可以在不喪失分化潛能的情況下在這種培養(yǎng)基中生長至少4周(或15次群體倍增)，至多到幾個月。在一個實(shí)施方案中，主題培養(yǎng)基支持卵巢上皮細(xì)胞和輸卵管上皮細(xì)胞和/或已經(jīng)用端粒酶轉(zhuǎn)染的卵巢細(xì)胞和輸卵管細(xì)胞在體外長期生長和增殖至少約15周或至少約35次群體倍增(ro)，而沒有任何額外的可檢測的遺傳改變，或喪失分化潛能。在另一個實(shí)施方案中，主題培養(yǎng)基支持這些細(xì)胞在培養(yǎng)下生長和增殖至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15周或更長時間。類似地，主題培養(yǎng)基可以支持源自人腫瘤組織、源自惡性體液內(nèi)腫瘤細(xì)胞的原代細(xì)胞系和/或在動物模型中體外培育至少約15周或至少約14、25或甚至35次群體倍增(PD)的腫瘤的原代異體移植物生長，而沒有任何額外的可檢測的遺傳改變或者喪失其表型(形態(tài)學(xué)、結(jié)構(gòu)和/或分子等表型)和/或組織病理學(xué)。在另一個實(shí)施方案中，主題培養(yǎng)基支持這些細(xì)胞在培養(yǎng)下生長和增殖至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 周或更長時間。
[0045]本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基是水基的(還可以從干燥粉末和/或冷凍的組分復(fù)水)，包含在水、液體和/或水溶液中的許多成分。
[0046]術(shù)語“成分”指可以在細(xì)胞培養(yǎng)基中用來維持或促進(jìn)細(xì)胞生長或增殖的任何化合物，無論是化學(xué)來源或生物學(xué)來源。術(shù)語“組分”、“養(yǎng)分”和“成分”可以互換使用并且均意指這類化合物。細(xì)胞培養(yǎng) 基中使用的常見成分包括氨基酸、鹽、金屬、糖、脂類、核酸、激素、維生素、脂肪酸、蛋白質(zhì)等。促進(jìn)或維持離體培養(yǎng)細(xì)胞的其他成分可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)具體需要選擇。
[0047]“細(xì)胞培養(yǎng)”或“培養(yǎng)”意指在人工、體外環(huán)境中細(xì)胞的維持。然而，應(yīng)當(dāng)理解，術(shù)語“細(xì)胞培養(yǎng)”是一個類屬術(shù)語并且可以用來不僅包括培養(yǎng)單個細(xì)胞，還包括培養(yǎng)組織、器官、器官系統(tǒng)或完整器官，就此而言，術(shù)語“組織培養(yǎng)”、“器官培養(yǎng)”、“器官系統(tǒng)培養(yǎng)”或“器官培養(yǎng)”可以偶爾與術(shù)語“細(xì)胞培養(yǎng)”互換地使用。
[0048]在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基基本上不含一種或多種指定的組分。在某些實(shí)施方案中，“基本上不含”指組分的對細(xì)胞生長和/或分化狀態(tài)不產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)顯著影響的低量。在一些實(shí)施方案中，“基本上不含”指小于1%、0.1%、0.01%、0.001%或0.0001%v/v的液體或w/
V的溶質(zhì)。在一些實(shí)施方案中、“基本上不含”指小于0.001,0.0001,0.00001,0.000001或
0.0000001mg/L的濃度。在一些實(shí)施方案中，“基本上不含”指小于10nM、InM、100pM、IOpM或IpM的濃度。
[0049]在本發(fā)明的一個方面、主題細(xì)胞培養(yǎng)基包含:(I) 一種或多種抗氧化劑；(2) —種或多種核苷酸補(bǔ)救途徑合成前體；(3) —種或多種脂質(zhì)合成前體；(4) 一種或多種蛋白質(zhì)合成前體；(5) —種或多種糖合成和能量代謝前體；(6) —種或多種緩沖液(非必需)；(7) —種或多種陽離子(一價和/或二價)、離子、微量金屬和酶輔因子；(8) —種或多種載體蛋白(如牛血清白蛋白)；(9) 一種或多種去垢劑(如Tween80) ； (10) 一種或多種誘導(dǎo)胞內(nèi)3’_5’環(huán)狀腺苷單磷酸(cAMP)水平增加的試劑；(11) 一種或多種激素和生長因子和/或(12)血清。在其他實(shí)施方案中，一種或多種上文所列的組分可以省略，條件是所產(chǎn)生的培養(yǎng)基支持細(xì)胞s如正常卵巢細(xì)胞和輸卵管細(xì)胞和/或腫瘤細(xì)胞如卵巢腫瘤細(xì)胞體外生長和/或增殖至少約4周或至少約15、25或甚至35次群體倍增(PD)。
[0050]因此，本發(fā)明的培養(yǎng)基包含一種或多種抗氧化劑；核苷酸合成和補(bǔ)救途徑前體；脂質(zhì)合成前體；胞內(nèi)cAMP水平激動劑；激素和生長因子；和血清。該培養(yǎng)基可以額外地包含其他組分如氨基酸補(bǔ)充物、細(xì)胞生長/增殖必需的維生素、微量礦物質(zhì)、無機(jī)鹽、能量源(例如用于糖酵解)和其他組分如PH指示劑等。換而言之、本發(fā)明的成分可以包括氨基酸、維生素、無機(jī)鹽、腺嘌呤、D-葡萄糖、N-[2-羥乙基]哌嗪-N’ -[2-乙磺酸](HEPES)、氫化可的松、胰島素、硫辛酸、酚紅、磷脂酰乙醇胺、腐胺、丙酮酸鈉、三碘甲腺原氨酸(T3)胸苷和轉(zhuǎn)鐵蛋白。這些成分的每一種可以商業(yè)地獲得，例如從Sigma(SaintLouis, MO)獲得。
[0051]盡管不希望受任何具體理論約束，但是抗氧化劑通常有助于猝滅據(jù)信總體上有損于細(xì)胞生長的自由基。本發(fā)明的抗氧化劑可以包括而不限于以下一種或多種:胡蘿卜素、維生素Ε、維生素C(抗壞血酸)、維生素Κ3、谷胱甘肽(還原型)、煙酸(或煙酰胺)或DTT (二硫蘇糖醇)?？寡趸瘎┛梢匀芜x地補(bǔ)充有微量金屬，包括Zn、Se、Cr、Cu、Mg或Mn。
[0052]在此，不希望受理論約束，微量礦物質(zhì)可能對于某些酶的構(gòu)造必需的。例如，谷胱甘肽過氧化物酶使用硒并且谷胱甘肽超氧化物酶使用銅作為輔因子。推測在其中存在大自由基載量的疾病中，可能在特定的微環(huán)境存在這些微量元素的不足。微量礦物質(zhì)的存在可以有益于酶性抗氧化劑(它可能已經(jīng)缺少輔因子)。因此，微量礦物質(zhì)的存在可以允許宿主有效利用酶性抗氧化劑。由于已知鋅可以上調(diào)超氧化物歧化酶并且硒可以上調(diào)谷胱甘肽過氧化物酶，在給定的微環(huán)境中增加微量礦物質(zhì)將導(dǎo)致這種微環(huán)境中酶抗氧化劑的增加。酶性抗氧化劑的凈增加和增加兩親抗氧化劑將進(jìn)一步減少對組織或細(xì)胞的氧化性損傷，以及歸因于自由基的其他有害作用。
[0053]因此，可能在本發(fā)明的培養(yǎng)基中有益的許多無機(jī)鹽成分、陽離子、離子、微量金屬和維生素包括鈣鹽(例如CaC`l2)、CuSO4' FeSO4' KC1、鎂鹽(例如、MgCl2)、乙酸鈉、NaCl,NaHC03> Na2HPO4, Na2SO4和微量元素硒和鋅的離子。任選地，額外的無機(jī)鹽成分可以包括錳鹽(例如，MnCl2)、硅、鑰、釩、鎳和錫。
[0054]這些微量元素可以按多種形式提供，優(yōu)選地以鹽形式如Na2SeOjP ZnSO或Na2SiO3、(NH4) 6Mo7024、NH4VO3、NiSO4、SnCl2，用于任選的鹽。這些無機(jī)鹽和微量元素可以商業(yè)地獲得，例如從Sigma(SaintLouis, MO)獲得。
[0055]可以在本發(fā)明的培養(yǎng)基中包含的維生素成分包括生物素、氯化膽堿、D-Ca++泛酸鹽、葉酸、1-肌醇、煙酰胺、吡多醇、核黃素、硫胺素和維生素A和Β12。這些維生素可以商業(yè)地獲得，例如從Sigma(SaintLouis, MO)獲得。
[0056]蛋白質(zhì)合成前體包括氨基酸成分。在一個實(shí)施方案中，可以在本發(fā)明的培養(yǎng)基中包含的氨基酸成包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺，甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-纈氨酸。這些氨基酸可以商業(yè)地獲得，例如從Sigma(SaintLouis, MO)獲得。
[0057]可選地，在一些其他實(shí)施方案中，在本發(fā)明的培養(yǎng)基中僅包含必需氨基酸。某些細(xì)胞，如人細(xì)胞必須具有足夠量的9種氨基酸以存活。這些所謂“必需氨基酸”不能從其他前體合成。然而，半胱氨酸可以部分地滿足甲硫氨酸的需要(它們均含有硫)，并酪氨酸可以部分地替代苯丙氨酸。這類必需氨基酸包括:組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸(和/或半胱氨酸)、苯丙氨酸(和/或酪氨酸)、蘇氨酸、色氨酸、和纈氨酸。在某些實(shí)施方案中，僅包含組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸。
[0058]上述成分的一些或全部，在溶液中混合在一起時，可以形成“基礎(chǔ)培養(yǎng)基”。向這種基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加其他組分，如至少一種核苷酸合成和/或補(bǔ)救途徑前體(例如次黃嘌呤)、表皮生長因子(EGF)、至少一種增加胞內(nèi)環(huán)狀腺苷單磷酸(cAMP)水平的試劑和至少一種激素和至少一種蛋白質(zhì)以配制本發(fā)明的完全培養(yǎng)基。這些后來添加的組分，如EGF和增加cAMP的試劑可以添加至新鮮配制的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，或它們可以作為母液預(yù)混，所述母液冷凍貯存，優(yōu)選地在約-20°C至約-70°C，直至添加至基礎(chǔ)培養(yǎng)基以配制出本發(fā)明的完全培養(yǎng)基。這種完全培養(yǎng)基可以在動物細(xì)胞培養(yǎng)基中的包含BPE或其他器官/腺體提取物以實(shí)現(xiàn)所需的細(xì)胞生長和增殖，或可以在動物細(xì)胞培養(yǎng)基中基本上不含BPE或其他器官/腺體提取物。也可以將這種預(yù)混物制備為1-1000 X制劑，最優(yōu)選地制備為I X、100X、500 X或1000X制劑，所述制劑隨后適當(dāng)?shù)叵♂屓肱囵B(yǎng)基中以提供本發(fā)明的完全培養(yǎng)基中的IX最終制劑。
[0059]本發(fā)明的培養(yǎng)基也可以包含一種或多種激素，如:孕酮、睪酮、氫化可的松或雌激素，和/或一種或多種生長因子如:胰島素和EGF (表皮生長因子)。[0060]例如，本發(fā)明的培養(yǎng)基可以包含EGF，其可以是天然或重組的，并且可以是人或嚙齒類的。商業(yè)可獲得的EGF (例如，從GIBCO/LTI，Gaithersburg，MD獲得)根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)的方法學(xué)從天然來源分離或通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的(美國專利號4，743，679)。為配制本發(fā)明的培養(yǎng)基，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將EGF添加至培養(yǎng)基(如表3中所示的培養(yǎng)基)以達(dá)到約0.00001-10mg/L，優(yōu)選地約0.0005-lmg/L的終濃度。
[0061]本發(fā)明的培養(yǎng)基也可以包括可在核苷酸的補(bǔ)救途徑合成中使用的核苷酸類似物前體，如次黃嘌呤、黃嘌呤、腺嘌呤、鳥嘌呤和胸苷。
[0062]本發(fā)明的培養(yǎng)基也可以包括脂質(zhì)合成前體，如:膽固醇、亞油酸、硫辛酸或O-磷酰
基乙醇胺。
[0063]本發(fā)明的培養(yǎng)基也包含一種或多種cAMP激動劑或增加胞內(nèi)cAMP水平的試劑。多種此類試劑可以用于配制本發(fā)明的培養(yǎng)基。包括誘導(dǎo)胞內(nèi)cAMP水平直接增加的試劑(例如，二丁酰cAMP)、通過相互作用于細(xì)胞G-蛋白而造成胞內(nèi)cAMP水平增加的試劑(例如，霍亂毒素和毛喉素)、通過作為β -腎上腺素能受體的激動劑發(fā)揮作用而造成胞內(nèi)cAMP水平增加的試劑(例如，異丙腎上腺素)和通過抑制cAMP磷酸二酯酶的活性而造成胞內(nèi)cAMP水平增加的試劑(例如，異丙基甲基黃嘌呤(IBMX)和茶堿)。最優(yōu)選用于配制本發(fā)明培養(yǎng)基的是霍亂毒素。這些增加cAMP的試劑是商業(yè)可獲得的，例如從Sigma (St.Louis, M0.)獲得，并且以接近于 Green(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA15:801_811 (1978))中所述的濃度使用。例如，將霍亂毒素以約0-0.01mg/L、優(yōu)選地約0-0.001mg/L和最優(yōu)選地約0-0.0001mg/L的濃度添加至上文描述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基?？梢蕴砑佣□AMP、IBMX、異丙腎上腺素等以實(shí)現(xiàn)與霍亂毒素相同的cAMP水平。
[0064]也合乎需要的是通過多種試劑如霍亂毒素、毛喉素、G蛋白偶聯(lián)受體激動劑、PKC激動劑增加胞內(nèi)cAMP水平。此外，細(xì)胞可以具有應(yīng)答于激動劑異丙腎上腺素(Iso)、前列腺素E(2) (PGE(2))、某些前列腺素類受體激動劑(貝前列腺素、布他前列腺素)和腺苷受體激動劑而增加的cAMP。此外，6型AC的過量表達(dá)或抑制環(huán)狀核苷酸磷酸二酯酶的試劑增加細(xì)胞cAMP水平。
[0065]主題培養(yǎng)基也可以包含一種或多種糖合成和能量代謝前體，如D-葡萄糖、丙酮酸納等。
[0066]主題培養(yǎng)基也可以包含一種或多種載體蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)。載體蛋白可以是一種蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)特定物質(zhì)穿過該蛋白質(zhì)包埋于其中的細(xì)胞膜并進(jìn)入細(xì)胞?？赡芤蟛煌妮d體蛋白以轉(zhuǎn)運(yùn)不同的物質(zhì)，因?yàn)閷⒚糠N載體蛋白設(shè)計(jì)成識別僅一種物質(zhì)，或成組的相似物質(zhì)。某些載體蛋白可以與一種或多種培養(yǎng)基組分(如生長因子等)結(jié)合并且賦予它們在培養(yǎng)基中的額外穩(wěn)定性，或促進(jìn)某些生物學(xué)過程(例如?；d體蛋白、固醇載體蛋白、激素載體蛋白等)。
[0067]主題培養(yǎng)基也可以包含一種或多種表面活性劑，如非離子表面活性劑TweeneO或TweenSO0再次，不希望受任何具體理論約束，這類去垢劑組分可以有助于潤濕、增溶、乳化或分散某些培養(yǎng)基組分。例如，它們可以防止蛋白質(zhì)如BSA的聚集、增加某些組分的溶解并且可以甚至增強(qiáng)某些酶的功能。
[0068]雖然不認(rèn)為是必需的，但主題培養(yǎng)基可以額外地包含一種或多種緩沖體系，如HEPES和碳酸氫鈉緩沖體系，從而在長期培養(yǎng)下維持平衡的pH。培養(yǎng)基的經(jīng)常、恒定或連續(xù)變化也可以有助于恢復(fù)快速生長的細(xì)胞中的介質(zhì)pH。
[0069]為了解釋， 下表3顯示本發(fā)明的三種培養(yǎng)基制劑的示例性組成，所述培養(yǎng)基制劑支持(I)源自乳頭狀漿液性腫瘤、透明細(xì)胞腫瘤、癌肉瘤或無性細(xì)胞瘤的卵巢腫瘤細(xì)胞系，
(2)源自子宮內(nèi)膜樣腫瘤或粘液性腫瘤的卵巢腫瘤細(xì)胞系，和(3)正常卵巢或輸卵管細(xì)胞的長期生長和增殖。這些培養(yǎng)基支持這些細(xì)胞類型的體外生長和增殖至少約4周或至少約15次群體倍增(PD)，同時表型(形態(tài)學(xué)、結(jié)構(gòu)和/或分子等表型)和/或組織病理學(xué)與衍生這些細(xì)胞的原始腫瘤不可區(qū)分。
[0070]成纖維細(xì)胞和其他間質(zhì)細(xì)胞的百分比在幾次傳代和群體倍增劇烈下降，到不能檢測到可察覺量的成纖維細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞分化標(biāo)記(例如波形纖維蛋白)的程度。例如，上皮分化標(biāo)記可以包括角蛋白8、角蛋白10、角蛋白14、角蛋白18、角蛋白19、E-f丐黏著蛋白、p63、SMA (平滑肌肌動蛋白)和β-聯(lián)蛋白。
[0071]離體組織培養(yǎng)使細(xì)胞暴露于誘導(dǎo)ρ53和ρ16基因的氧化性損傷、代謝應(yīng)激和DNA損傷，所述Ρ53和ρ16基因轉(zhuǎn)而誘導(dǎo)細(xì)胞停滯、衰老和/或凋亡，限制培養(yǎng)細(xì)胞的壽命。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)基支持原代細(xì)胞的長期無應(yīng)激生長和增殖。在主題培養(yǎng)基中的這類無應(yīng)激生長的一種指標(biāo)由低/不可檢測的CDK抑制劑ρ16和腫瘤抑制基因ρ53表達(dá)水平指示。一般在應(yīng)激的細(xì)胞中而不在組織培養(yǎng)培養(yǎng)基中健康生長的細(xì)胞中誘導(dǎo)這兩種蛋白質(zhì)以高水平表達(dá)。在這個實(shí)施方案中，細(xì)胞可以在37°C、5%C02和變動的O2濃度，例如，1%、2%、3%、或環(huán)境空氣下培育。
