修飾型α-葡萄糖苷酶及其用途
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明的課題在于提供糖轉(zhuǎn)移活性占主導(dǎo)的α-葡萄糖苷酶及其用途等。由α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列中的選自以下中的一個(gè)或兩個(gè)以上的氨基酸被其它氨基酸取代而成的氨基酸序列構(gòu)成的修飾型α-葡萄糖苷酶:與序列號(hào)1所示的氨基酸序列的第385位、第491位、第535位、第450位、第534位、第537位、第538位、第554位、第556位、第630位、第683位或第689位的氨基酸相當(dāng)?shù)陌被?，或者，與序列號(hào)2所示的氨基酸序列的第579位或第585位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被帷?br> 【專(zhuān)利說(shuō)明】修飾型Cl-葡萄糖苷酶及其用途【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及修飾型α-葡萄糖苷酶。更具體而言，涉及修飾型α-葡萄糖苷酶，修飾型α-葡萄糖苷酶的設(shè)計(jì)方法及制造方法，以及修飾型α-葡萄糖苷酶的用途。本申請(qǐng)主張基于2011年3月16日提出申請(qǐng)的日本專(zhuān)利申請(qǐng)第2011 — 057386號(hào)的優(yōu)先權(quán)，通過(guò)參照而援引該專(zhuān)利申請(qǐng)的全部?jī)?nèi)容。
【背景技術(shù)】
[0002]糖水解酶是通過(guò)斷裂酯鍵進(jìn)行分解的酶，但同時(shí)大量報(bào)道了具有糖轉(zhuǎn)移活性?？煞Q(chēng)為糖水解酶的代表的α-葡萄糖苷酶也通常具有水解活性(水解反應(yīng))和糖轉(zhuǎn)移活性(縮合反應(yīng))。α-葡萄糖苷酶廣泛存在于從微生物到高等動(dòng)物以及高等植物的自然界。α -葡萄糖苷酶在產(chǎn)業(yè)上也是一種有用的酶，其可用于糖的降解和合成。
[0003]通過(guò)技術(shù)的進(jìn)步，已經(jīng)能夠?qū)崿F(xiàn)改變(改良)酶的特性。對(duì)于α -葡萄糖苷酶，也已作出多種改變的嘗試(例如參照專(zhuān)利文獻(xiàn)I?3)。
[0004]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0005]專(zhuān)利文獻(xiàn)
[0006]專(zhuān)利文獻(xiàn)1:日本特開(kāi)2003-88365號(hào)公報(bào)
[0007]專(zhuān)利文獻(xiàn)2:日本特開(kāi)2005-253302號(hào)公報(bào)
[0008]專(zhuān)利文獻(xiàn)3:日本特開(kāi)2009-22204號(hào)公報(bào)
[0009]專(zhuān)利文獻(xiàn)4:日本特開(kāi).2001-046096號(hào)公報(bào)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]在產(chǎn)業(yè)用途中使用α -葡萄糖苷酶時(shí)，由于通常使用水解活性或糖轉(zhuǎn)移活性中的任一個(gè)，因此優(yōu)選不使用的活性低。將α-葡萄糖苷酶用于低聚糖的生產(chǎn)時(shí)，水解活性成為阻礙，低聚糖的生產(chǎn)效率降低。因此，本發(fā)明的課題在于提供適于低聚糖的生產(chǎn)、糖轉(zhuǎn)移活性占主導(dǎo)的α-葡萄糖苷酶。另外，本發(fā)明的課題也在于提供其用途等。
[0011]本發(fā)明人等以設(shè)計(jì)提高低聚糖生產(chǎn)能力的新型酶為目的，已經(jīng)嘗試在分子水平上對(duì)現(xiàn)有的α-葡萄糖苷酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)改變。具體而言，利用源自人小腸的α-葡萄糖苷酶(人麥芽糖酶-糖化酶)的X射線晶體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果，進(jìn)行對(duì)計(jì)算機(jī)模擬以及與四種同源物的比對(duì)比較。其結(jié)果，確定了構(gòu)成酶的底物口袋的三個(gè)位置的氨基酸。接下來(lái)，在黑曲霉的α -葡萄糖苷酶的氨基酸序列上確定了與該氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔诖嘶A(chǔ)上，將突變導(dǎo)入其中。研究得到的修飾體的特性，結(jié)果確認(rèn)酶的特性得到了顯著改變(特別是水解活性和糖轉(zhuǎn)移活性的平衡)。