[0072]在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)基基本上不含選自以下的至少一種成員:肝素、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)和牛垂體提取物(ΒΡΕ)。在某些實(shí)施方案中，上文所列的組分均不存在于主題培養(yǎng)基中。
[0073]然而，主題培養(yǎng)基可以在某些實(shí)施方案中包含一種或多種這類組分和忍受其存在到這種程度，從而這類組分基本上不影響培養(yǎng)基在支持原代細(xì)胞生長和增殖方面性能。
[0074]本發(fā)明提供表3的培養(yǎng)基的實(shí)施方案，其中具有下限為O的濃度范圍的任一種或多種組分不存在，和其中存在這類組分的實(shí)施方案。應(yīng)當(dāng)理解如表3中列出的本發(fā)明培養(yǎng)基是僅起到說明目的。雖然對于某些預(yù)期目的、尤其培養(yǎng)本文中與每種制劑相關(guān)的細(xì)胞類型，培養(yǎng)基本身是足夠的，但是這些表中列出的全部組分并非均可以對其預(yù)期目的是必需或甚至是最佳的。部分地根據(jù)所討論問題中對特定原代細(xì)胞的需要，技術(shù)人員可以通過以下方式容易地確定任何列出的組分是否為必需和/或最佳:例如消除一種組分或一次改變一種組分的濃度并且與原始培養(yǎng)基比較特定類型的培養(yǎng)細(xì)胞在這種修改的培養(yǎng)基中的生長/增殖。當(dāng)需要時，一種或多種組分也可以由具有相似特性的其他化學(xué)品替換。不含一種或多種非必需/非必要組分的這類修改的培養(yǎng)處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。類似地、技術(shù)人員也可以通過以下方式確定任何給定組分相對于特定細(xì)胞類型的最佳水平，例如，基于所列每種組分的所列濃度或從該濃度開始，測試這種特定組分的濃度范圍(例如、10%、25%、50%、75%、100%、2-、5-、10-、20-、50-、100-、200-、500-、1000 倍更高的濃度，或 10%、25%、50%、75%、100%、2-、5-、10-、20-、50-、100-、200-、500-、1000倍更低的濃度)。一些組分具有所列出的濃度范圍。也可以從所列濃度開始，類似地確定任何特定細(xì)胞類型的適宜或最佳濃度。在進(jìn)行這類測試時，初始的寬濃度測試可以基于初始試驗(yàn)的結(jié)果稍后收窄。例如，對于初始測試，可以改變目的組分的濃度至10' 10_2、10—1、10倍、100倍和1000倍于表3中列出濃度。如果10_2測試仍支持所需的生長，而10_3不能，則可以第二輪試驗(yàn)中進(jìn)一步探索10_2和10_3之間的10倍濃度差異，以確定最佳范圍。因此，針對特定細(xì)胞類型如此優(yōu)化的培養(yǎng)基也處于本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0075]如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將是明顯的，可以增加或減低給定成分的濃度超出公開的范圍，并且可以僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)法確定增加或減低的濃度的作用。可以使用 Ham(Ham, Methods for Preparation of Media, Supplements and Substratafor Serum-Free Anima l Culture, Alan R.Liss, Inc., New York,第 3-21 頁,1984)和 Waymouth(Waymouth, C.，Methods for Preparation of Media, Supplements andSubstrata for Serum-Free Animal Culture, Alan R.Liss, Inc., New York,第 23-68頁，1984)描述的方案實(shí)施用于任何特定細(xì)胞類型的現(xiàn)存培養(yǎng)基制劑的優(yōu)化。一般通過經(jīng)驗(yàn)性研究以單一組分滴定研究，或通過解釋歷史和當(dāng)前科學(xué)文獻(xiàn)確定培養(yǎng)基成分的最佳終濃度。在單一組分滴定研究中，使用動物細(xì)胞，變動單一培養(yǎng)基組分的濃度，同時全部其他組分和變量保持恒定，并且測量單一組分對動物細(xì)胞的生存力、生長或持續(xù)健康的影響。
[0076]應(yīng)當(dāng)理解如本領(lǐng)域已知，本文中列出的某些維生素和激素可以按不同形式存在(例如，不同的天然存在或非天然存在形式)，并且可以用作彼此的代用品。也將理解其中本申請公開一種維生素或激素的情況下，應(yīng)當(dāng)將本發(fā)明理解為包括這類實(shí)施方案，其中在本發(fā)明的培養(yǎng)基和/或方法中使用這類維生素或激素的具有相似生物活性的任何形式(或可以細(xì)胞培養(yǎng)基或胞內(nèi)經(jīng)修飾或代謝以提供生物活性形式的化合物)。
[0077]可以理解化合物如雌激素、孕酮、甲狀腺激素、氫化可的松、胰島素等可以由分別作為雌激素受體、孕酮受體、甲狀腺激素受體、糖皮質(zhì)激素受體、胰島素受體的激動劑的其他化合物(天然存在的或非天然存在的、從天然來源分離或至少部分地化學(xué)合成)完全或部分替換。許多這類化合物是本領(lǐng)域已知的。[0078]培養(yǎng)基成分可以溶解于液體載體中或以干燥形式維持。如果以上文顯示的優(yōu)選濃度溶解于液體載體中(即，“IX制劑”)，則培養(yǎng)基的PH應(yīng)當(dāng)調(diào)節(jié)至約7.0-7.6、優(yōu)選地約7.1-7.5和最優(yōu)選地約7.2-7.4。培養(yǎng)基的克分子滲透壓濃度也應(yīng)當(dāng)調(diào)節(jié)至約275-350m0sm、優(yōu)選地約285_325m0sm和最優(yōu)選地約280-310m0sm。液體載體的類型和用來將成分溶解入溶液中的方法可變，并且可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在進(jìn)行不多于常規(guī)實(shí)驗(yàn)的情況下確定。一般，培養(yǎng)基成分可以按任何順序添加。
[0079]細(xì)胞培養(yǎng)基由許多成分組成并且這些成分在一種培養(yǎng)基與另一種培養(yǎng)基之間變動?！癐X制劑”意指以工作濃度含有細(xì)胞培養(yǎng)基中存在的一些或全部成分的任何水溶液?！癐X制劑”可以指例如細(xì)胞培養(yǎng)基或指這種培養(yǎng)基的多種成分的任何亞組。一種成分在IX溶液中的濃度大致與該組分在用于體外維持或培育細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物制劑中存在的濃度相同。用于體外培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基是定義的IX制劑。當(dāng)許多成分存在時，IX制劑中的每種成分具有與這些成分在細(xì)胞培養(yǎng)基中的濃度大致相等的濃度。例如，連同其它組分，RPM1-1640培養(yǎng)基含有0.2g/l L-精氨酸、0.05g/l L-天冬氨酸和0.02g/l L-天冬氨酸。這些氨基酸的“IX制劑”含有這些成分在溶液中的大致相同濃度。因此，當(dāng)談及“IX制劑”時，溶液中的每種成分意在具有與所描述的細(xì)胞培養(yǎng)基中存在的濃度相同或大致相同的濃度。成分在細(xì)胞培養(yǎng)基的IX制劑中的濃度是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的。參見MethodsFor Preparation of Media, Supplements and Substrate For Serum-Free Animal CellCulture Allen R.Liss，N.Y.(1984)，所述通過引用的方式完整并入本文。然而，與培養(yǎng)基相比，克分子滲透壓濃度和/或PH可以在IX制劑中不同，尤其當(dāng)IX制劑中含有更少成分時。
[0080]“10X制劑”意指一種溶液，其中該溶液中的每種成分比相同成分在細(xì)胞培養(yǎng)基中更濃縮約10倍。例如，連同其它組分，RPM1-1640培養(yǎng)基的10X制劑可以含有2.0g/lL-精氨酸、0.5g/l L-天冬氨酸和0.2g/l L-天冬氨酸(比較上文的IX制劑)?！?0 X制劑”可以按約10倍于IX培養(yǎng)基中存在的濃度含有許多額外成分。如將顯而易見，“25X制劑”、“50X制劑”、“10`0X制劑”、“500X制劑”和“1000X制劑”表示與IX細(xì)胞培養(yǎng)基相比以約25倍、50倍、100倍、500倍或1000倍濃度分別含有成分的溶液。再次，培養(yǎng)基制劑和濃縮溶液的克分子滲透壓濃度和PHo可以變動。
[0081]優(yōu)選地，包含各成分的溶液比IX培養(yǎng)基制劑中相同成分的濃度更濃縮。各成分可以10倍更濃縮(?ο X制劑)、25倍更濃縮(25 X制劑)、50倍更濃縮(50 X濃縮)或100倍更濃縮(100X制劑)?？梢援a(chǎn)生更高度濃縮的形式，條件是各成分保持可溶和穩(wěn)定。見美國專利號5，474，931 (其完整內(nèi)容通過引用方式并入本文)，該專利涉及以高濃度增溶培養(yǎng)基組分的方法。
[0082]如果將培養(yǎng)基成分制備為單獨(dú)的濃縮溶液，則將適宜(足夠)量的每種濃縮物與稀釋劑組合以產(chǎn)生IX培養(yǎng)基制劑。一般，使用的稀釋劑是水，但是可以根據(jù)本發(fā)明使用其他溶液，包括水質(zhì)緩沖液、水質(zhì)鹽水溶液或其他水溶液。
[0083]本發(fā)明的培養(yǎng)基一般經(jīng)滅菌以防止不想要的污染。滅菌可以例如通過以下方式實(shí)現(xiàn):在混合濃縮的成分后經(jīng)孔徑約0.1-1.0 μ m的低蛋白質(zhì)結(jié)合膜濾器(商業(yè)可獲得，例如，從Millipore, Bedford, Mass.)過濾以產(chǎn)生無菌培養(yǎng)基?？蛇x地，濃縮的成分亞組可以經(jīng)過濾除菌并且作為無菌溶液貯存。這些無菌濃縮物隨后可以在無菌條件下與無菌稀釋劑混合以產(chǎn)生濃縮的IX無菌培養(yǎng)基制劑。高壓滅菌法或其他基于升高溫度的滅菌方法不是有利的，因?yàn)楸景l(fā)明培養(yǎng)基的許多組分是熱不穩(wěn)定的并且將因溫度如大多數(shù)加熱滅菌方法期間實(shí)現(xiàn)的那些溫度而不可逆地降解。
[0084]如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易明白，培養(yǎng)基的每種組分可能與溶液中的一種或多種其他組分反應(yīng)。因此，本發(fā)明包括表3中公開的如上文所述補(bǔ)充的制劑，以及在合并這些成分后形成的任何反應(yīng)混合物。
[0085]許多組織培養(yǎng)培養(yǎng)基一般含有一種或多種抗生素，所述抗生素對于細(xì)胞生長/增殖本身而言不是必需，但是存在以便抑制不利微生物如細(xì)菌和/或真菌的生長。
[0086]抗生素是抑制其他微生物生長或摧毀其他微生物的分子量相對低的天然化學(xué)物質(zhì)，由各種微生物物種如細(xì)菌(包括芽孢桿菌屬(Bacillus)物種)、放線菌(包括鏈霉菌屬(Streptomyces))和真菌產(chǎn)生。具有相似結(jié)構(gòu)和作用模式的物質(zhì)可以化學(xué)地合成,或天然化合物可以經(jīng)修飾以產(chǎn)生半合成抗生素。這些生物合成和半合成衍生物也有效作為抗生素。主要類別的抗生素是:(I) β-內(nèi)酰胺，包括青霉素、頭孢菌素和單酰胺菌素；(2)氨基糖甙類，例如，慶大霉素、妥布霉素、奈替米星和阿米卡星；(3)四環(huán)素；⑷磺酰胺和甲氧芐啶；(5)氟喹諾酮，例如，環(huán)丙沙星、諾氟沙星和氧氟沙星；(6)萬古霉素；(7)大環(huán)內(nèi)酯類，其包括例如紅霉素、阿奇霉素和克拉霉素；和(8)其他抗生素，例如多粘菌素、氯霉素和林肯胺。 [0087]抗生素借助幾種作用機(jī)制實(shí)現(xiàn)其抗細(xì)菌作用，所述作用機(jī)制可以總體上如下分類:(1)作用于細(xì)菌細(xì)胞壁的藥物，如桿菌肽、頭孢菌素、環(huán)絲氨酸、磷霉素、青霉素、利托菌素和萬古霉素；(2)影響細(xì)胞膜或產(chǎn)生去垢劑作用的藥物，如黏菌素、新生霉素和多粘菌素；(3)通過它們作用核糖體而影響細(xì)胞復(fù)制機(jī)制、信息轉(zhuǎn)移和蛋白質(zhì)合成的藥物，例如氨基糖式類、四環(huán)素、氯霉素、克林霉素、放線菌酮(cycloheximide)、褐霉酸、林可霉素、嘌呤霉素、利福平、其他鏈霉素和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素如紅霉素和竹桃霉素；(4)影響核酸代謝的藥物，例如，氟喹諾酮、放線菌素D、乙胺丁醇、5-氟胞嘧啶、灰黃霉素、利福霉素；和(5)影響中間代謝的藥物，如磺酰胺、甲氧芐啶和結(jié)核菌抑制劑異煙肼和對-氨基水楊酸。一些藥物以具有多于一種主要作用機(jī)制，尤其在高濃度時。此外，細(xì)菌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)或代謝的繼發(fā)變化經(jīng)常在抗微生物藥物的主要作用之后出現(xiàn)。
[0088]因此，為了方便和出于其他實(shí)際原因，主題培養(yǎng)基可以額外地用抑制不利細(xì)菌/真菌/病毒生長/增殖的一種或多種抗生素或其他物質(zhì)補(bǔ)充。然而，在其他實(shí)施方案中，主題培養(yǎng)基可以不含任何抗生素以確保原代細(xì)胞的最佳生長。當(dāng)操作在無抗生素的培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞時，應(yīng)當(dāng)格外仔細(xì)以便避免可能的污染。
[0089]表3中列出的濃度并不是絕對和不可變動的。由于不同的細(xì)胞類型可能具有不同的生長需要，故構(gòu)思在總體上，每個值的2-10倍變異(增加或下降)是可接受的濃度范圍。一些組分可以忍受甚至更大的終濃度變異?？梢允褂眠@些起始濃度實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步優(yōu)化。
[0090]在一些實(shí)施方案中，任一種或多種所添加組分的終濃度與表3中列出的濃度相差至多到10倍，藉此意指相關(guān)的濃度可以是0.1至10倍于表3中列出的濃度。在一些實(shí)施方案中，任一種或多種所添加組分的終濃度與表3中列出的濃度相差至多到3倍，藉此意指相關(guān)的濃度可以是0.3至3倍于表3中列出的濃度。在一些實(shí)施方案中，任一種或多種所添加組分的終濃度與表3中列出的濃度相差至多到2倍，藉此意指相關(guān)的濃度可以是0.5至2倍于表3中列出的濃度。在一些實(shí)施方案中，任一種或多種所添加組分的添加濃度與表3中列出的那些濃度分別相差表3中列出的值至多到10%、20%或50%。
[0091]本發(fā)明包括其中不向培養(yǎng)基添加任何1、2、3、4或5種組分的實(shí)施方案。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基補(bǔ)充有胰島素、EGF、氫化可的松、霍亂毒素和血清。任選地，培養(yǎng)基進(jìn)一步補(bǔ)充有雌激素。
[0092]B.正常卵巢細(xì)胞和輸卵管細(xì)胞的培養(yǎng)
[0093]卵巢是由卵母細(xì)胞(卵細(xì)胞)、支持卵母細(xì)胞的間質(zhì)細(xì)胞和覆蓋卵巢表面的上皮組成的雌性生殖器官。在排卵期間，卵母細(xì)胞(卵細(xì)胞)突破卵巢表面并由輸卵管的傘端捕獲。這些卵母細(xì)胞沿輸卵管上行進(jìn)入子宮內(nèi)膜腔，在此處它們植入(圖1A-C)。
[0094]內(nèi)部器官的上皮約束中央管腔如輸乳管、腸管、支氣管等。上皮細(xì)胞的功能差異在于它們將物質(zhì)分泌入管腔或從管腔吸收物質(zhì)；如分泌唾液、乳汁、肺粘液、胃酸、胰酶或通過胃腸道和腎上皮吸收水和養(yǎng)分。包圍管腔的整個組織結(jié)構(gòu)有時稱作“導(dǎo)管”或“腺體”。這些細(xì)胞共有的常見功能賦予它們獨(dú)特特性，所述特性使得它們成為與身體中全部其他細(xì)胞不同的獨(dú)特組。
[0095]卵巢的表面被單層上皮覆蓋，在下方卵母細(xì)胞位于在有時稱作“卵巢皮層”的區(qū)域中。卵母細(xì)胞受構(gòu)成卵巢本體的激素活性的卵巢間質(zhì)細(xì)胞支持。在每個周期期間，幾種卵母細(xì)胞釋放至輸卵管中并且缺口在卵巢表面處形成，所述缺口正常情況下由卵巢表面上皮修復(fù)。然而，在一些情況下小囊腫在排卵部位形成，所述小囊腫襯有不同于表面上皮的上皮。卵巢皮層中的這些囊腫稱作“包涵囊腫”(圖1D)。輸卵管的管腔襯以由兩個細(xì)胞類型組成的單層上皮，所述兩個細(xì)胞類型在形態(tài)學(xué)上因在它們的頂端表面存在或不存在纖毛而區(qū)分。
[0096]腫瘤源自卵巢和輸卵管中的細(xì)胞。具體而言，源自和/或類似內(nèi)部器官的腺狀和導(dǎo)管上皮的腫瘤統(tǒng)稱為腺癌。術(shù)語“癌癥”或“癌”由病理學(xué)家用來指具有上皮表型的腫瘤。因而，術(shù)語“卵巢癌”、“卵巢癌”和“卵巢腺癌”可以互換使用。
[0097]值得注意地，絕大部分的人類腫瘤，包括輸卵管卵巢腫瘤以及肺、乳腺、結(jié)腸、前列腺、胃腸道、內(nèi)分泌器官和婦科腫瘤是上皮腺癌。這些腫瘤總體上占超過90%因癌癥所致的人類死亡。與上皮癌癥相比，源自全部其他細(xì)胞如血液細(xì)胞、免疫細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的腫瘤是非常罕見的。
[0098]來自卵巢和輸卵管上皮的輸卵管卵巢腺癌占據(jù)幾乎90%造成大部分卵巢癌相關(guān)死亡的惡性卵巢腫瘤。來自卵巢中間質(zhì)細(xì)胞和生殖細(xì)胞的腫瘤是罕見的，占小于5%因卵巢腫瘤所致的死亡。
[0099]卵巢的腺癌是由具有不同細(xì)胞特征、形態(tài)特征和臨床特征的至少6種主要組織病理學(xué)亞型組成的異質(zhì)性疾病。卵巢腺癌的主要亞型包括占據(jù)超過90%卵巢腺癌的乳頭狀漿液性、粘液性、子宮內(nèi)膜樣、透明細(xì)胞、鱗狀和過渡型。
[0100]哪種細(xì)胞是輸卵管卵巢腫瘤的推定性前體病灶？鑒定和檢測早期非浸潤性前體病灶如乳腺(DCIS)中的原位導(dǎo)管癌、結(jié)腸中的腺瘤息肉、子宮頸中的鱗狀表皮內(nèi)病灶(SIL)或子宮內(nèi)膜表皮內(nèi)瘤形成(EIN)已經(jīng)大大幫助理解這些器官中癌癥發(fā)生的發(fā)病機(jī)制。鑒定推定性細(xì)胞和早期前體病灶允許開發(fā)早期檢測工具并更好理解腫瘤在這些器官中的天然進(jìn)展。由于大多數(shù)卵巢癌在它們的進(jìn)展中很晚才變得有癥狀，所以已經(jīng)不可能充分地研究它們的前體病灶。不幸地，在這個時間沒有用于早期檢測這種癌癥的常規(guī)篩查工具。[0101]已經(jīng)存在被提出作為人卵巢腺癌來源的三種類型的正常細(xì)胞；在組織學(xué)上已經(jīng)認(rèn)為卵巢癌源自卵巢皮層內(nèi)部的卵巢表面上皮(OSE)或上皮包涵囊腫(OC)。然而，已經(jīng)在卵巢中鑒定到少數(shù)癌前期病灶，并且難以確定變化如在正常卵巢中觀察到的卵巢上皮內(nèi)瘤形成是否真正代表惡變前腫瘤病灶。最近的研究具有提出輸卵管上皮(FTE)，特別地傘端，作為多達(dá)一半的高等級乳頭狀漿液性腺癌的推定性細(xì)胞源。這得到以下數(shù)據(jù)支持:來自相同女性的輸卵管前體病灶和腫瘤組織共有常見的P53突變。
[0102]因此，本發(fā)明的一個方面包括支持正常卵巢細(xì)胞和輸卵管細(xì)胞(例如卵巢表面上皮(OSE)、上皮包涵囊腫(OC)和輸卵管上皮(FTE))體外生長和/或增殖至少約4周或至少約15、25或甚至35次群體倍增(PD)的細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0103]上皮細(xì)胞如正常卵巢和/或輸卵管細(xì)胞(0SE、0C和/或FTE)可以永生化以便延伸細(xì)胞的壽命。細(xì)胞可以借助致癌性轉(zhuǎn)化，例如，通過使正常細(xì)胞暴露于化學(xué)誘變劑、輻射或其他致癌物質(zhì)，和/或通過表達(dá)病毒癌基因(例如，H-Ras、人乳頭瘤病毒E6/7(HPVE6/7)、猴病毒40大T/小t(SV40T/t)抗原和/或腺病毒蛋白(ElA))轉(zhuǎn)化正常細(xì)胞而永生化。細(xì)胞也可以過量表達(dá)端粒酶(如人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT))的催化性亞基永生化。在一些實(shí)施方案中，過量表達(dá)hTERT的卵巢和/或輸卵管細(xì)胞在適應(yīng)于正常卵巢細(xì)胞和輸卵管細(xì)胞生長和/或增殖的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)。本文所述的hTERT過量表達(dá)和細(xì)胞培養(yǎng)基的組合可能足以永生化卵巢和/或輸卵管細(xì)胞。
[0104]在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)物包含其中hTERT已經(jīng)過量表達(dá)的細(xì)胞，其中hTERT的過量表達(dá)足以使得所述細(xì)胞能夠進(jìn)行至少14、25或35次群體倍增。該培養(yǎng)可以包含至少
103、至少104、至少IO5或至少IO6個細(xì)胞。hTERT過量表達(dá)可以歸因于，例如用病毒轉(zhuǎn)染或
轉(zhuǎn)化。`
[0105]可以將卵巢細(xì)胞和輸卵管細(xì)胞，如永生化細(xì)胞，轉(zhuǎn)化成致瘤細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的致腫瘤卵巢和/或輸卵管細(xì)胞可以在適應(yīng)于正常卵巢細(xì)胞和輸卵管細(xì)胞生長和/或增殖的培養(yǎng)基(如在這部分中描述和本公開中由WIT-fo (表3)例舉)中培養(yǎng)。
[0106]在不帶纖毛的輸卵管細(xì)胞或卵巢包涵囊腫細(xì)胞的致癌性轉(zhuǎn)化后，使這些細(xì)胞類型與探針的表達(dá)相關(guān)。在某些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化的不帶纖毛的輸卵管細(xì)胞過量表達(dá)探針集合D0K5、CD47、HS6ST3、DPP6、0SBLP3,并且轉(zhuǎn)化的卵巢包涵囊腫細(xì)胞過量表達(dá)探針集合STC2、SFRPl、SLC35F3、SHMT2、TMEM164。
[0107]本發(fā)明的一個方面涉及卵巢細(xì)胞和/或輸卵管細(xì)胞的培養(yǎng)物，其中所述卵巢細(xì)胞過量表達(dá)探針集合D0K5、CD47、HS6ST3、DPP6、0SBLP3 ;并且其中所述輸卵管細(xì)胞過量表達(dá)探針集合STC2、SFRPl、SLC35F3、SHMT2、TMEM164，其中所述培養(yǎng)物包含至少IO3個細(xì)胞；以及所述細(xì)胞能夠發(fā)生至少14、25或35次群體倍增。在一些實(shí)施方案中，該培養(yǎng)物包含至少
104、105、IO6、107、IO8、IO9和 / 或 IO10 個細(xì)胞。
[0108]在前述任一者的某些實(shí)施方案中，基本上純化的細(xì)胞培養(yǎng)物是培養(yǎng)物，其中培養(yǎng)物中至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或大于98%的細(xì)胞是特定的目的細(xì)胞類型。
[0109]因而，如上文所述，本發(fā)明提供可用于培養(yǎng)正常卵巢上皮細(xì)胞和正常輸卵管細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，可用于培養(yǎng)正常卵巢上皮細(xì)胞和正常輸卵管細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基包含三磷酸腺苷；載體蛋白；膽固醇、亞油酸和硫辛酸；谷胱甘肽；選自次黃嘌呤、黃嘌呤、腺嘌呤、鳥嘌呤和胸苷的核苷酸補(bǔ)救途徑前體堿基；磷脂酰乙醇胺；硒；轉(zhuǎn)鐵蛋白；三碘甲腺原氨酸；維生素A、維生素C、和維生素D ;Zn、Mg和Cu ;增加胞內(nèi)cAMP的試劑；表皮生長因子(EGF);氫化可的松；胰島素；和血清。培養(yǎng)基還可以包含至少一個腺苷單磷酸和維生素E。培養(yǎng)基可以包含維生素K3、煙酸或煙酰胺中的至少一種。培養(yǎng)基中的載體蛋白可以是白蛋白。培養(yǎng)基中的核苷酸補(bǔ)救途徑前體堿基可以是黃嘌呤和/或次黃嘌呤。
[0110]增加胞內(nèi)cAMP的試劑可以是霍亂毒素。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基以范圍從 1-lOOng/ml ;l_75ng/ml ;l_50ng/ml ;l_25ng/ml ;l_15ng/ml ；l-10ng/ml ； 10-100ng/ml ；10_75ng/ml ;10_50ng/ml ;10_25ng/ml ;10_15ng/ml ； 15-100ng/ml ;15_75ng/ml ;15_50ng/ml ;15_25ng/ml ；15-20ng/ml ；20-100ng/ml ；20-75ng/ml ；20-25ng/ml ；25-100ng/ml ；25-75ng/ml ;或25_50ng/ml的濃度包含霍亂毒素。優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)基可以包含約20ng/ml的霍亂毒素，或者，約25ng/ml的霍亂毒素。
[0111]在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含EGF。EGF的濃度可以是0.5-50ng/ml ;0.5_25ng/ml ；0.5_15ng/ml ；0.5-lOng/ml ；0.5-5.0ng/ml ；0.5-1.0ng/ml ；1.0_50ng/ml ；1.0_25ng/ml ；1.0_15ng/ml ；1.0-10ng/ml ；1.0_5ng/ml ；5.0_50ng/ml ；5.0_25ng/ml ；5.0_15ng/ml ；5.0-10ng/ml ； 10-50ng/ml ;10_25ng/ml ;或 10_15ng/ml。優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)基可以包含3ng/ml和50ng/ml之間的EGF，或最優(yōu)選地，可以包含約10ng/ml的EGF。
[0112]在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含氫化可的松。氫化可的松的濃度可以是0.01-5.0 μ g/mL ;0.01-2.5 μ g/mL ;0.01-1.0 μ g/mL ;0.01-0.5 μ g/mL ;0.01-0.30 μ g/mL ；0.01-0.25 μ g/mL ;0.01-0.10 μ g/mL ;0.01-0.05 μ g/mL ;0.05-5.0 μ g/mL ;0.05-2.5 μ g/mL ；0.05-1.0 μ g/mL ；0.05-0.5 μ g/mL ；0.05-0.30 μ g/mL ；0.05-0.25 μ g/mL ；0.05-0.10 μ g/mL ;0. 05-0.05 μ g/mL ;0.15-5.0 μ g/mL ;0.15-2.5 μ g/mL ;0.15-1.0yg/mL ;0.15-0.5 μ g/mL ;0.15-0.30 μ g/mL ;0.15-0.25 μ g/mL ;0.15-0.10 μ g/mL ；和
0.15-0.05 μ g/mL。優(yōu)選地，氫化可的松在細(xì)胞培養(yǎng)基中的濃度在0.015-5.0 μ g/mL之間。為了培養(yǎng)正常卵巢細(xì)胞和輸卵管細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)基優(yōu)選地包含在0.25 μ g/mL和0.50 μ g/mL之間的氫化可的松，和最優(yōu)選地包含約0.5 μ g/mL的氫化可的松。
[0113]在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含胰島素。胰島素的濃度可以是
1.0-75.0 μ g/mL ； 1.0-50.0 μ g/mL ； 1.0-25.0 μ g/mL ； 1.0-10.0 μ g/mL ； 10.0-75.0 μ g/mL ； 10.0-50.0 μ g/mL ； 10.0-25.0 μ g/mL ；和 10.0-15.0 μ g/mL ; 15.0-75.0 μ g/mL ;15.0-50.0 μ g/mL ；15.0-25.0 μ g/mL ;和 15.0-20.0 μ g/mL? 在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，胰島素的范圍是15.0-20.0 μ g/mL。為了培養(yǎng)正常卵巢細(xì)胞和輸卵管細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)基優(yōu)選地包含在5.0 μ g/mL和50.0 μ g/mL之間的胰島素。最優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)基包含約20.00 μ g/mL的胰島素。
[0114]在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基以范圍從0.2%-4.0%v/v ；0.5-3.0% ；1.0%_2.0%v/
V；1.5%-2.0%v/v的濃度包含血清。在用于培養(yǎng)正常卵巢細(xì)胞和輸卵管細(xì)胞的一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物包含在0.25%和0.75%v/v之間的血清。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含約0.5%v/v的血清。在一些實(shí)施方案中，試劑盒或培養(yǎng)基不包含血清，并且血清(如果存在的話)可以單獨(dú)地或由用途供應(yīng)。
[0115]在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基支持卵巢細(xì)胞和/或輸卵管細(xì)胞體外增殖至少約10次群體倍增(PD)。細(xì)胞培養(yǎng)基也可以支持卵巢細(xì)胞和/或輸卵管細(xì)胞增殖至少約6、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45或50次PD。群體倍增可以反映不同于用作成功細(xì)胞
培養(yǎng)的量度的“繼代培養(yǎng)”或“傳代”次數(shù)的信息。細(xì)胞的繼代培養(yǎng)或傳代單純地指將細(xì)胞從一塊培養(yǎng)平板移走并且將它們接種入新的培養(yǎng)平板中。這種表示細(xì)胞已經(jīng)耐受從一塊平板轉(zhuǎn)移至另一塊平板并且在轉(zhuǎn)移期間仍活著。然而，細(xì)胞傳代次數(shù)不必然地表示細(xì)胞增殖。
[0116]圖2顯示在細(xì)胞增殖和傳代次數(shù)之間缺少相關(guān)性。在標(biāo)準(zhǔn)對照培養(yǎng)條件下，在4次傳代期間，將“傳代”輸卵管上皮傳代幾乎60天(圖2B，紅色曲線)。然而，細(xì)胞生長曲線在14日后保持幾乎扁平并且沒有細(xì)胞數(shù)目的凈增加。因此，傳代次數(shù)沒有提供關(guān)于細(xì)胞數(shù)目凈增加的信息。
[0117]細(xì)胞數(shù)目的凈增加最精確地以“群體倍增”(PD)計(jì)量。單個細(xì)胞將在10次群體倍增時后產(chǎn)生1024個細(xì)胞(210=2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024)。因此，每10次群體倍增大約等于3個數(shù)量級(1，000倍)的細(xì)胞數(shù)目凈增加，20次群體倍增將接近于I百萬倍增加，和30次群體倍增將接近于凈細(xì)胞數(shù)目的10億倍增加。因此，H)對時間圖是半log2指數(shù)圖。相比之下，細(xì)胞傳代可能幾乎等于細(xì)胞數(shù)目無凈增加。
[0118]一種示例性細(xì)胞培養(yǎng)基在表3中WIT-fo標(biāo)記的列內(nèi)描述。在某些實(shí)施方案中，任何特定成分至少部分地由能夠滿足相同功能的替代性成分替換。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，表3中列出的任何特定成分至少部分地由能夠滿足相同功能的替代性成分替換?？梢韵鄬τ谌我环N或多種列出的成分進(jìn)行這類替換(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10種或更多種成分可以由能夠滿足相同功能的替代性成分替換)。在一個實(shí)施方案中，替換緩沖液組分。在另一個實(shí)施方案中，替換去垢劑或表面活性劑組分。在另一個實(shí)施方案中，替換載體蛋白組分。本說明書提供適合的代用品的非限制性例子。
[0119]本發(fā)明的另一個方面涉及用于培養(yǎng)正常卵巢上皮細(xì)胞和輸卵管細(xì)胞的方法。在一個實(shí)施方案中，用于培養(yǎng)卵巢上皮細(xì)胞和輸卵管上皮細(xì)胞的方法包括從輸卵管的卵巢表面和/或纓飾表面獲得卵巢 上皮細(xì)胞和輸卵管上皮細(xì)胞并且在如上文并在表3 (列標(biāo)記WIT-fo)中所述的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，其中卵巢上皮細(xì)胞和輸卵管上皮細(xì)胞在所述細(xì)胞培養(yǎng)基中經(jīng)歷至少14次群體倍增。
[0120]C.腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)
[0121]本發(fā)明的一個方面涉及支持原代細(xì)胞系的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述原代細(xì)胞系源自