在修飾體中，確認(rèn)了不顯示對(duì)α-1，4鍵和α_1，6鍵的水解活性的酶,對(duì)α-1，6鍵的水解活性顯著降低的酶，對(duì)α-1,3鍵和α-1，6鍵的水解活性大幅降低的酶等。特別值得注意的是，野生型主要是生成在α-1，6位糖轉(zhuǎn)移的低聚糖，與此相對(duì)，修飾體(W343M型和W343M/S496T型)僅生成在α-1，4位糖轉(zhuǎn)移的低聚糖。這些事實(shí)意味著，以獲得適用于低聚糖的生產(chǎn)等的α-葡萄糖苷酶(即，糖轉(zhuǎn)移活性占主導(dǎo)的α-葡萄糖苷酶)為目的進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾時(shí)，作為導(dǎo)入突變的位置，成功確定了的上述氨基酸的位置是有效的。另外，該氨基酸的位置，可以說(shuō)為了獲得顯示α-1，4位特異性糖轉(zhuǎn)移活性的獨(dú)特特性的α-葡萄糖苷酶而作為突變位置是特別有效的。另一方面，成功取得的修飾型α-葡萄糖苷酶其本身在工業(yè)生產(chǎn)中有很大的價(jià)值。
[0012]本發(fā)明人等進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，使用新的方法研究了突變導(dǎo)入位點(diǎn)。具體而言，首先，使用其它計(jì)算機(jī)模擬軟件，構(gòu)建關(guān)于黑曲霉的α-葡萄糖苷酶和構(gòu)巢曲霉的α-葡萄糖苷酶的立體結(jié)構(gòu)模型。接下來(lái)，進(jìn)行對(duì)接模擬分析，進(jìn)行底物口袋的預(yù)測(cè)。然后，根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果，檢索作為活性中心的氨基酸，確定在各立體結(jié)構(gòu)模型中的位置。然后，在黑曲霉的α -葡萄糖苷酶和構(gòu)巢曲霉的α -葡萄糖苷酶之間比較氨基酸序列，將構(gòu)成底物口袋的氨基酸中不一致的氨基酸確定為適于導(dǎo)入突變的氨基酸。接下來(lái)，為了確認(rèn)這些氨基酸是否適合于導(dǎo)入突變(換而言之，是否是有益于結(jié)構(gòu)修飾的氨基酸)，得到對(duì)兩個(gè)氨基酸實(shí)際導(dǎo)入突變的修飾體。對(duì)得到的各修飾體的特性進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了顯示α?，6位特異性轉(zhuǎn)移活性的修飾體、顯示α 1，4位特異性轉(zhuǎn)移活性的修飾體。這一事實(shí)證明，成功確定了的氨基酸位置對(duì)結(jié)構(gòu)修飾是有效的。另一方面，成功獲得的修飾型α-葡萄糖苷酶其本身在工業(yè)中有很大的價(jià)值。
[0013]另一方面，進(jìn)一步研究的結(jié)果表明，成功獲得的修飾體對(duì)低聚糖的生產(chǎn)乃至制造是有用的。值得注意的是，對(duì)于顯示α?，6位特異性轉(zhuǎn)移活性的修飾體，通過(guò)與野生型α-葡萄糖苷酶并用，也能夠由具有α 1，4鍵的底物生成低聚糖。
[0014]另外，大量經(jīng)驗(yàn)表明，通過(guò)將有效的兩個(gè)氨基酸取代進(jìn)行組合，取得相加的或相乘的效果的可能性高。因此，成功確定的三個(gè)突變位置不僅單獨(dú)是有效的，其組合對(duì)特性的變化(特別是糖轉(zhuǎn)移活性的提高)可以說(shuō)也是有效的。事實(shí)上，在對(duì)兩個(gè)位置的氨基酸取代進(jìn)行組合的情形中，糖轉(zhuǎn)移活性提高了(后述的實(shí)施例)。
[0015]另外，對(duì)于同種的酶，鑒于結(jié)構(gòu)(一級(jí)結(jié)構(gòu)、立體結(jié)構(gòu))相似性高，相同的突變產(chǎn)生相同的效果的可能性高這樣的技術(shù)常識(shí)，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)的突變技術(shù)不局限于后述實(shí)施例所示的源自黑曲霉的α-葡萄糖苷酶，對(duì)其它生物來(lái)源的α-葡萄糖苷酶同樣適用。
[0016]下面所示的本發(fā)明基于上述的成果和研究。
[0017][I] 一種修飾型α -葡萄糖苷酶，其特征在于，由α -葡萄糖苷酶的氨基酸序列中選自以下(I)?(14)中的一個(gè)或兩個(gè)以上的氨基酸被其它氨基酸取代而成的氨基酸序列構(gòu)成:
[0018](I)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第385位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0019](2)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第491位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0020](3)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第535位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0021](4)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第450位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0022](5)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第534位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0023](6)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第537位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0024](7)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第538位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0025](8)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第554位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0026](9)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第556位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0027](10)與序列號(hào)2所示的氨基酸序列的第579位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被?；[0028](11)與序列號(hào)2所示的氨基酸序列的第585位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0029](12)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第630位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0030](13)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第683位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0031](14)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第689位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被帷?br> [0032][2]根據(jù)[I]所述的修飾型α _葡萄糖苷酶，其中，α _葡萄糖苷酶包括人類(lèi)麥芽糖酶-糖化酶(Human Maltase-glucoamylase)、黑曲霉 α _ 葡萄糖苷酶(Aspergillus nigeralpha-glucosidase)、人中性 α -葡萄糖苷酶C (Human Neutral alpha-glucosidase C)、鼠溶酶體α -葡萄糖昔酶(Mouse Lysosomal alpha-glucosidase)、酵母的ct -葡萄糖昔酶(Yeast GLU2A),構(gòu)巢曲霉的 α -葡萄糖苷酶 A (Aspergillus nidulans Alpha-glucosidaseAgdA)、構(gòu)巢曲霉的 ct -葡萄糖苷酶 B (Aspergillus nidulans Alpha-glucosidaseAgdB)、爪睡毛霉的 α-葡萄糖苷酶(Mucor javanicus alpha-glucosidase)、米曲霉的α -葡萄糖苷酶(Aspergillus oryzae alpha-glucosidase)、蔥狀被孢霉的α-葡萄糖苷酶(Mortierella alliacea alpha-glucosidase)、粟酒裂殖酵母的α-葡萄糖苷酶(Schizosaccharomyces pombe alpha-glucosidase)、德巴利酵母的 ct-葡萄糖昔酶(Debaryomyces occidentalis alpha-glucosidase)、大麥的 α -葡萄糖苷酶(Hordeumvulgare subsp.vulgare alpha-glucosidase)、擬南芥的 α -葡萄糖苷酶(Arabidopsisthaliana alpha-glucosidase)、菠菜的 α -葡萄糖苷酶(Spinacia oleraceaalpha-glucosidase)、甜菜的 α -葡萄糖苷酶(Beta vulgaris alpha-glucosidase)或馬鈴薯的 α -葡萄糖苷酶(Solanum tuberosum alpha-glucosidase)。