(I)實(shí)體人腫瘤組織、(2)惡性體液中的腫瘤細(xì)胞和(3)小鼠中培育的腫瘤的原代異體移植物的腫瘤細(xì)胞。培養(yǎng)的細(xì)胞基本上作為組織中的原始腫瘤細(xì)胞表型副本生長并且提供臨床上相關(guān)的模型以找到和開發(fā)用于人類腫瘤早期檢測、診斷、預(yù)后和治療的試劑。
[0122]絕大部分的人類腫瘤，包括輸卵管卵巢腫瘤以及肺、乳腺、結(jié)腸、前列腺、胃腸道、內(nèi)分泌器官和婦科腫瘤是上皮腺癌。這些腫瘤總體上占超過90%因癌癥所致的人類死亡。與上皮癌癥相比，源自來自全部其他細(xì)胞如血液細(xì)胞、免疫細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的腫瘤是非常罕見的。
[0123]來自卵巢和輸卵管上皮的輸卵管卵巢腺癌占據(jù)幾乎90%造成大部分卵巢癌相關(guān)死亡的惡性卵巢腫瘤。來自卵巢中間質(zhì)細(xì)胞和生殖細(xì)胞的腫瘤是罕見的，占小于5%因卵巢腫瘤所致的死亡。
[0124]卵巢的腺癌是由具有不同細(xì)胞特征、形態(tài)特征和臨床特征的至少6種主要組織病理學(xué)亞型組成的異質(zhì)性疾病。卵巢腺癌的主要亞型包括占據(jù)超過90%卵巢腺癌的乳頭狀漿液性、粘液性、子宮內(nèi)膜樣、透明細(xì)胞、鱗狀和過渡型。
[0125]人腫瘤是由惡性腫瘤細(xì)胞以及多種不同的正常細(xì)胞類型如上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞組成的復(fù)雜組織。另外，許多腫瘤由非浸潤性(原位)和浸潤性惡性組分以及與浸潤性腫瘤細(xì)胞同時存在的惡變前增生組織組成。因此，當(dāng)培養(yǎng)物始自腫瘤組織時，來自腫瘤不同組分的許多細(xì)胞類型有機(jī)會在培養(yǎng)平板中增殖。盡管似乎矛盾，然而對于正常間質(zhì)細(xì)胞或正常上皮細(xì)胞以及來自腫瘤的非浸潤性(原位)組分的細(xì)胞或惡變前增生細(xì)胞，在常規(guī)培養(yǎng)條件下比浸潤性腫瘤細(xì)胞生長更快并非不同尋常。因此，需要驗(yàn)證在平板中增殖的細(xì)胞的惡性本質(zhì)的額外實(shí)驗(yàn)以證實(shí)腫瘤細(xì)胞的成功培養(yǎng)。
[0126]軟瓊脂集落測定法可以用來驗(yàn)證培養(yǎng)的細(xì)胞實(shí)際上是惡性腫瘤細(xì)胞。正常細(xì)胞和惡變前細(xì)胞不能在軟瓊脂中形成貼壁非依賴性集落。因此，在這種測定法中形成集落的能力是培養(yǎng)的細(xì)胞的惡性本質(zhì)的指標(biāo)。用來驗(yàn)證培養(yǎng)的細(xì)胞的惡性本質(zhì)的另一種方法是體內(nèi)腫瘤形成能力。
[0127]腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的成功以“傳代次數(shù)”表述，其中所述傳代次數(shù)充其量是細(xì)胞增殖的無信息性度量。培養(yǎng)細(xì)胞的傳代指當(dāng)細(xì)胞變得擁擠或延緩增殖時，機(jī)械地或酶促地使細(xì)胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶的表面脫離并且將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的空培養(yǎng)瓶。一般，腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的成功以“傳代次數(shù)”表述，其中所述傳代次數(shù)可能是細(xì)胞增殖的不完整度量。圖10顯示傳代次數(shù)并不總是與細(xì)胞數(shù)目的增加相關(guān)。腫瘤細(xì)胞經(jīng)常在2-3次傳代后減緩和停止增殖。盡管細(xì)胞仍活著并且可以傳代額外次數(shù)，但是它們的數(shù)目可能保持相同或甚至可能下降。因此，在不進(jìn)行實(shí)際細(xì)胞計(jì)數(shù)情況下，單獨(dú)的傳代次數(shù)并不證實(shí)細(xì)胞數(shù)目的凈增加。
[0128]一種更精確和客觀的細(xì)胞增殖度量是在細(xì)胞的連續(xù)培養(yǎng)期間實(shí)現(xiàn)的“群體倍增”(PD)的總次數(shù)。單個細(xì) 胞可以在十次群體倍增時后產(chǎn)生1024個細(xì)胞(2^=2.4.8.16'
32、64、128、256、512、1024)。因此，每十次群體倍增大約等于三個數(shù)量級(1，000倍)的細(xì)胞數(shù)目凈增加，二十次群體倍增將接近于一百萬倍增加，和三十次群體倍增將接近于凈細(xì)胞數(shù)目的十億倍增加。因此，PD對時間圖是半log2指數(shù)圖。
[0129]因此，本發(fā)明的一個方面包括支持以下細(xì)胞生長和/或增殖的細(xì)胞培養(yǎng)基:癌細(xì)胞，例如保藏于ATCC (美洲典型培養(yǎng)物保藏中心)或ECACC (歐洲培養(yǎng)物保藏中心)的卵巢癌腺癌細(xì)胞系，或源自原代實(shí)體人卵巢組織的細(xì)胞、源自腹水的細(xì)胞和/或源自已經(jīng)小鼠中培育的人類腫瘤異體移植物的細(xì)胞。該細(xì)胞培養(yǎng)基支持體外生長至少約4周和/或至少約30次群體倍增(PD)。
[0130]由于絕大部分的人類腫瘤，包括輸卵管卵巢腫瘤以及肺、乳腺、結(jié)腸、前列腺、胃腸道、內(nèi)分泌器官和婦科腫瘤是上皮腺癌，所以本文所述的培養(yǎng)基也可以用來培養(yǎng)源自以下的腫瘤細(xì)胞:人乳腺癌、胰腺癌、腺樣囊性癌、來自肺或來自胃腸道的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(類癌)和與上皮細(xì)胞相關(guān)的其他腫瘤。
[0131]在一些實(shí)施方案中，用于培養(yǎng)輸卵管卵巢腫瘤和源自其中的細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基包含三磷酸腺苷；載體蛋白；膽固醇、亞油酸和硫辛酸；谷胱甘肽；選自次黃嘌呤、黃嘌呤、腺嘌呤、鳥嘌呤和胸苷的核苷酸補(bǔ)救途徑前體堿基；磷脂酰乙醇胺；硒；轉(zhuǎn)鐵蛋白；三碘甲腺原氨酸；維生素A、維生素C及維生素D ;Zn、Mg和Cu ;增加胞內(nèi)cAMP的試劑；表皮生長因子(EGF);氫化可的松；胰島素；血清；和任選地，雌激素。培養(yǎng)基還可以包含至少一個腺苷單磷酸和維生素E。培養(yǎng)基可以包含維生素K3、煙酸或煙酰胺中的至少一種。培養(yǎng)基中的載體蛋白可以是白蛋白。培養(yǎng)基中的核苷酸補(bǔ)救途徑前體堿基可以是黃嘌呤和/或次黃嘌呤。
[0132]增加胞內(nèi)cAMP的試劑可以是霍亂毒素。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基以范圍從 1-lOOng/ml ;l_75ng/ml ;l_50ng/ml ;l_25ng/ml ;l_15ng/ml ；l-10ng/ml ； 10-100ng/ml ；10_75ng/ml ;10_50ng/ml ;10_25ng/ml ;10_15ng/ml ； 15-100ng/ml ;15_75ng/ml ;15_50ng/ml ;15_25ng/ml ；15-20ng/ml ；20-100ng/ml ；20-75ng/ml ；20-25ng/ml ；25-100ng/ml ；25-75ng/ml ;或25_50ng/ml的濃度包含霍亂毒素。優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)基可以包含約20ng/ml的霍亂毒素，或者，約25ng/ml的霍亂毒素。
[0133]在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含EGF。EGF的濃度可以是0.5_50ng/ml ;0.5_25ng/ml ；0.5_15ng/ml ；0.5-lOng/ml ；0.5-5.0ng/ml ；0.5-1.0ng/ml ；1.0_50ng/ml ；1.0_25ng/ml ；1.0_15ng/ml ；1.0-10ng/ml ；1.0_5ng/ml ；5.0_50ng/ml ；5.0_25ng/ml ；5.0_15ng/ml ；5.0-10ng/ml ； 10-50ng/ml ;10_25ng/ml ;或 10_15ng/ml。優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)基可以包含3ng/ml和50ng/ml之間的EGF，或最優(yōu)選地，可以包含約10ng/ml的EGF。
[0134]在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含氫化可的松。氫化可的松的濃度可以是0.01-5.0 μ g/mL ;0.01-2.5 μ g/mL ;0.01-1.0 μ g/mL ;0.01-0.5 μ g/mL ;0.01-0.30 μ g/mL ；0.01-0.25 μ g/mL ;0.01-0.10 μ g/mL ;0.01-0.05 μ g/mL ;0.05-5.0 μ g/mL ;0.05-2.5 μ g/mL ；0.05-1.0 μ g/mL ；0.05-0.5 μ g/mL ；0.05-0.30 μ g/mL ；0.05-0.25 μ g/mL ；0.05-0.10 μ g/mL ;0.05-0.05 μ g/mL ;0.15-5.0 μ g/mL ;0.15-2.5 μ g/mL ;0.15-1.0yg/mL ;0.15-0.5 μ g/mL ;0.15-0.30 μ g/mL ;0.15-0.25 μ g/mL ;0.15-0.10 μ g/mL ；和0.15-0.05 μ g/mL。優(yōu)選地，氫化可的松在細(xì)胞培養(yǎng)基中的濃度在0.015-5.0 μ g/mL之間。為了培養(yǎng)輸卵管卵巢腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)基優(yōu)選地包含在0.15 μ g/mL和0.30 μ g/mL之間的氫化可的松，和最優(yōu)選地包含約0.15 μ g/mL的氫化可的松。
[0135]在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含胰島素。胰島素的濃度可以是
1.0-75.0 μ g/mL ； 1.0-50.0 μ g/mL ； 1.0-25.0 μ g/mL ； 1.0-10.0 μ g/mL ； 10.0-75.0 μ g/mL ； 10.0-50.0 μ g/mL ； 10.0-25.0 μ g/mL ；和 10.0-15.0 μ g/mL ; 15.0-75.0 μ g/mL ;
15.0-50.0 μ g/mL ；15.0-25.0 μ g/mL ;和 15.0-20.0 μ g/mL? 在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，胰島素的范圍是15.0-20.0 μ g/mL。為了培養(yǎng)輸卵管卵巢腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)基優(yōu)選地包含在
5.0 μ g/mL和50.0 μ g/mL之間的胰島素。最優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)基包含約15.00 μ g/mL的胰島素。
[0136]在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基以范圍從0.2%-4.0%v/v ；0.5-3.0% ；1.0%_2.0%v/
V;或1.5%-2.0%v/v的濃度包含血清。在某些實(shí)施方案中，血清濃度是0.2%-10%v/
V；0.2%-5.0%v/v ；或 1.0%-5.0%v/vo 在一些實(shí)施方案中，血清濃度是 4.0%-10.0%ν/ν ；
4.0-6.0%v/v ；5.0-7.0%v/v ；6.0-8.0%v/v ；7.0-9.0%v/v ;或 8.0-10.0%v/v。在用于培養(yǎng)輸卵管卵巢腫瘤細(xì)胞的一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物包含在1.0%和1.5%v/v之間的血清。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基包含約1.2%v/v的血清。
[0137]在一些實(shí)施方案中，腫瘤細(xì)胞不需要雌激素用于生長。如本文所述的不含雌激素的細(xì)胞培養(yǎng)基可以支持乳頭狀漿液性腫瘤、透明細(xì)胞腫瘤、癌肉瘤和無性細(xì)胞瘤的生長。
[0138]在其他實(shí)施方案中，某些類型的腫瘤細(xì)胞可能需要雌激素用于生長。例如，細(xì)胞培養(yǎng)基可以按范圍從 30-300nM ；30-200nM ；30-100nM ；65-300nM ；65-200nM ；65-100nM ；100-300nM ；100-150nM ;和100_200nM的濃度包含雌激素。為了培養(yǎng)子宮內(nèi)膜樣腫瘤和/或粘液性腫瘤，細(xì)胞培養(yǎng)基優(yōu)選地額外以約65-150nM的濃度范圍包含雌激素，并且最優(yōu)選地以約IOOnM的濃度包含雌激素。雌激素可以是17-β-雌二醇或其生物等同物。17-β-雌二醇的生物等同物將以這樣的量存在，所述量具有與處于上文所列濃度范圍的17-β-雌二醇相同的活性；例如，可以選擇生物等同物的濃度以具有與100ηΜ17-β-雌二醇相同的活性。
[0139]在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)基支持卵巢細(xì)胞和/或輸卵管細(xì)胞體外增殖至少約30次群體倍增(PD)。細(xì)胞培養(yǎng)基也可以支持卵巢細(xì)胞和/或輸卵管細(xì)胞增殖至少約6、8、
10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、45 或 50 次 PD。
[0140]本發(fā)明的另一個方面涉及用于培養(yǎng)輸卵管卵巢腫瘤細(xì)胞的方法。在一個實(shí)施方案中，用于培養(yǎng)卵巢上皮細(xì)胞和輸卵管上皮細(xì)胞的方法包括從實(shí)體瘤、從腹水或從來自小鼠中培育的腫瘤的原代異體移植物的腫瘤細(xì)胞獲得輸卵管卵巢腫瘤細(xì)胞并且在如上文并在表3 (列標(biāo)記WIT-oc)中所述的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，其中卵巢上皮細(xì)胞和輸卵管上皮細(xì)胞在所述細(xì)胞培養(yǎng)基中經(jīng)歷至少30次群體倍增。一些細(xì)胞系可以從惡性腹水建立，不是來自可以傳代多于7次的實(shí)體瘤的連續(xù)細(xì)胞系。惡性流體樣品如腹膜腹水和肺流出物不含成纖維細(xì)胞和其他間質(zhì)細(xì)胞。腹水一般存在于一小部分處于極晚期疾病的患者中，并且在已經(jīng)用化療治療過的出現(xiàn)復(fù)發(fā)性疾病的患者中更常見。因此，從腹水分離的腫瘤細(xì)胞不來自未治療的患者。這些治療后的腫瘤細(xì)胞可能已經(jīng)暴露于遺傳毒性藥物，因此不同于原始腫瘤細(xì)胞。
[0141]在一些實(shí)施方案中，可以調(diào)節(jié)CO2和O2水平以支持某些細(xì)胞類型的培養(yǎng)。大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)在補(bǔ)充二氧化碳(CO2)至5%的環(huán)境空氣(18%02)中實(shí)施。在其他實(shí)施方案中，子宮內(nèi)膜樣和粘液性腫瘤可以在補(bǔ)充有雌激素的WIT-oc培養(yǎng)基中，在包含調(diào)節(jié)至5%的低氧
(O2)和(5%)CO2的生長條件下培養(yǎng)。
[0142]I1.用于制備細(xì)胞培養(yǎng)基的方法和試劑盒
[0143]本發(fā)明的其他方面涉及用于制備本文所述的細(xì)胞培養(yǎng)基的方法和試劑盒。試劑盒可以用來制備細(xì)胞培養(yǎng)基。例如，可以將組分制備為一種或多種組分的母液并且分裝在多個容器之間。在一些實(shí)施方案中，用于制備細(xì)胞培養(yǎng)基的試劑盒包含第一容器，所述第一容器包含三磷酸腺苷；載體蛋白；膽固醇、亞油酸和硫辛酸；谷胱甘肽；選自次黃嘌呤、黃嘌呤、腺嘌呤、鳥嘌呤和胸苷的核苷酸補(bǔ)救途徑前體堿基；磷脂酰乙醇胺；硒；轉(zhuǎn)鐵蛋白；三碘甲腺原氨酸；維生素Α、維生素C及維生素D ;Ζη、Mg和Cu ;和第二容器，所述第二容器包含增加胞內(nèi)cAMP的試劑；表皮生長因子(EGF);氫化可的松；胰島素；血清，和任選地雌激素。在一些實(shí)施方案中，這種試劑盒中的細(xì)胞培養(yǎng)基可以支持細(xì)胞體外增殖至少20次群體倍增(PD)。
[0144]在一些實(shí)施方案中，可以將細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)充物添加至細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以便以產(chǎn)生本文所述的細(xì)胞培養(yǎng)基。補(bǔ)充物可以包含增加胞內(nèi)cAMP的試劑；表皮生長因子(EGF);氫化可的松；胰島 素；血清；和任選地，雌激素。在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，向細(xì)胞培養(yǎng)基添加補(bǔ)充物產(chǎn)生0-70ng/ml增加胞內(nèi)cAMP的試劑，至少3ng/ml的EGF、0.015-0.5 μ g/mL的氫化可的松；至少10.00 μ g/mL的胰島素，0.2%-4.0%ν/ν的血清補(bǔ)充物，以及任選地，30-300nM的雌激素。[0145]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的另一個方面涉及制備本文所述的細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，所述方法混合三磷酸腺苷；載體蛋白；膽固醇、亞油酸和硫辛酸；谷胱甘肽；選自次黃嘌呤、黃嘌呤、腺嘌呤、鳥嘌呤和胸苷的核苷酸補(bǔ)救途徑前體堿基；磷脂酰乙醇胺；硒；轉(zhuǎn)鐵蛋白；三碘甲腺原氨酸；維生素A、維生素C及維生素D ;Zn、Mg和Cu ;增加胞內(nèi)cAMP的試劑；表皮生長因子(EGF);氫化可的松；胰島素；血清，和任選地，雌激素。如上文所示，組分可以從第一和第二容器和/或從自一種或多種組分的濃縮母液添加。在一些實(shí)施方案中，組分可以包裝在處于任何組合的任何數(shù)目的容器中。在一些實(shí)施方案中，使用2、3、4或5個容器，或5和10個之間的容器。
[0146]II1.培養(yǎng)細(xì)胞的選擇性培育、鑒定和用途
[0147]A.培養(yǎng)細(xì)胞的選擇性培育
[0148]本發(fā)明的一個方面涉及細(xì)胞培養(yǎng)基從異質(zhì)性群體培育選擇性細(xì)胞類型的用途。對卵巢組織和/或輸卵管組織(例如通過刷過這些組織的表面或通過活組織檢查)的初始采集可以產(chǎn)生比所需更多的細(xì)胞類型。類似地，來自患者的卵巢腫瘤樣品可以含有多種細(xì)胞類型，包括非癌細(xì)胞如間質(zhì)細(xì)胞或成纖維細(xì)胞。因?yàn)楸疚乃龅募?xì)胞培養(yǎng)基適應(yīng)于正常卵巢細(xì)胞、正常輸卵管細(xì)胞和/或腫瘤細(xì)胞的生長，該培養(yǎng)基將不選擇其他細(xì)胞類型。因而，適應(yīng)于正常卵巢細(xì)胞生長的細(xì)胞培養(yǎng)基可以用來從包含正常卵巢細(xì)胞如卵巢上皮細(xì)胞(表面上皮和/或包涵囊腫上皮)的組織培養(yǎng)選擇的細(xì)胞類型。適應(yīng)于正常輸卵管細(xì)胞生長的細(xì)胞培養(yǎng)基可以用來從包含正常輸卵管如輸卵管上皮細(xì)胞(帶纖毛的細(xì)胞和/或不帶纖毛的細(xì)胞輸卵管細(xì)胞)的組織培養(yǎng)選擇的細(xì)胞類型。適應(yīng)于腫瘤細(xì)胞(如卵巢腫瘤細(xì)胞)生長的細(xì)胞培養(yǎng)基可以用來培養(yǎng)選擇的腫瘤細(xì)胞類型。因此，包含腺癌如6種主要組織病理學(xué)亞型(乳頭狀漿液性、粘液狀，子宮內(nèi)膜樣、透明細(xì)胞、鱗狀和過渡型)中至少一種腺癌的卵巢腫瘤組織可以在適應(yīng)于卵巢腫瘤細(xì)胞生長的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以便富集特定的細(xì)胞類型。如上文詳述，富集的細(xì)胞可以作為基本上純化的細(xì)胞培養(yǎng)物提供。在某些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞具有本文中詳述的細(xì)胞的任一種或多種特征(例如，增殖能力、基因表達(dá)、生長特征等)。`
[0149]B.培養(yǎng)細(xì)胞類型的鑒定
[0150]在選擇性培養(yǎng)細(xì)胞類型后，可以鑒定使用一種或多種分子標(biāo)志物細(xì)胞類型。在正常卵巢細(xì)胞當(dāng)中，三種蛋白質(zhì)(PAX8、F0XJ1和角蛋白7(CK7)的表達(dá)模式在細(xì)胞類型之間變動。卵巢表面上皮是CK7 (+)、PAX8 (-)和FoxJl (-)，而卵巢包涵囊腫上皮是CK7 (+)、PAX8 (+)和FoxJl (_)。類似地，帶纖毛的輸卵管細(xì)胞(CK7(-)、PAX8(_)和FoxJl(+))可以與不帶纖毛的輸卵管細(xì)胞(CK7 (+)、PAX8 (+)和Foxjl(-))區(qū)分。
[0151]在不帶纖毛的輸卵管細(xì)胞或卵巢包涵囊腫細(xì)胞的致癌性轉(zhuǎn)化后，使這些細(xì)胞類型與探針的表達(dá)相關(guān)。轉(zhuǎn)化的不帶纖毛的輸卵管細(xì)胞過量表達(dá)探針集合D0K5、⑶47、HS6ST3、DPP6、0SBLP3,并且轉(zhuǎn)化的卵巢包涵囊腫細(xì)胞過量表達(dá)探針集合STC2、SFRPU SLC35F3、SHMT2、TMEM164。因此，可以將腫瘤鑒定為更為輸卵管樣或卵巢樣的。在一些實(shí)施方案中，試劑盒可以包含與輸卵管細(xì)胞相關(guān)的探針集合，和/或與卵巢細(xì)胞相關(guān)的探針集合。
[0152]本發(fā)明的一個方面涉及基本上純化的卵巢細(xì)胞和/或輸卵管細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述卵巢細(xì)胞過量表達(dá)探針集合D0K5、CD47、HS6ST3、DPP6、0SBLP3 ;并且其中所述輸卵管細(xì)胞過量表達(dá)探針集合STC2、SFRPl、SLC35F3、SHMT2、TMEM164，其中所述培養(yǎng)物包含至少IO3個細(xì)胞；以及所述細(xì)胞能夠發(fā)生至少14、25或35次群體倍增。在一些實(shí)施方案中，該培養(yǎng)物包含至少IO5、106、107、IO8、IO9和/或101°個細(xì)胞。
[0153]可以通過以下方式產(chǎn)生一系列培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的DNA指紋:產(chǎn)生來自所述細(xì)胞的基因組DNA的表達(dá)譜。也可以產(chǎn)生每個腫瘤細(xì)胞系的mRNA表達(dá)譜和蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜。在一些實(shí)施方案中，本公開提供具有圖13、圖14和/或圖15的圖譜的卵巢癌細(xì)胞。
[0154]由于對每個細(xì)胞系測試藥物反應(yīng)性，這些表達(dá)譜可能與藥物反應(yīng)相關(guān)。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)譜可以與來自患者的腫瘤比較，并且其中對患者預(yù)后的認(rèn)識已知的情況下，來自培養(yǎng)細(xì)胞系的表達(dá)譜可以指示預(yù)后。在一些實(shí)施方案中，基于患者腫瘤的表達(dá)譜和與已知其藥物反應(yīng)性的參比細(xì)胞系比較，可以預(yù)測藥物對患者的腫瘤的可能作用。例如，如果患者的腫瘤具有基本上相似于參比細(xì)胞的表達(dá)譜，并且參比細(xì)胞響應(yīng)于藥物治療，則可以預(yù)測該患者的腫瘤也將響應(yīng)于這種藥物治療。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)活組織檢查或手術(shù)獲得的腫瘤細(xì)胞并且使其在培養(yǎng)中暴露于一種或多種治療藥。評估所述藥物對細(xì)胞的增殖或存活的影響，以獲得一種或多種藥物對受試者腫瘤的可能作用的預(yù)測。在一些實(shí)施方案中，至少部分地基于提示該藥物將有益或有效或比另一種替代物更有效的預(yù)測或結(jié)果，選擇一種治療和/或?qū)⑵涫┯弥潦茉囌摺?br> [0155]C.培養(yǎng)細(xì)胞的示例性用途
[0156]可以例如在多種篩選方法中使用培養(yǎng)的細(xì)胞以便鑒定癌癥治療藥的候選藥物、可用于其他治療目的(例如，用于侵襲卵巢、輸卵管等的其他疾病中)或其他目的的候選藥物。在一些實(shí)施方案中，使用正常細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，使用腫瘤細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，使用從患有目的疾病(例如，侵襲生殖系統(tǒng)的疾病)的受試者獲得的細(xì)胞。一種鑒定候選治療藥的方法包括在適合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)已經(jīng)進(jìn)行致癌轉(zhuǎn)化的細(xì)胞(正常卵巢細(xì)胞或輸卵管細(xì)胞)或源自原代 培養(yǎng)物的卵巢腫瘤細(xì)胞。隨后可以使細(xì)胞與藥物接觸并且可以測量該藥物對細(xì)胞生理學(xué)的影響。調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理學(xué)的藥物是候選治療藥。細(xì)胞生理學(xué)可以包含細(xì)胞的生長特性、一種或多種分子標(biāo)志物的表達(dá)、形態(tài)和/或可以測量并定量的其他細(xì)胞特性。候選治療藥可以是生物分子如核酸(例如，短干擾性RNA，適配體、或反義寡核苷酸)和/或蛋白質(zhì)，或可以是有機(jī)小分子。在某些實(shí)施方案中，基于例如藥物抑制細(xì)胞增殖和/或抑制其存活的能力鑒定該藥物。在某些實(shí)施方案中，基于例如藥物抑制細(xì)胞在軟瓊脂中生長的能力鑒定該藥物。
[0157]在額外的步驟中，可以將培養(yǎng)的細(xì)胞施用至或植入試驗(yàn)動物中，從而異體移植腫瘤在試驗(yàn)動物中生長?？梢詫⒑蜻x治療藥施用至試驗(yàn)動物，并且可以測量異體移植腫瘤的特性。候選治療藥將調(diào)節(jié)腫瘤的生長、生理學(xué)和/或其他特性。具體而言，候選治療藥將抑制腫瘤的生長、降低腫瘤生長速率、減低腫瘤尺寸、減低腫瘤體積和/或減少轉(zhuǎn)移。因此，在某些實(shí)施方案中，體內(nèi)篩選多種藥物在動物模型的背景下抑制腫瘤生長或進(jìn)展的能力。
[0158]在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)的細(xì)胞可以用于再生醫(yī)學(xué)。例如，如本文所述那樣獲得或培養(yǎng)的人細(xì)胞(一般是正常細(xì)胞)可以用于后續(xù)植入受試者(例如，人類受試者或非人類受試者)中的組織或器官的離體結(jié)構(gòu)或可以被植入以增進(jìn)或修復(fù)患病、受損或正在變性的組織或器官。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞從受試者獲得、離體培養(yǎng)并且隨后植入相同的受試者(自體)中。在一些實(shí)施方案中，使用來自相關(guān)或不相關(guān)供體的細(xì)胞。
[0159]在一些實(shí)施方案中，如本文所述那樣獲得或培養(yǎng)的細(xì)胞可以經(jīng)歷基因修飾。通常，細(xì)胞可以經(jīng)工程化以表達(dá)任一種或多種目的基因或具有增加的任一種或多種目的基因表達(dá)和/或具有減少的任一種或多種目的基因表達(dá)或不存任一種或多種目的基因的表達(dá)或具有特定目的突變或變更。例如，在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞(例如，正常細(xì)胞)可以經(jīng)基因修飾以表達(dá)一種或多種癌基因或具有增加的一種或多種癌基因表達(dá)或以具有減少的一種或多種腫瘤抑制基因或不存一種或多種腫瘤抑制基因的表達(dá)。目的基因可以編碼例如蛋白質(zhì)、微RNA、短發(fā)夾RNA等可以將一種或多種載體(例如，質(zhì)粒、病毒載體等)導(dǎo)入細(xì)胞中。用于如此導(dǎo)入的各種方法如轉(zhuǎn)染、病毒感染等是本領(lǐng)域已知的。在一些實(shí)施方案中，這類基因修飾可以用來產(chǎn)生疾病模型。
[0160]在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)的細(xì)胞用于產(chǎn)生重組蛋白，例如，治療性蛋白。
[0161]如本領(lǐng)域理解，篩選一般涉及測試一種或多種物質(zhì)并且相對于某種適宜的對照比較一種或多種物質(zhì)的作用。對照的使用允許研究者評估變化是否為顯著的。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞用來篩選化合物文庫，如以高通量方式篩選。
實(shí)施例 [0162]已經(jīng)總體上描述了本發(fā)明， 申請人:提到以下示意性實(shí)施例以幫助理解總體描述的發(fā)明。包括這些具體實(shí)施例僅顯示本發(fā)明的某些方面和實(shí)施方案，并且它們不意在以任何方面限制本發(fā)明。然而，實(shí)施例中描述的某些一般原理可以總體上適用于本發(fā)明的其他方面或?qū)嵤┓桨浮１景l(fā)明構(gòu)思，可以組合上文和下文描述的方面、實(shí)施方案和其他特征中的任一個或多個。
[0163]實(shí)施例1:正常卵巢培養(yǎng)物和輸卵管培養(yǎng)物的建立。
[0164]a.WIT-fo培養(yǎng)基:正常卵巢上皮細(xì)胞和輸卵管上皮細(xì)胞在WIT_fo營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少15次群體倍增(圖2A-B，藍(lán)線)，而在幾次傳代后，相同細(xì)胞的重復(fù)平板在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基條件下停止生長(圖2A-B，紅線)。
[0165]b.標(biāo)準(zhǔn)卵巢上皮培養(yǎng)基:對于卵巢上皮細(xì)胞，使用對照培養(yǎng)基，其由補(bǔ)充有范圍5-10%的胎牛血清、2mmL-谷氨酰胺和10ng/ml表皮生長因子的MCDB105/培養(yǎng)基199的1:1混合物組成。作為對照培養(yǎng)基，含10-15%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)/Ham’ sF-12(l:l混合物)產(chǎn)生相似的結(jié)果。這兩種培養(yǎng)基已經(jīng)在過去二十年由許多的其他研究者用于短期卵巢細(xì)胞培養(yǎng)。卵巢細(xì)胞在這些對照培養(yǎng)基中不增殖超過幾次群體倍增。(圖2A，紅線)。
[0166]c.標(biāo)準(zhǔn)輸卵管培養(yǎng)基:對于輸卵管上皮細(xì)胞，使用Cromer等人描述的對照培養(yǎng)基，所述對照培養(yǎng)基由補(bǔ)充有0.1%BSA、5%血清(2.5%胎牛血清外加2.5%Nu血清的1:1混合物)和17 β雌二醇的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DME)和Ham’s F12的1:1混合物組成。也測試了 Levanon等人的這種培養(yǎng)基的略微改良形式,它由補(bǔ)充有2%血清的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DME)和Ham’s F12的1:1混合物組成。(圖2B，紅線)。
[0167]在WIT-fo培養(yǎng)基中培育的卵巢細(xì)胞已經(jīng)在7次傳代(42天)中實(shí)現(xiàn)14次群體倍增，這等于凈細(xì)胞數(shù)目增加8，192倍(圖2B)。在標(biāo)準(zhǔn)對照培養(yǎng)基(DME:F12)中，相同細(xì)胞也可以傳代7次(42天)，然而，它們在7次傳代(42天)中僅具有2.4次群體倍增，這等于細(xì)胞數(shù)目凈增加5.3倍。因此，細(xì)胞數(shù)目在WIT-fo中的凈增加1，526倍于標(biāo)準(zhǔn)DME:F12培養(yǎng)基中的凈增加(8，192 + 5.3=1，526)(圖2B)。[0168]測試了用于培養(yǎng)卵巢細(xì)胞的可用細(xì)胞培養(yǎng)基的幾種變例。在下文列出的培養(yǎng)基中，卵巢細(xì)胞和輸卵管細(xì)胞在3-5周內(nèi)部停止分裂并且未觀察到細(xì)胞數(shù)目的凈增加。
[0169]?含10%胎牛血清和10ng/ml表皮生長因子的MCDB105/培養(yǎng)基199 (1:1混合物)(Karlan 等人,American J.0f Obs.Gyn.173 (I), 97-104，1995)。
[0170].含5%胎牛血清的MCDB105/培養(yǎng)基199(1:1混合物)(Auersperg等人,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA Vol.96，6249-6254，1999)。
[0171]?含 15% 胎牛血清的 Dulbecco 改良 Eagle 培養(yǎng)基(DMEM) /Ham's F_12(l:l 混合物)(Nitta 等人,Gynecologic Oncology 第 81 卷，第 I 期，第 10-17 頁,2001)。
[0172].含10%胎牛血清、2mmL-谷氨酰胺和10ng/ml表皮生長因子的MCDB105/培養(yǎng)基199 (1:1 混合物)。(Liu 等人，Cancer Res.1; 64 (5): 1655-63，2004)。
[0173]實(shí)施例2:在WIT-fo中培養(yǎng)的正常卵巢細(xì)胞和輸卵管細(xì)胞的表征。
[0174]為了鑒定培養(yǎng)細(xì)胞的譜系和來源，進(jìn)行正常人卵巢組織和輸卵管組織的免疫組織化學(xué)表征，并且開發(fā)了區(qū)分體內(nèi)正常輸卵管組織和卵巢組織中不同上皮細(xì)胞亞類的標(biāo)記組。