[0033][3]根據(jù)[I]所述的修飾型α -葡萄糖苷酶，其中，α -葡萄糖苷酶的序列為序列號(hào)2的氨基酸序列，(I)的氨基酸為該氨基酸序列第343位氨基酸；(2)的氨基酸為該氨基酸序列第452位氨基酸；(3)的氨基酸為該氨基酸序列第496位氨基酸；(4)的氨基酸為該氨基酸序列第410位氨基酸；(5)的氨基酸為該氨基酸序列第495位氨基酸；(6)的氨基酸為該氨基酸序列第498位氨基酸；(7)的氨基酸為該氨基酸序列第499位氨基酸；(8)的氨基酸為該氨基酸序列第531位氨基酸；(9)的氨基酸為該氨基酸序列第533位氨基酸；(12)的氨基酸為該氨基酸序列第662位氨基酸；(13)的氨基酸為該氨基酸序列第715位氨基酸；(14)的氨基酸為該氨基酸序列第721位氨基酸。
[0034][4]根據(jù)[3]所述的修飾型α _葡萄糖苷酶，其中，被取代的氨基酸是(I)的氨基酸，取代后的氨基酸是半胱氨酸、天冬氨酸、蛋氨酸、組氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸，甘氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、纈氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或異亮氨酸。
[0035][5]根據(jù)[3]所述的修飾型α _葡萄糖苷酶，其中，被取代的氨基酸是(2)的氨基酸，取代后的氨基酸是甘氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。
[0036][6]根據(jù)[3]所述的修飾型α _葡萄糖苷酶，其中，被取代的氨基酸是(3)的氨基酸，取代后的氨基酸是天冬酰胺、谷氨酰胺或纈氨酸。
[0037][7]根據(jù)[3]所述的修飾型α-葡萄糖苷酶，`其中，被取代的氨基酸是(I)的氨基酸和(2)的氨基酸，取代后的氨基酸是對(duì)于(I)的氨基酸為天冬氨酸，對(duì)于(2)的氨基酸為丙氨酸或甘氨酸。
[0038][8]根據(jù)[3]所述的修飾型α _葡萄糖苷酶，其中，被取代的氨基酸是(I)的氨基酸和(3)的氨基酸，取代后的氨基酸是對(duì)于(I)的氨基酸為天冬氨酸或蛋氨酸，對(duì)于(3)的氨基酸為異亮氨酸、精氨酸、半胱氨酸或蘇氨酸。
[0039][9]根據(jù)[3]所述的修飾型α _葡萄糖苷酶，其中，被取代的氨基酸是(5)的氨基酸，取代后的氨基酸是甘氨酸、脯氨酸或纈氨酸。
[0040][10]根據(jù)[3]所述的修飾型α -葡萄糖苷酶，其中，被取代的氨基酸是(6)的氨基酸，取代后的氨基酸是亮氨酸或絲氨酸。
[0041][11]根據(jù)[I]所述的修飾型α -葡萄糖苷酶，其中，由序列號(hào)18?24以及77?78中的任意一個(gè)氨基酸序列構(gòu)成。
[0042][12]根據(jù)[I]所述的修飾型α-葡萄糖苷酶，其中，由序列號(hào)74?76中的任意一個(gè)氨基酸序列構(gòu)成。
[0043][13] 一種編碼[I]?[12]中任一項(xiàng)所述的修飾型α _葡萄糖苷酶的基因。
[0044][14]根據(jù)[13]所述的基因，含有序列號(hào)43?67以及79?83中的任意一個(gè)堿基序列。
[0045][15] 一種含有[13]或[14]所述的基因的重組DNA。
[0046][16] 一種具有[15]所述的重組DNA的微生物。
[0047][17] 一種含有[I]?[12]中任一項(xiàng)所述的修飾型α-葡萄糖苷酶的酶制劑。
[0048][18] 一種低聚糖的制造方法，其特征在于，使[I]?[8]、[10]和[11]中的任一項(xiàng)所述的修飾型α-葡萄糖苷酶與具有α-1，4鍵的二糖以上的低聚糖或多糖進(jìn)行作用。
[0049][19] 一種低聚糖的制造方法，其特征在于，使[9]或[12]所述的修飾α _葡萄糖苷酶與具有α-1，6鍵的二 糖以上的低聚糖或多糖進(jìn)行作用。
[0050][20]根據(jù)[18]或[19]所述的低聚糖的制造方法，其特征在于，與野生型的酶并用。
[0051][21] 一種低聚糖的制造方法，其特征在于，使[9]或[12]所述的修飾型α-葡萄糖苷酶和野生型的酶、與具有α-1，4鍵的二糖以上的低聚糖或多糖進(jìn)行作用。
[0052][22]含有[I]?[12]中任一項(xiàng)所述的修飾型α -葡萄糖苷酶或[17]所述的酶制劑的醫(yī)藥組合物、準(zhǔn)醫(yī)藥組合物、化妝品組合物、食品組合物或餌料組合物。
[0053][23] 一種修飾型α-葡萄糖苷酶的設(shè)計(jì)方法，其包含以下步驟(i )和(ii )，
[0054](i)在作為突變對(duì)象酶的α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列中，確定選自以下(I)?