[0175]采用識別不同細(xì)胞的抗體對正常人卵巢組織和輸卵管組織的福爾馬林固定、石蠟包埋(FFPE)切片的免疫組織化學(xué)檢驗(yàn)定義出正常細(xì)胞亞類。在篩選許多種抗體后，確定一組三種抗體-PAX8、F0XJ1和角蛋白7(CK7)_以允許區(qū)分卵巢中的表面上皮與包涵囊腫上皮以及輸卵管中的帶纖毛細(xì)胞與不帶纖毛細(xì)胞。確定全部卵巢上皮和輸卵管上皮亞類均為角蛋白7陽性(+)。盡管卵巢表面上皮是PAX8陰性(_)，但卵巢包涵囊腫上皮是PAX8陽性(+)。另外，不帶纖毛的輸卵管上皮亞類為PAX8陽性⑴和F0XJ1陰性(_)，這使其區(qū)別于帶纖毛的細(xì)胞，后者為F0XJ1陽 性⑴但是PAX8陰性㈠(圖3A-E)。
[0176]
輸卵管卵巢細(xì)胞類型 I角蛋白7 & IfoxJI
卵巢表面上皮+-
卵巢包涵囊腫上皮++—
帶纖毛的輸卵管細(xì)胞 ''+
不帶纖毛的輸卵管細(xì)胞~++~
[0177]檢查從卵巢和輸卵管培養(yǎng)的細(xì)胞。從卵巢培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)CK7(+)蛋白、PAX8(+)蛋白，但是對F0XJ1 (-)為陰性。這份圖譜與卵巢包涵囊腫襯層一致。此后，培養(yǎng)的卵巢細(xì)胞稱作卵巢包涵囊腫(OC)細(xì)胞(圖3G)。
[0178]從正常輸卵管傘部培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)CK7(+)蛋白、PAX8(+)蛋白，但是對F0XJ1 (-)為陰性。這份圖譜與不帶纖毛的輸卵管上皮細(xì)胞一致。這些培養(yǎng)的細(xì)胞此后稱作FN細(xì)胞(不帶纖毛的輸卵管細(xì)胞)(圖3G)。
[0179]實(shí)施例3:hTERT永生化的正常卵巢培養(yǎng)物和輸卵管培養(yǎng)物的建立。
[0180]a.正常卵巢培養(yǎng)物和輸卵管培養(yǎng)物的永生化。正常人上皮細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)下并不生長良好并且在常規(guī)的培養(yǎng)基中具有有限壽命。相比之下，更直接明了的是培養(yǎng)全部嚙齒類細(xì)胞和人類非上皮細(xì)胞類型。
[0181]為了建立連續(xù)型正常人上皮細(xì)胞培養(yǎng)物，將致癌性轉(zhuǎn)化用來產(chǎn)生可以連續(xù)培養(yǎng)的細(xì)胞系。在這種方案中，通過使正常人細(xì)胞暴露于化學(xué)誘變劑、輻射或其他致癌物質(zhì)實(shí)現(xiàn)正常上皮細(xì)胞的致癌性轉(zhuǎn)化。這些物質(zhì)造成廣泛的突變、DNA斷裂和染色體重排，并且細(xì)胞可以不再視作完全正常的細(xì)胞。用于轉(zhuǎn)化正常細(xì)胞的備選方法使用病毒癌基因來轉(zhuǎn)化正常細(xì)胞。在這些基因當(dāng)中有人乳頭瘤病毒E6/7 (HPV E6/7)基因、猴病毒40大T/小t (SV40T/t)抗原和腺病毒蛋白(ElA)，但是這些方法可以帶來問題。
[0182]一種侵入性較小的延長正常人細(xì)胞壽命的不造成遺傳不穩(wěn)定性或DNA突變的方法是過量表達(dá)端粒酶催化性亞基(hTERT)。hTERT表達(dá)實(shí)際上使基因組穩(wěn)定，并且細(xì)胞保持類似于正常細(xì)胞的近乎雙倍體。
[0183]在WIT-fo培養(yǎng)基中(見，表3，列標(biāo)記“WIT-fo”)，正常卵巢包涵囊腫(OC)上皮細(xì)胞和不帶纖毛的輸卵管(FN)上皮細(xì)胞僅用hTERT進(jìn)行永生化。這些永生化的OC和FN細(xì)胞下文分別稱作OCE細(xì)胞和FCE細(xì)胞(圖3A-E)。將這些細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)超過40次群體倍增，細(xì)胞數(shù)目凈增加幾乎IO12倍，表明它們永生化。相比之下，在幾次傳代后，甚至在存在hTERT過量表達(dá)時，表達(dá)hTERT的相同細(xì)胞的重復(fù)平板在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基條件下停止生長(圖4A-E)。
[0184]實(shí)施例4:卵巢包涵囊腫(OC)上皮和不帶纖毛的輸卵管(FN)正常上皮的致瘤性轉(zhuǎn)化:
[0185]如之前描述，hTERT永生化的OCE和FNE細(xì)胞用SV40T/t和H-Ras轉(zhuǎn)化(圖5A)。盡管表達(dá)SV40T/t轉(zhuǎn)化了正常人細(xì)胞，但是這些細(xì)胞在小鼠中沒有變成具有致腫瘤性。癌基因如H-Ras的額外表達(dá)使得這些轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在小鼠中具有致腫瘤性。轉(zhuǎn)化的致腫瘤性O(shè)C細(xì)胞(OCLER)和FN細(xì)胞(FNLER)表達(dá)PAX8和角蛋白7并且對于FOXJl為陰性，從而證實(shí)它們分別保留其原始卵巢包`涵囊腫表型和輸卵管非纖毛表型。將相等數(shù)目的OVLER細(xì)胞和FNLER細(xì)胞注射至免疫受損裸鼠的腹膜間隙中。5-9周后的小鼠尸體剖檢分析揭示兩個組中大小相似的腹內(nèi)原發(fā)性腫瘤。OCLER腫瘤和OVLER腫瘤均具有不良分化的形態(tài)，然而，可以鑒定局灶性小的微乳頭狀樣結(jié)構(gòu)(圖6A-B)。腫瘤細(xì)胞也為PAX8+(圖6，C-D)并且局部侵入周圍的腹膜內(nèi)如胰臟(圖7A-B)。
[0186]對來自攜瘤小鼠的肺的檢驗(yàn)揭示了源自O(shè)C和FN的致瘤細(xì)胞之間的明顯差異。首先在解剖顯微鏡下對每只小鼠的肺檢驗(yàn)gfp+腫瘤細(xì)胞(圖7C)，并且檢驗(yàn)相同肺的FFPE切片，對于非典型的腫瘤細(xì)胞，采用H&E切片顯微鏡檢驗(yàn)(圖7D)，并且用p53和SV40T/t免疫組織化學(xué)染色(圖7E-F)。
[0187]轉(zhuǎn)化的不帶纖毛的輸卵管細(xì)胞(FNLER)在67%小鼠的肺中形成轉(zhuǎn)移(4/6)，而用相同癌基因轉(zhuǎn)化的同基因正常卵巢細(xì)胞(OCLER)在13%的小鼠(1/8)中形成轉(zhuǎn)移(圖6G)。由于這些細(xì)胞從相同患者分離并用相同的癌基因轉(zhuǎn)化，因此這表明腫瘤中轉(zhuǎn)移潛力的差異在OC與FN中出現(xiàn)。
[0188]實(shí)施例5:預(yù)示性細(xì)胞源基因表達(dá)特征標(biāo)識的發(fā)現(xiàn):
[0189]a.細(xì)胞來源FNE (輸卵管)與OCE (卵巢的)表達(dá)特征標(biāo)識。使用源自這些實(shí)驗(yàn)性研究的基因特征標(biāo)識，將源自患者的原代卵巢腫瘤組織劃分為輸卵管(FT)樣和卵巢(OV)樣。1，017種探針的表達(dá)水平在正常的永生化(FNE與0CE)細(xì)胞之間顯著地變動(FDR校正P〈0.05)。為了在卵巢癌數(shù)據(jù)集內(nèi)部產(chǎn)生FT樣和OV樣亞類，應(yīng)用一項(xiàng)方案，該方案不同于先前廣泛使用的基于全面基因表達(dá)譜將患者聚類的策略。另外，該方案涉及選擇在FNE (D0K5、CD47、HS6ST3、DPP6、0SBPL3)或 0CE(STC2、SFRPl、SLC35F3、SHMT2、TMEM164)中過量表達(dá)的5個具有獨(dú)特基因符號的最高度顯著的探針集合和通過將FNE基因權(quán)重為(+1)和將OCE基因權(quán)重為(-1)，計(jì)算兩個卵巢癌數(shù)據(jù)集中這些基因的歸一化表達(dá)值的總和；具體而言，將OCE基因的歸一化表達(dá)值的總和從FNE基因的表達(dá)值的總和中扣除以計(jì)算每種腫瘤的評分。因此，較高評分暗示更為FT樣。對這種評分使用混合建模擬合高斯曲線的雙峰分布，以鑒定該數(shù)據(jù)集中的兩個亞群；一個更為OV樣而一個更為FT樣。
[0190]這種聚類在Wu等人，數(shù)據(jù)集(GE0GSE6008)中進(jìn)行。這項(xiàng)研究在相似陣列平臺上剖析了 99份新鮮的冷凍顯微解剖的上皮卵巢癌(包括許多非漿液性組織學(xué)亞型)。因平臺差異，10個基因中有8個可用于分析。在整體檢驗(yàn)中，這8個基因強(qiáng)烈地與組織學(xué)亞型(Ρ=9.93Χ10-η)、等級(Ρ=2.03Xl(T)和分期(Ρ=9.55X 10_12)相關(guān)。為了鑒定與這些臨床因素最強(qiáng)烈相關(guān)的特定基因，應(yīng)用對數(shù)回歸，其揭示出D0K5、CD47和SFRPl似乎推動這種關(guān)聯(lián)(圖8a)。將8-基因特征標(biāo)識用來定義Wu數(shù)據(jù)中的FT樣亞群和OV樣亞群，并且密度曲線中評分的可視化顯示或多或少的雙峰分布(圖8b)，這支持劃分成兩個組(0V樣和FT樣)。值得注意地，使用這種評定系統(tǒng)時，歸于Wu數(shù)據(jù)集中的4份正常卵巢表面上皮樣品均劃分為OV樣。細(xì)胞源劃分與患者腫瘤中的臨床差異相關(guān)；FT樣亞群包括這些腫瘤，它們具有顯著更高的分期(P=3.27X_6)、等級(P=4.46X10_4)并且優(yōu)勢地由漿液性腫瘤組成(P=L 83 X 10_8)(圖Sc)。相比之下，OV樣腫瘤包括多種非漿液性組織學(xué)亞型，如子宮內(nèi)膜樣、透明細(xì)胞和粘液性腫瘤，并且包括等級更低的腫瘤。
[0191]進(jìn)一步在Tothill數(shù)據(jù)集(GE0GSE9891)中驗(yàn)證這種10基因特征標(biāo)識，其中所述Tothill數(shù)據(jù)集在相同平臺上排列來自246份漿液性腫瘤和20份子宮內(nèi)膜樣惡性腫瘤的新鮮冷凍腫瘤片(未進(jìn)行顯微解 剖)；重要地，這些組織可能與患者存活數(shù)據(jù)聯(lián)系。相同高斯混合建模法的應(yīng)用鑒定到OV樣和FT樣評分，所述評分不是明顯雙峰的，然而我們觀察到提示OV樣腫瘤小亞群的輕微左偏移(圖8d)。FT樣亞群顯著地富集漿液性腫瘤(P=0.0109)，含有更多的高分期腫瘤(這是非顯著的，P=0.0691)并且顯示與等級不相關(guān)(P=0.876)(圖8e)。FT樣腫瘤具有顯著更差的無疾病生存期(P=0.000297)和總生存期(P=0.0495)(圖8f)。由于Tothill數(shù)據(jù)集中缺少明顯的雙峰性，腫瘤錯誤劃分為OV樣或FT樣是可能的。然而，基于來自Wu和Tothill數(shù)據(jù)集的聯(lián)合結(jié)果，我們得出結(jié)論，細(xì)胞源特征標(biāo)識存在于輸卵管卵巢腫瘤中并且這種分類似乎闡明了先前未認(rèn)識的臨床上不同的輸卵管卵巢癌亞組。
[0192]b.轉(zhuǎn)化的與永生化的基因特征標(biāo)識。無論細(xì)胞來源如何，與其匹配的轉(zhuǎn)化細(xì)胞特征標(biāo)識(TCS)相比，不同細(xì)胞系使得評價正常永生化細(xì)胞特征標(biāo)識(ICS)之間的基因表達(dá)差異成為可能(圖9)。為了做到這一點(diǎn)，測量僅表達(dá)hTERT的永生化FNE/0CE和表達(dá)hTERT+LT/st和H-Ras癌基因的轉(zhuǎn)化FNLER/0CLER的mRNA表達(dá)譜。
[0193]結(jié)果表明，與TCS+卵巢癌相比，ICS+基因表達(dá)特征標(biāo)識預(yù)測出卵巢癌患者中統(tǒng)計(jì)顯著的更差臨床轉(zhuǎn)歸(圖9)。
[0194]與轉(zhuǎn)化的細(xì)胞特征標(biāo)識(TCS)相比，正常永生化細(xì)胞特征標(biāo)識(ICS)與更差結(jié)局相關(guān)(圖9A)。這個結(jié)果表明“轉(zhuǎn)化的細(xì)胞特征標(biāo)識”可以與針對化療的更好反應(yīng)相關(guān)并且預(yù)測更好的轉(zhuǎn)歸。在化療法治療后，對毗鄰于腫瘤的正常上皮的顯微鏡檢驗(yàn)幾乎從未顯示壞死或凋亡的跡象。相比之下，顯著的壞死、凋亡、炎癥和/或纖維化與腫瘤中的化療反應(yīng)相關(guān)。因?yàn)樯婕癉NA損傷反應(yīng)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、核苷酸和能量代謝的許多缺陷性途徑，腫瘤細(xì)胞可能對化療更敏感。
[0195]另外，在借助Tothill在其數(shù)據(jù)集中鑒定的經(jīng)驗(yàn)限定的不良轉(zhuǎn)歸組和通過檢驗(yàn)其數(shù)據(jù)集所鑒定的ICS特征標(biāo)識之間觀察到驚人的重疊。從我們劃歸為ICS的51個病例中，僅3個病例由Tothill劃歸為不良預(yù)后(Cl)。相比之下，85個ISC腫瘤中有46個由Tothill劃歸為不良預(yù)后(Cl)(圖9B)。
[0196]實(shí)施例6:腫瘤細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中的生長動力學(xué)
[0197]腫瘤是由許多細(xì)胞類型組成的復(fù)雜組織；這些細(xì)胞類型包括與腫瘤細(xì)胞混雜的多種間質(zhì)細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、正常上皮細(xì)胞等。在這些細(xì)胞類型當(dāng)中，成纖維細(xì)胞已經(jīng)在歷史上最早在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中生長。將腫瘤組織置于培養(yǎng)平板中時，一般存在成纖維細(xì)胞的爆發(fā)式生長，從而在幾周內(nèi)，成纖維細(xì)胞完全占據(jù)培養(yǎng)物，并且全部其他細(xì)胞類型包括腫瘤細(xì)胞很快從培養(yǎng)物中消除。在使用補(bǔ)充有血清的RPM1、DMEM、F12MCDB105/M199培養(yǎng)基幾乎全部情況下獲得相似的結(jié)果；成纖維細(xì)胞是正在增殖的主要細(xì)胞類型。因此，在這些培養(yǎng)基中，間質(zhì)細(xì)胞完全超越腫瘤細(xì)胞，并且不可能建立純的癌細(xì)胞系。
[0198]在其中不出現(xiàn)非腫瘤細(xì)胞過度生長的罕見樣品中，可能實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中的短期生長。然而，甚至在初始成功的這些罕見情況下，腫瘤細(xì)胞一般在幾周后在最頻繁地用來培養(yǎng)卵巢細(xì)胞系的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(如DMEM、F12、RPMI和MCDB105/M199)中生長停滯。此后一般是廣泛的細(xì)胞死亡。在大多數(shù)情況下無法建立連續(xù)細(xì)胞系并且在此時拋棄培養(yǎng)物。在非常罕見的情況下，亞克隆可以出現(xiàn)并產(chǎn)生連續(xù)細(xì)胞系。
[0199]在其中可以在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中建立連續(xù)腫瘤細(xì)胞系的那些情況下，通常觀察到4個階段；短暫快速生長幾周(a)，隨后是生長平臺期(b)，隨后廣泛的細(xì)胞死亡(C)和罕有細(xì)胞克隆的出現(xiàn)。
[0200]在圖10中最佳地圖示這種事件序列。當(dāng)人卵巢腫瘤樣品在RPMI培養(yǎng)基中鋪種時，腫瘤細(xì)胞在約5次群體倍增時生長停滯(圖1OA和10C，在第20-40日之前紅線和綠線的扁平部分)。之后是廣泛的細(xì)胞死亡，由細(xì)胞數(shù)目下降反映(圖1OA和10C，第40-50日，紅線和綠線的向下部分)。這種類型的生長動力學(xué)是在常規(guī)培養(yǎng)基中實(shí)施的絕大多少人類腫瘤培養(yǎng)常見的。
[0201]在使用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基的幾乎三十多次嘗試時，僅建立一個腫瘤細(xì)胞系。在這個唯一情況中，如上文所述，幾乎全部其他細(xì)胞被殺死之后，腫瘤細(xì)胞的克隆才在RPMI培養(yǎng)基中開始增殖(圖10A，紅線，第90日)。
[0202]90日后檢驗(yàn)在RPMI培養(yǎng)基中生成的腫瘤細(xì)胞克隆的基因組，與未培養(yǎng)的腫瘤DNA相比，出現(xiàn)顯著變化(圖10B)。相比之下，在WIT-oc中培育的腫瘤細(xì)胞與原始腫瘤十分相似(圖10B)。
[0203] 總之，存在一個例外，在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)基中腫瘤細(xì)胞最終死亡或培養(yǎng)物被成纖維細(xì)胞占據(jù)，因此，不能建立連續(xù)細(xì)胞系。類似地，Verschraegen等人將源自67位患者的90份不同卵巢癌標(biāo)本鋪種至RPMI培養(yǎng)基中，并且觀察到僅可以培養(yǎng)90份中的11份(12%、11/90)并且僅傳代15次。
[0204]傳代次數(shù)與群體倍增:[0205]傳代次數(shù)不等于群體倍增。圖1OA中提供這個觀點(diǎn)的例子。腫瘤細(xì)胞是在MCDB-105/M199中傳代幾乎20周。常見傳代頻率是每周一次，等同于總計(jì)20次傳代。然而，這些細(xì)胞的群體倍增曲線在7次傳代后是扁平的。因此，在第7代和第20代之間不存在凈增加。因此，這些細(xì)胞不能為實(shí)施任何有意義的實(shí)驗(yàn)提供實(shí)用平臺。它們在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中逐周從平板傳代至平板，而細(xì)胞數(shù)目增加很少。
[0206]建立培養(yǎng)物的滯后時間:
[0207]在我們的操作中，在細(xì)胞系于RPMI中出現(xiàn)之前觀察到90天滯后時間(圖10A)。一般因兩種過程觀察這個滯后時間；在這個滯后期期間大部分細(xì)胞死亡，這轉(zhuǎn)而導(dǎo)致已經(jīng)獲得新突變的罕有亞克隆出現(xiàn)并開始快速生長的連續(xù)細(xì)胞系。但是如圖10中所示，這以細(xì)胞培養(yǎng)物中獲得遺傳改變?yōu)榇鷥r出現(xiàn)。因此，這種細(xì)胞系將成為明顯偏離原始腫瘤細(xì)胞群體的克隆群體。
[0208]實(shí)施例7腫瘤細(xì)胞在WIT-oc培養(yǎng)基中的生長動力學(xué)。
[0209]腫瘤細(xì)胞在WIT-oc培養(yǎng)基中的生長是即刻的，無滯后時間。生長速率恒定，未觀察到生長平臺期或廣泛的細(xì)胞死亡(圖1OA和C，藍(lán)線)。這些結(jié)果表明，在WIT-oc培養(yǎng)基中，大部分鋪種的腫瘤細(xì)胞能夠在沒有顯著體外克隆性選擇的情況下增殖(圖1OA和C，藍(lán)線)。這一般是我們建立的全部細(xì)胞系的生長動力學(xué)。
[0210]此后，在WIT-oc培養(yǎng)基中建立的卵巢癌細(xì)胞系稱作OCI細(xì)胞系。
[0211]建立了 25個連續(xù)OCI細(xì)胞系；14個這些構(gòu)建體來自原代實(shí)體人卵巢組織，7個連續(xù)OCI細(xì)胞系來自腹水并且5個OCI細(xì)胞系來自起初在小鼠中培育的人腫瘤異體移植物(表 I)。
[0212]實(shí)施例8.不同亞型的卵巢腫瘤和輸卵管腫瘤的培養(yǎng)物:
[0213]卵巢的腺癌是由具有不同細(xì)胞特征、形態(tài)特征和臨床特征的至少6種主要組織病理學(xué)亞型組成的異質(zhì)性疾病。卵巢腺癌的主要亞型包括占據(jù)超過90%卵巢腺癌的乳頭狀漿液性、粘液性、子宮內(nèi)膜樣、透明細(xì)胞、鱗狀和過渡型。存在作為上皮表型和間充質(zhì)表型混合體的許多其他罕有卵巢腫瘤亞型如癌肉瘤和生殖細(xì)胞源腫瘤如無性細(xì)胞瘤。
[0214]已經(jīng)從6種不同亞型的人卵巢癌(包括特別難以生長的腫瘤類型如子宮內(nèi)膜樣癌和透明細(xì)胞癌)建立連續(xù)腫瘤細(xì)胞系(表1和2)。使用充分優(yōu)化的方法和培養(yǎng)條件，在26次嘗試中建立25個OCI系，全部這些OCI系均長期培養(yǎng)(>30次群體倍增)，成功率超過90%。全部25個腫瘤系均能夠形成軟瓊脂集落(表2)。
[0215]在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中，尚不可能高效地培育出不同亞型的卵巢癌。建立的絕大部分的連續(xù)腫瘤系來自高度侵入性乳頭狀漿液性卵巢癌，其他亞型幾乎無法培養(yǎng)。
[0216]另外，我們建立的細(xì)胞系中4個腫瘤細(xì)胞系來自原發(fā)性輸卵管癌。直至最近，大多數(shù)原發(fā)性繆勒氏管盆腔腫瘤被命名為卵巢癌。我們開發(fā)的培養(yǎng)系統(tǒng)用來從原代輸卵管和卵巢建立細(xì)胞系。
[0217]實(shí)施例9:標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中OCI細(xì)胞系的培養(yǎng):
[0218]在各種標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中檢驗(yàn)OCI系的生長。使用由美洲典型培養(yǎng)物保藏中心(ATTC)和ECACC推薦用于卵巢癌細(xì)胞的培養(yǎng)基。在從ATCC可獲得的七種(7)人卵巢腺癌當(dāng)中，僅3種具有可獲得的亞型信息；(I)透明細(xì)胞癌、一種(I)乳頭狀漿液性癌和一種(I)子宮內(nèi)膜樣癌細(xì)胞系。[0219]由ATCC推薦用于這些細(xì)胞系的培養(yǎng)基是MCDB-105/M199，或補(bǔ)充有10_15%血清的Dulbecco改良Eagle(DMEM)培養(yǎng)基或RPMI培養(yǎng)基。OCI系不能在這些培養(yǎng)基中生長。在圖11中顯示采用OCI系的這些實(shí)驗(yàn)的一個例子(頂部3幅小圖)。相比之下，我們測試的全部ATCC細(xì)胞系均可以在WIT-oc培養(yǎng)基中培育(圖11，底部3幅小圖)。這些結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基不能用來替代WIT-0C。
[0220]實(shí)施例10:原始腫瘤與OCI腫瘤系組織病理學(xué)的比較:
[0221]生物學(xué)中在形式和功能之間存在強(qiáng)烈關(guān)系。腫瘤亞型的特定組織病理學(xué)(形式)源自腫瘤細(xì)胞的遺傳程序和它們的微環(huán)境及全身性因素之間的復(fù)雜相互作用。
[0222]ATCC/ECACC卵巢腫瘤系產(chǎn)生不類似于任何人卵巢腫瘤亞型的分化不良的腫瘤(圖12A-12B)。相比之下，在WIT-oc培養(yǎng)基中培育的OCI系(OCI)產(chǎn)生具有與原始人腫瘤不可區(qū)分的組織病理學(xué)的腫瘤異體移植物(圖12C-12F)。
[0223]在常見的人卵巢乳頭狀漿液性癌(PSC)中，乳頭狀結(jié)構(gòu)物由含有血管的中央間質(zhì)芯形成。這些芯產(chǎn)生越來越小的乳突，所述乳突內(nèi)襯有最終形成最小分支的惡性上皮，所述最小分支由成簇的腫瘤細(xì)胞在幾乎沒有間質(zhì)芯的情況下形成(圖12E)。這是一種非常特異的構(gòu)造特征，它僅見于子宮和卵巢PSC中并且是這種腫瘤特有的。0C1-P9a系從人PSC建立，并且將它們注射入免疫受損小鼠時概括了人PSC的特異性構(gòu)造(圖12C)。這是非凡的結(jié)果，因?yàn)榇蟛糠之愺w移植腫瘤并不概括原始腫瘤的組織病理學(xué)特征。
[0224]卵巢中的另一個不同腫瘤亞型是子宮內(nèi)膜樣腺癌，它一般與圍繞中央光強(qiáng)組織的腺體背靠背形成。這些腫瘤一般缺少乳頭狀結(jié)構(gòu)物。這些腫瘤一般也表達(dá)雌激素受體和黏蛋白。從子宮內(nèi)膜樣腺癌建立的OC1-Elp系的確形成具有腺狀構(gòu)造的腫瘤，表達(dá)雌激素受體和黏蛋白，從而概括腫 瘤的原始表型。
[0225]總之，不同于產(chǎn)生類似于人卵巢癌的腫瘤的ATCC/ECACC標(biāo)準(zhǔn)卵巢癌系，OCI系產(chǎn)生在組織病理學(xué)水平上作為人卵巢癌的形態(tài)表型副本的腫瘤。
[0226]實(shí)施例11:原始腫瘤與OCI腫瘤系DNA的比較:
[0227]單核苷酸多態(tài)性(SNP)芯片允許一種高分辨率方法來比較培養(yǎng)的卵巢腫瘤細(xì)胞和它們源自其中的原代未培養(yǎng)腫瘤組織的DNA。這種分析允許基因組級別地檢測染色體拷貝數(shù)變化、重排和雜合性喪失(LOH)。
[0228]檢驗(yàn)了 12個OCI系和匹配性原始腫瘤組織以及9個ATCC卵巢癌系的基因組DNA。來自細(xì)胞系及其親本腫瘤的基因組DNA雜交于AffymetriX250K SNP陣列并且相對于正常參考DNA進(jìn)行分析。將這些數(shù)據(jù)在熱圖中作圖，其中存在反常變化的DNA區(qū)域以藍(lán)色突出顯示并且無可檢測變化的區(qū)域以黃色突出顯示。這些交替的黃色和藍(lán)色SNP條帶的基因組級圖樣為每種腫瘤提供獨(dú)特的DNA指紋，并且與原始腫瘤相比，允許驗(yàn)證培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞。
[0229]在基因組DNA的CGH圖譜中存在驚人的相似性，其中所述基因組DNA來自未培養(yǎng)的原代腫瘤組織和在WIT-oc中培育的細(xì)胞。數(shù)據(jù)的非監(jiān)督層次聚類顯示每種OCI系毗鄰其親本腫瘤組織聚類。OCI系保留了原始腫瘤的大量基因組特征標(biāo)識，從而毗鄰于原始腫瘤DNA參比，可以正確地鑒定它們。人腫瘤含有多個亞克隆，它們具有每個亞克隆特有的一系列特有DNA改變。因此，腫瘤的基因組級SNP追蹤是分析原始腫瘤的全基因組異質(zhì)性的一種優(yōu)異方法。這些結(jié)果表明我們已經(jīng)能夠在細(xì)胞培養(yǎng)物上保留大部分的這種異質(zhì)性。
[0230]在OCI系之間，基因組改變的規(guī)模分成兩個不同組。兩個OCI系(OC1-Ulp和P3a)和它們的匹配腫瘤具有涉及至多整個染色體臂的大規(guī)模改變(圖13，紅色比例尺，左邊4條泳道)。相比之下，其他10個OCI系和它們的匹配腫瘤含有涉及狹窄染色體區(qū)域的基因組改變(圖13，中央20條泳道，紅色比例尺)。這些改變跨基因組分布，沒有清晰的熱點(diǎn)。
[0231]對于ATCC卵巢腫瘤系，患者配對的匹配腫瘤DNA不是公開可獲得的。這些細(xì)胞系中許多在數(shù)十年前建立，并且不確定是否可以定位未培養(yǎng)的腫瘤組織片以便與原始腫瘤比較。因此，ATCC/ECACC系不能與原始腫瘤組織比較。然而，ATCC/ECACC系中DNA改變的分布仍可提供信息，因?yàn)槿緼TCC/ECACC系無一例外地含有大規(guī)模的I型基因組改變(圖13，藍(lán)色比例尺，右側(cè)9個條泳道)，與更細(xì)微小規(guī)模改變圖樣的OCI系的主要圖樣形成對比。
[0232]SNP圖譜提供每種腫瘤的不同和獨(dú)特指紋，這允許相對于原始腫瘤測試和鑒定每種細(xì)胞系(圖13)。
[0233]實(shí)施例12:0CI腫瘤系的mRNA表達(dá)譜: [0234]從不同卵巢腫瘤亞型建立的OCI系的mRNA表達(dá)譜具有不同的mRNA表達(dá)特征標(biāo)識。來自12個OCI系、5個正常卵巢的和輸卵管系和5個ATCC/ECACC系的mRNA與Affymetrix U133Plus芯片雜交。數(shù)據(jù)的非監(jiān)督層次聚類揭示，從乳頭狀衆(zhòng)液性癌、子宮內(nèi)膜樣癌和透明細(xì)胞癌建立的腫瘤細(xì)胞系基于它們的腫瘤來源而形成獨(dú)立的不同組(圖14)。另外，mRNA表達(dá)特征標(biāo)識區(qū)別于正常卵巢上皮(OCE)和輸卵管上皮(FNE)并且區(qū)別于ATCC/ECACC卵巢癌細(xì)胞系。
[0235]這些結(jié)果證實(shí)OCI系保留了顯著水平的原始腫瘤基因表達(dá)譜，其足以在培養(yǎng)時彼此區(qū)分這些腫瘤類型。另外，它們表明在ATCC系和OCI系之間存在數(shù)百個基因表達(dá)的顯著差異。
[0236]實(shí)施例13:0CI腫瘤系的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜:
[0237]從不同卵巢腫瘤亞型建立的OCI系的蛋白質(zhì)表達(dá)譜具有不同的蛋白質(zhì)表達(dá)特征標(biāo)識。用反相蛋白質(zhì)測定法(RPPA)檢驗(yàn)OCI系的蛋白質(zhì)提取物，這揭示OCI系再次根據(jù)它們的腫瘤來源聚類。從乳頭狀漿液性癌、子宮內(nèi)膜樣癌和透明細(xì)胞癌建立的OCI系形成獨(dú)立的聚類(圖15)。另外，蛋白質(zhì)表達(dá)特征標(biāo)識區(qū)別于正常卵巢上皮(OCE)和輸卵管上皮(FNE)并且區(qū)別于ATCC卵巢癌細(xì)胞系。
[0238]這些結(jié)果證實(shí)OCI系保留了顯著水平的原始腫瘤蛋白質(zhì)表達(dá)譜，其足以在培養(yǎng)時彼此正確區(qū)分這些腫瘤類型并與正常細(xì)胞正確區(qū)分。另外，這些結(jié)果表明在ATCC/ECACC系和OCI系之間存在許多蛋白質(zhì)表達(dá)的顯著差異。
[0239]實(shí)施例14 =OCI系的藥物反應(yīng):
[0240]如上文所述，OCI系的DNA、RNA和蛋白質(zhì)圖譜顯著不同于從ATCC和ECACC腫瘤細(xì)胞系庫可獲得的常規(guī)卵巢癌系。這提出以下可能性:0CI腫瘤系的藥物反應(yīng)因此也可能不同于ATCC/ECACC卵巢腫瘤系。
[0241]U0126是抑制促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的藥物例子。MAPK是促分裂原活化激酶的成員，也稱作“胞外信號調(diào)節(jié)的激酶”(ERK)。在癌中頻繁擴(kuò)增并過量表達(dá)的許多生長因子如EGF和其他受體酪氨酸激酶激活MAPK/ERK途徑。此外，許多突變的癌基因(如Ras)激活MAPK/ERK，這使該途徑在許多類型癌癥的發(fā)展中成為中心途徑。因此，MAPK/ERK途徑的許多組分是抗癌藥物開發(fā)的活躍領(lǐng)域活性。
[0242]檢驗(yàn)了ATCC/ECACC 系(SK0V3、0V90、T0V_1120 和 A2780)和 OCI 卵巢腫瘤系(C5x、P9al、P7a和FC1-Plp)對MAPK抑制劑U0126的反應(yīng)。將OCI細(xì)胞系和ATCC/ECACC細(xì)胞系均一式三份在WIT-oc培養(yǎng)基(5000個細(xì)胞/孔)中鋪種至96孔平板。次日，將MAPK抑制劑U0126的連續(xù)稀釋物添加至該平板。與藥物孵育144小時后，用阿爾瑪藍(lán)測定法測量活細(xì)胞，度量為590/530熒光。
[0243]在MAPK抑制劑對OCI細(xì)胞與ATCC/ECACC的影響方面存在顯著差異。如預(yù)期，5uM的U0126抑制ATCC/ECACCC細(xì)胞系增殖50% (LD5tl)。相比之下，在OCI系中需要大約5倍更多的 U0126 以實(shí)現(xiàn) 50% 抑制(LD50>30uM)(圖 16A)。
[0244]紫杉醇是抑制微管裝配的藥物例子。微管是作為細(xì)胞骨架的部分的纖絲，其中所述細(xì)胞骨架參與細(xì)胞分裂和囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)。需要微管組合體來建立在有絲分裂期間使染色體分離進(jìn)入子代細(xì)胞的紡錘絲。因此，抑制微管的藥物也抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。
[0245]在96孔平板中的WIT-oc培養(yǎng)基(5000個細(xì)胞/孔)中一式三份鋪種OCI卵巢腫瘤系(P7a、P2a、C2p)和ATCC/ECACC卵巢腫瘤系(ES2和0V90)。次日，將紫杉醇的連續(xù)稀釋物添加至該平板。與藥物孵育72小時后，用阿爾瑪藍(lán)測定法將活細(xì)胞度量為590/530熒光。
[0246]在紫杉醇對OCI細(xì)胞與ATCC/ECACC的影響方面存在明顯差異。與ATCCC/ECACC系相比，紫杉醇的導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞數(shù)目下降50%的濃度(LD9tl)在OCI系中高出超過5倍(圖16B)。
[0247]順鉬是造成DNA交聯(lián)的化療藥物例子。順鉬與DNA結(jié)合并且化學(xué)地交聯(lián)兩條鏈，這造成細(xì)胞分裂期間的DNA損傷。這激發(fā)修復(fù)機(jī)制，當(dāng)證明不可能修復(fù)時，所述修復(fù)機(jī)制轉(zhuǎn)而激活凋亡。我們在平板中的WIT-oc培養(yǎng)基(5000個細(xì)胞/孔)中一式三份鋪種的OCI卵巢腫瘤系(P7a、P2a、C2p)和ATCC/ECACC卵巢腫瘤系(ES2和0V90)。次日，將順鉬的連續(xù)稀釋物添加至該平板。與`藥物孵育72小時后，用阿爾瑪藍(lán)測定法將活細(xì)胞度量為590/530熒光。
[0248]在順鉬對OCI細(xì)胞系與ATCC/ECACC細(xì)胞系的影響方面存在明顯差異。與ATCCC/ECACC系相比，這些藥物的導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞數(shù)目下降50%的濃度(LD9tl)在OCI系中高出超過6倍(圖7C)。
[0249]因此，與常規(guī)的卵巢癌細(xì)胞系(ATCC/ECACC)相比，OCI系對作用機(jī)制各異的十分不同的三類癌癥藥物更耐受。
[0250]紫杉醇和順鉬是治療卵巢癌時常使用的一線藥物，因此上文描述結(jié)果對于開發(fā)更好治療法是高度有意義的?，F(xiàn)存腫瘤細(xì)胞系的一個缺點(diǎn)是它們對抗癌藥物的高水平靈敏度。這種靈敏度導(dǎo)致藥物開發(fā)期間的許多“假陽性”結(jié)果，即；能夠殺死培養(yǎng)下的細(xì)胞系的藥物被挑選用于進(jìn)一步前臨床和臨床開發(fā)。然而，當(dāng)患者中測試時，有效消滅腫瘤細(xì)胞系的這些藥物中許多證明在臨床中證明無效。腫瘤細(xì)胞系的藥物敏感性與患者之間缺少相關(guān)性是快速開發(fā)有效癌癥治療法的主要障礙。攜帶具有OCI樣基因表達(dá)特征標(biāo)識的卵巢腫瘤患者的存活:攜帶具有OCI樣基因表達(dá)譜的腫瘤的卵巢腫瘤患者比攜帶具有ATCC樣表達(dá)譜的腫瘤的卵巢腫瘤患者具有統(tǒng)計(jì)顯著更差的存活(圖17)。這與反應(yīng)上文描述的體外藥物結(jié)果一致，在所述結(jié)果中OCI系更耐受最常用來治療卵巢癌患者的藥物，如紫杉醇和順鉬。這些結(jié)果表明與現(xiàn)存在的腫瘤細(xì)胞系相比，OCI系的確提供更多關(guān)于患者治療反應(yīng)的相關(guān)信肩、O[0251]實(shí)施例15:除輸卵管-卵巢來源之外的腫瘤類型已經(jīng)在WIT-oc培養(yǎng)基中成功培育。