(14)中的一個(gè)或兩個(gè)以上氨基酸的步驟:
[0055](I)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第385位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0056](2)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第491位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0057](3)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第535位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0058](4)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第450位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0059](5)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第534位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0060](6)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第537位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0061](7)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第538位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0062](8)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第554位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0063](9)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第556位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0064](10)與序列號(hào)2所示的氨基酸序列的第579位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0065](11)與序列號(hào)2所示的氨基酸序列的第585位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被?；[0066](12)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第630位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0067](13)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第683位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0068](14)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第689位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被帷?br> [0069](ii)以突變對(duì)象酶的氨基酸序列為基礎(chǔ)，構(gòu)建將步驟⑴中確定的氨基酸序列取代為其它氨基酸的氨基酸序列的步驟。
[0070][24]根據(jù)[23]所述的設(shè)計(jì)方法，其中，α-葡萄糖苷酶包括人麥芽糖酶-糖化酶(Human Maltase-glucoamylase)、黑曲霉的 α-葡萄糖苷酶(Aspergillus nigeralpha-glucosidase)、人中性 α -葡萄糖苷酶C (Human Neutral alpha-glucosidase C)、鼠溶酶體α -葡萄糖昔酶(Mouse Lysosomal alpha-glucosidase)、酵母的ct -葡萄糖昔酶(Yeast GLU2A)、構(gòu)巢曲霉的 α -葡萄糖苷酶A (Aspergillus nidulans Alpha-glucosidaseAgdA)、構(gòu)巢曲霉的 ct -葡萄糖苷酶 B (Aspergillus nidulans Alpha-glucosidaseAgdB)、爪睡毛霉的 α-葡萄糖苷酶(Mucor javanicus alpha-glucosidase)、米曲霉的α -葡萄糖苷酶(Aspergillus oryzae alpha-glucosidase)、蔥狀被孢霉的α-葡萄糖苷酶(Mortierella alliacea alpha-glucosidase)、粟酒裂殖酵母的α-葡萄糖苷酶(Schizosaccharomyces pombe alpha-glucosidase)、德巴利酵母的 ct-葡萄糖昔酶(Debaryomyces occidentalis alpha-glucosidase)、大麥的 α -葡萄糖苷酶(Hordeumvulgare subsp.vulgare alpha-glucosidase)、擬南芥的 α -葡萄糖苷酶(Arabidopsisthaliana alpha-glucosidase)、菠菜的 α -葡萄糖苷酶(Spinacia oleraceaalpha-glucosidase)、甜菜的 α -葡萄糖苷酶(Beta vulgaris alpha-glucosidase)或馬鈴薯的 α -葡萄糖苷酶(Solanum tuberosum alpha-glucosidase)。