[0252]從人乳腺癌、胰腺癌、腺樣囊性癌、來自肺或來自胃腸道的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(類癌)取出幾份腫瘤樣品并且在WIT-oc培養(yǎng)基中測試。本文中所述的方法和培養(yǎng)基使得培養(yǎng)這些腫瘤成為可能(圖18)。
[0253]表格
[0254]表1.從不同腫瘤亞型建立的連續(xù)卵巢腫瘤細(xì)胞系的數(shù)目的匯總。該表顯示，列出了從原發(fā)性實(shí)體瘤、惡性腹水或從異體移植腫瘤以及從不同輸卵管卵巢亞型建立的原代輸卵管卵巢癌細(xì)胞系的數(shù)目。
[0255]
【權(quán)利要求】
1.細(xì)胞培養(yǎng)基，或用于制備細(xì)胞培養(yǎng)基的試劑盒，其包含: (a)三磷酸腺苷； (b)載體蛋白； (C)膽固醇、亞油酸和硫辛酸； (d)谷胱甘肽； (e)選自次黃嘌呤、黃嘌呤、腺嘌呤、鳥嘌呤和胸苷的核苷酸補(bǔ)救途徑前體堿基； (f)磷脂酰乙醇胺； (g)硒； (h)轉(zhuǎn)鐵蛋白； (i)三碘甲腺原氨酸； (j)維生素A、維生素C和維生素D ；
(k) Zn、Mg 和 Cu ； (I)增加胞內(nèi)cAMP的藥劑； (m)表皮生長因子(EGF)； (η)氫化可的松； (ο)胰島素；和` (P)血清。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其還包含腺苷單磷酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其還包含維生素Ε。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述載體蛋白是白蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述核苷酸補(bǔ)救途徑前體堿基是黃嘌呤或次黃嘌呤。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含黃嘌呤和次黃嘌呤。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其還包含維生素Κ3、煙酸或煙酰胺中的至少一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中增加胞內(nèi)cAMP的試劑是霍亂毒素。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含10ng/mL和70ng/mL之間的霍亂毒素。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含20ng/mL和25ng/mL之間的霍亂毒素。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含約20ng/mL的霍亂毒素。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含約25ng/mL的霍亂毒素。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含3ng/mL和50ng/mL之間的EGF。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含約10ng/mL的EGF。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含.0.005 μ g/mL和1.5 μ g/mL之間的氫化可的松。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含.1.0 μ g/mL和75.0 μ g/mL之間的胰島素。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含0.2%和.10.0%v/V之間的血清。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含1.0%和5.0%ν/ν之間的血清。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含1.8%v/v和2%v/v之間的血清。
20.根據(jù)權(quán)利要求所述19的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含約1.8%v/v的血清。
21.根據(jù)權(quán)利要求18-20中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含.0.15 μ g/mL和0.3 μ g/mL之間的氫化可的松。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含約0.15 μ g/mL的氫化可的松。
23.根據(jù)權(quán)利要求18-22中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含.5.0 μ g/mL和50.0 μ g/mL之間的胰島素。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含約15.0 μ g/mL的胰島素。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其還包含雌激素。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基以具有與30nM和300nM之間的17-β -雌二醇等同效力的濃度包含雌激素。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基以具有與約.100ηΜ17-β-雌二醇等同效力的濃度包含雌激素。
28.根據(jù)權(quán)利要求24-27中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述雌激素是17-β-雌二醇。
29.根據(jù)權(quán)利要求1-23中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基基本上不含雌激素。
30.根據(jù)權(quán)利要求17所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含0.2%ν/ν和5.0%ν/V之間的血清。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含0.25%ν/ν和.0.75%ν/ν之間的血清。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含約0.5%ν/ν的血清。
33.根據(jù)權(quán)利要求30-32中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含.0.25 μ g/mL和0.50 μ g/mL之間的氫化可的松。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含約0.5 μ g/mL的氫化可的松。
35.根據(jù)權(quán)利要求30-34中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含.5.0 μ g/mL和50.0 μ g/mL之間的胰島素。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基包含約20.00 μ g/mL的胰島素。
37.根據(jù)權(quán)利要求1-29中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基支持卵巢腫瘤細(xì)胞體外增殖至少約15次群體倍增(PD)。
38.根據(jù)權(quán)利要求1-17和30-36中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基支持卵巢細(xì)胞和/或輸卵管細(xì)胞體外增殖至少約15次群體倍增(PD)。
39.用于制備根據(jù)權(quán)利要求1-38中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)基的試劑盒，其包括一個或多個包含組分(a)-(k)的第一容器和一個或多個包含組分(l)-(p)和任選地雌激素的第二容器，從而以適宜的比例組合第一容器和第二容器的內(nèi)容物產(chǎn)生所述細(xì)胞培養(yǎng)基。
40.細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)充物，其中所述補(bǔ)充物包含: (a)增加胞內(nèi)cAMP的試劑； (b)表皮生長因子(EGF)； (c)氫化可的松； (d)胰島素； (e)血清；和任選地， (f)雌激素， 其中向基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基添加所述補(bǔ)充物產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1-38中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)基。`
41.一種制備根據(jù)權(quán)利要求1-38中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)基的方法,其包括混合組分(a)-(p)和任選地雌激素。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中從一個或多個第一容器添加組分(a)-(k)，并且從一個或多個第二容器添加組分(I)-(P)和任選地雌激素。
43.一種用于培養(yǎng)卵巢細(xì)胞和輸卵管細(xì)胞的方法，其包括: (a)從卵巢或輸卵管獲得卵巢和/或輸卵管細(xì)胞； (b)在根據(jù)權(quán)利要求1-17、30-36和38中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞， 其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基支持卵巢上皮細(xì)胞和輸卵管上皮細(xì)胞的至少15次群體倍增。
44.一種用于培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的方法，其包括: (a)獲得腫瘤細(xì)胞； (b)在根據(jù)權(quán)利要求1-17、18-29和37中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞， 其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基支持所述腫瘤細(xì)胞的至少15次群體倍增。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，還包括對于前1-5次細(xì)胞傳代用胰蛋白酶處理培養(yǎng)平板，從而富集癌細(xì)胞。
46.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞是卵巢癌細(xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞、腺樣囊性癌細(xì)胞和/或來自肺或胃腸道的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(類癌)細(xì)胞。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞是卵巢癌細(xì)胞。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述卵巢癌細(xì)胞從患者的原代實(shí)體卵巢組織或腹水獲得，或從在動物模型中培育的腫瘤異體移植物獲得。
49.根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞是乳頭狀漿液性腫瘤細(xì)胞、透明細(xì)胞腫瘤細(xì)胞、癌肉瘤細(xì)胞或無性細(xì)胞瘤細(xì)胞。
50.根據(jù)權(quán)利要求48所述的方法，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)基還以與約100ηΜ17-β-雌二醇等效的量包含雌激素，并且所述腫瘤細(xì)胞是子宮內(nèi)膜樣腫瘤細(xì)胞或粘液性腫瘤細(xì)胞。
51.根據(jù)權(quán)利要求39所述的試劑盒，其中所述培養(yǎng)基支持細(xì)胞體外增殖至少15、25或35次群體倍增(PD)。
52.一種組合物，其包含 權(quán)利要求1-17、30-36和38中任一項(xiàng)所述的細(xì)胞培養(yǎng)基，和 細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是永生化的卵巢細(xì)胞和/或輸卵管細(xì)胞。
53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的組合物，其中所述永生化細(xì)胞過量表達(dá)端粒酶的催化性亞基。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的組合物，其中所述端粒酶的催化性亞基是人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)。
55.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述卵巢細(xì)胞是卵巢上皮細(xì)胞。
56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中所述卵巢上皮細(xì)胞源自卵巢表面。
57.根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其中所述輸卵管細(xì)胞是輸卵管上皮細(xì)胞。
58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述輸卵管上皮細(xì)胞源自輸卵管的纓飾表面。
59.—種鑒定候選治療藥的方法,包括: (a)根據(jù)權(quán)利要求43-50所述的方法培養(yǎng)細(xì)胞； (b)使細(xì)胞與藥物接觸；以及 (c)測量所述細(xì)胞的一個或多個生理特征； 其中調(diào)節(jié)細(xì)胞的一個或多個生理特征的藥物是候選治療藥。
60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，還包括在步驟(b)之前，在試驗(yàn)動物中培育步驟(a)的細(xì)胞。
61.根據(jù)權(quán)利要求59和60所述的方法，其中所述細(xì)胞是致癌轉(zhuǎn)化的卵巢細(xì)胞和/或輸卵管細(xì)胞。
62.根據(jù)權(quán)利要求59和60所述的方法，其中所述細(xì)胞源自原發(fā)性腫瘤。
63.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中所述原發(fā)性腫瘤是卵巢腫瘤。
64.根據(jù)權(quán)利要求63所述的方法，其中所述卵巢腫瘤是以下的至少一種:乳頭狀漿液性腫瘤、透明細(xì)胞腫瘤、癌肉瘤、無性細(xì)胞瘤、子宮內(nèi)膜樣腫瘤或粘液性腫瘤。
65.根據(jù)權(quán)利要求59-64中任一項(xiàng)所述的方法，其中測量的生理特征包括細(xì)胞增殖，并且抑制細(xì)胞增殖的藥物是候選治療藥。
66.基本上純化的卵巢細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述卵巢細(xì)胞過量表達(dá)探針集合DOK5、CD47、HS6ST3、DPP6、OSBLP3 ;其中所述培養(yǎng)物包含至少IO3個細(xì)胞；并且其中所述細(xì)胞能夠發(fā)生至少14次群體倍增。
67.基本上純化的輸卵管細(xì)胞培養(yǎng)物，其中所述輸卵管細(xì)胞過量表達(dá)探針集合STC2、SFRPl、SLC35F3、SHMT2、TMEM164 ;其中所述培養(yǎng)物包含至少IO3個細(xì)胞；并且其中所述細(xì)胞能夠進(jìn)行至少14次群體倍增。
68.一種培養(yǎng)物，包含其中hTERT已經(jīng)過量表達(dá)的細(xì)胞，其中hTERT的過量表達(dá)足以使得所述細(xì)胞能夠進(jìn)行至少14次群體倍增。
69.根據(jù)權(quán)利要求66、67或68所述的培養(yǎng)物，其中hTERT的過量表達(dá)足以使得所述細(xì)胞能夠進(jìn)行至少25次群體倍增。
70.根據(jù)權(quán)利要求66、67或68所述的培養(yǎng)物，其中hTERT的過量表達(dá)足以使得所述細(xì)胞能夠進(jìn)行至少35次 群體倍增。
【文檔編號】C12N5/09GK103732737SQ201280023104
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年3月23日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月24日
【發(fā)明者】T·A·因斯 申請人:懷特黑德生物制劑研究所, 布里格海姆婦女醫(yī)院公司