[0071][25]根據(jù)[23]所述的設(shè)計(jì)方法，其中，α -葡萄糖苷酶含有序列號(hào)I?17中任一個(gè)氨基酸序列。
.[0072][26]根據(jù)[23]所述的設(shè)計(jì)方法，其中，α _葡萄糖苷酶由序列號(hào)2的氨基酸序列構(gòu)成，步驟(i )中被取代的氨基酸為選自⑴?(14)中的一個(gè)氨基酸、選自⑴?(14)中的兩個(gè)氨基酸或選自(I)?(14)中的三個(gè)氨基酸。
[0073][27] 一種修飾型α -葡萄糖苷酶的制備方法，含有以下步驟(I )?(III):
[0074]( I )準(zhǔn)備核酸的步驟，該核酸編碼序列號(hào)18?42和74?78中的任意一個(gè)氨基酸序列或通過(guò)權(quán)利要求23?26中任一項(xiàng)所述的設(shè)計(jì)方法構(gòu)建的氨基酸序列；
[0075]( II )使所述核酸表達(dá)的步驟；以及
[0076](III)回收表達(dá)產(chǎn)物的步驟。
[0077][28] 一種α -葡萄糖苷酶，其具有α _1，4位特異性或α _1，6位特異性轉(zhuǎn)移活性?！緦?zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0078]圖1:人α -葡萄糖苷酶中突變導(dǎo)入點(diǎn)的位置㈧，比對(duì)比較(B)，黑曲霉的氨基酸序列中的與突變導(dǎo)入點(diǎn)對(duì)應(yīng)的氨基酸位置(C)。
[0079]圖2:使用酵母的結(jié)構(gòu)修飾TG(轉(zhuǎn)葡萄糖苷酶)篩查系統(tǒng)的概述。
[0080]圖3:通過(guò)HPLC進(jìn)行的低聚糖合成活性的比較。將WT(野生型)㈧和結(jié)構(gòu)修飾TG (W343M (B)、V452G (C)、S496V (D))的低聚糖合成活性進(jìn)行比較。
[0081]圖4:三糖以上的低聚糖的合成量的比較。[0082]圖5:三糖以上的低聚糖的合成量的比較(上圖)和四糖以上的低聚糖的合成量的比較(下圖)。在取代后的氨基酸(示于圖的下方)不同的結(jié)構(gòu)修飾TG之間，比較生成的低聚糖的量。
[0083]圖6:三糖以上的低聚糖的合成量的比較(左圖)和四糖以上的低聚糖的合成量的比較(右圖)。在取代后的氨基酸(示于圖的下方)不同的結(jié)構(gòu)修飾TG之間，比較合成的低聚糖的量。
[0084]圖7:與水解活性相關(guān)的底物特異性的比較。
[0085]圖8:兩個(gè)氨基酸取代所致的結(jié)構(gòu)修飾TG的水解活性。
[0086]圖9:兩個(gè)氨基酸取代所致的結(jié)構(gòu)修飾TG的低聚糖合成活性。將WT (野生型)(A)和結(jié)構(gòu)修飾TG(W343M(B)、W343M/S496T (C)、W343D/V452G (D))的低聚糖合成活性進(jìn)行比較。
[0087]圖10:三糖以上的低聚糖的合成量的比較(左圖)和四糖以上的低聚糖的合成量的比較(右圖)。在取代后的氨基酸(示于圖的下方)不同的結(jié)構(gòu)修飾TG之間，比較合成的低聚糖的量。
[0088]圖11:兩個(gè)氨基酸取代所致的結(jié)構(gòu)修飾TG的底物特異性。
[0089]圖12:將麥芽五糖作為起始底物時(shí)生成的低聚糖的比較。
[0090]圖13:將麥芽糖與異麥芽糖的混合物作為起始底物時(shí)生成的低聚糖的比較。
[0091]圖14:計(jì)算機(jī)模擬的α-葡萄糖苷酶的立體結(jié)構(gòu)模型。左圖:黑曲霉的TG，右圖:構(gòu)巢曲霉的TG。
[0092]圖15:基于計(jì)算機(jī)模擬的突變導(dǎo)入點(diǎn)的研究方案。
[0093]圖16:結(jié)構(gòu)修飾TG(S495X)的低聚糖合成活性的比較。底物使用麥芽糖。比較三糖以上的低聚糖的合成量(上圖)和四糖以上的低聚糖的合成量(下圖)。
[0094]圖17:結(jié)構(gòu)修飾TG(S495X)的低聚糖合成活性的比較。底物使用異麥芽糖。比較三糖以上的低聚糖的合成量(上圖)和四糖以上的低聚糖的合成量(下圖)。
[0095]圖18:結(jié)構(gòu)修飾TG(S495X)的水解活性。
[0096]圖19:結(jié)構(gòu)修飾TG的低聚糖合成活性的比較。底物使用麥芽五糖。(a)WT(野生型)的HPLC圖譜。(b)結(jié)構(gòu)修飾TG(S495V)的HPLC圖譜。(c)生成的低聚糖的比例。
[0097]圖20:結(jié)構(gòu)修飾TG(C498X)的低聚糖合成活性的比較。底物使用麥芽糖。
[0098]圖21:結(jié)構(gòu)修飾TG(C498X)的水解活性。
[0099]圖22:低聚糖合成能力的比較。(a)未添加TG的情形，(b)添加WT (野生型)的TG的情形，(c)添加結(jié)構(gòu)修飾TG(W343M)的情形，(d)三糖以上的區(qū)域面積的比較。
[0100]圖23:由粥(杉力4 )生產(chǎn)的低聚糖的HPLC圖譜(反應(yīng)開(kāi)始90分鐘后)。
[0101]圖24:低聚糖合成活性的比較。對(duì)于結(jié)構(gòu)修飾TG(S495P)單獨(dú)的情形和與WT型并用的情形，比較三糖以上的低聚糖的合成量(上圖)和四糖以上的低聚糖的合成量(下圖)。底物使用麥芽糖。
[0102]圖25:由麥芽糖(底物)生成的低聚糖的HPLC圖譜(反應(yīng)開(kāi)始48小時(shí)后)。
[0103]圖26:低聚糖合成能力的比較。(a)添加WT(野生型)的TG的情形，(b)添加結(jié)構(gòu)修飾TG(S495P)的情形，(c)并用WT (野生型)與結(jié)構(gòu)修飾TG(S495P)的情形，(d)三糖以上的區(qū)域面積的比較。[0104]圖27:由粥產(chǎn)生的低聚糖的HPLC圖譜(反應(yīng)開(kāi)始90分鐘后)。
【具體實(shí)施方式】
[0105]為了說(shuō)明方便，對(duì)本發(fā)明的所用術(shù)語(yǔ)的一部分做如下定義。
[0106](術(shù)語(yǔ))
[0107]α-葡萄糖苷酶也被稱(chēng)為轉(zhuǎn)葡萄糖苷酶。本申請(qǐng)說(shuō)明書(shū)中，可以將“α-葡萄糖苷酶”和術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)葡萄糖苷酶”交換使用。術(shù)語(yǔ)“修飾型α-葡萄糖苷酶”是指通過(guò)本說(shuō)明書(shū)中公開(kāi)的方法，對(duì)“成為基礎(chǔ)的α -葡萄糖苷酶”修飾或突變而得到的酶。本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“修飾型α-葡萄糖苷酶”、術(shù)語(yǔ)“結(jié)構(gòu)修飾α-葡萄糖苷酶”、術(shù)語(yǔ)“修飾酶”以及術(shù)語(yǔ)“結(jié)構(gòu)修飾酶”可交換使用。成為基礎(chǔ)的α-葡萄糖苷酶典型地為野生型的α-葡萄糖苷酶。然而，這并不妨礙將已經(jīng)實(shí)施人為操作的α-葡萄糖苷酶作為“成為基礎(chǔ)的α-葡萄糖苷酶”而適用于本發(fā)明。本說(shuō)明書(shū)中，將“成為基礎(chǔ)的α-葡萄糖苷酶”也稱(chēng)為“突變對(duì)象α-葡萄糖苷酶”或“突變對(duì)象酶”。在本說(shuō)明書(shū)中，將表示氨基酸種類(lèi)的一個(gè)字符和表示氨基酸位置的數(shù)字進(jìn)行組合來(lái)表示突變導(dǎo)入點(diǎn)的氨基酸。例如，第343位色氨酸為突變導(dǎo)入點(diǎn)時(shí)，以“W343”表示。
[0108](修飾型α-葡萄糖苷酶)
[0109]本發(fā)明的第一方面涉及修飾型α -葡萄糖苷酶(修飾型酶)。本發(fā)明的修飾型酶具有在突變對(duì)象酶的氨基酸序列中選自以下(I)?(14)中的一個(gè)或兩個(gè)以上的氨基酸被其它氨基酸取代而成的氨基酸序列:
[0110](I)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第385位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0111](2)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第491位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0112](3)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第535位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0113](4)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第450位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0114](5)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第534位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0115](6)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第537位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0116](7)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第538位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0117](8)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第554位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0118](9)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第556位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0119](10)與序列號(hào)2所示的氨基酸序列的第579位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0120](11)與序列號(hào)2所示的氨基酸序列的第585位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0121](12)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第630位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0122](13)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第683位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0123](14)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第689位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被帷?br> [0124]如后述實(shí)施例所示，通過(guò)人麥芽糖酶-糖化酶(序列號(hào)I)的立體結(jié)構(gòu)解析和功能預(yù)測(cè)，進(jìn)一步使用與同源物的比對(duì)比較等方法，結(jié)果能夠預(yù)期，上述第385位氨基酸、第491位氨基酸以及第535位氨基酸，對(duì)于酶的功能是重要的氨基酸。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，通過(guò)使與這些氨基酸相當(dāng)?shù)陌被岚l(fā)生突變對(duì)酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，改變?chǔ)?葡萄糖苷酶的特性。此處的“特性”是糖轉(zhuǎn)移活性和水解活性。本發(fā)明的修飾型酶中，糖轉(zhuǎn)移活性和水解活性的平衡以修飾前為基準(zhǔn)，向糖轉(zhuǎn)移活性占主導(dǎo)的方向移動(dòng)。典型地，作為修飾的結(jié)果，產(chǎn)生糖轉(zhuǎn)移活性的提高或水解活性的降低或同時(shí)具有兩種效果，獲得能夠高效糖轉(zhuǎn)移的酶。
[0125]另一方面，將黑曲霉的α-葡萄糖苷酶和構(gòu)巢曲霉的α-葡萄糖苷酶的立體結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較、將氨基酸序列進(jìn)行比較等，結(jié)果表明，能夠預(yù)期上述(4)?(14)所示的氨基酸是對(duì)結(jié)構(gòu)修飾有效的氨基酸。本發(fā)明的另一方式中，通過(guò)使與這些氨基酸相當(dāng)?shù)陌被岚l(fā)生突變來(lái)修飾酶的結(jié)構(gòu)，改變?chǔ)?葡萄糖苷酶的特性。
[0126]此處，本說(shuō)明書(shū)中關(guān)于氨基酸殘基使用時(shí)的用語(yǔ)“相當(dāng)”是指，比較的蛋白質(zhì)(酶)之間對(duì)于其功能的發(fā)揮作出相同的貢獻(xiàn)。例如，考慮到一級(jí)結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)的部分同源性并按照能進(jìn)行最適合的比較的方式將比較對(duì)象的氨基酸序列相對(duì)于基準(zhǔn)氨基酸序列(即序列號(hào)I的氨基酸序列或序列號(hào)2的氨基酸序列)進(jìn)行排列時(shí)(此時(shí)，根據(jù)需要引入空位，可以?xún)?yōu)化比對(duì))，可將與基準(zhǔn)氨基酸序列中的特定的氨基酸對(duì)應(yīng)的位置的氨基酸確定為“相當(dāng)氨基酸”。通過(guò)代替一級(jí)結(jié)構(gòu)彼此的比較或者在此基礎(chǔ)上增加立體結(jié)構(gòu)(三維結(jié)構(gòu))彼此的比較，也能夠確定“相當(dāng)氨基酸”。通過(guò)利用立體結(jié)構(gòu)信息，能夠得到可靠性高的比較結(jié)果。這種情況下，可采用一邊比較多個(gè)酶的立體結(jié)構(gòu)的原子坐標(biāo)一邊進(jìn)行比對(duì)的方法。突變對(duì)象酶的立體結(jié)構(gòu)信息，例如，可以通過(guò)(http://www.pdbj.0rg/index_j.html)的方式獲得。
[0127]利用X-射線晶體結(jié)構(gòu)分析進(jìn)行的蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)的確定方法的一個(gè)例子如下所
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[0128](I)將蛋白質(zhì)結(jié)晶化。結(jié)晶化對(duì)于立體結(jié)構(gòu)的確定是必不可少的，除此以外，作為蛋白質(zhì)的高純度的精制方法、高密度穩(wěn)定的保存方法在產(chǎn)業(yè)上也具有有用性。在這種情況下，可以將結(jié)合有作為配體的底物或者其類(lèi)似化合物的蛋白質(zhì)結(jié)晶化。
[0129](2)對(duì)制得的結(jié)晶進(jìn)行X射線照射，收集衍射數(shù)據(jù)。應(yīng)予說(shuō)明，蛋白質(zhì)晶體由于X射線照射而受到破壞、衍射能力劣化的情況多。在這種情況下，將結(jié)晶迅速冷卻至約_173°C左右、在這種狀態(tài)下收集衍射數(shù)據(jù)的低`溫測(cè)量技術(shù)近來(lái)已經(jīng)普及。應(yīng)予說(shuō)明，最終為了收集用于結(jié)構(gòu)確定的高分辨率數(shù)據(jù)，采用高亮度的同步輻射。
[0130](3)進(jìn)行晶體結(jié)構(gòu)分析時(shí)，除了衍射數(shù)據(jù)以外，相位信息是必需的。對(duì)于目標(biāo)蛋白質(zhì)，在類(lèi)似蛋白質(zhì)的結(jié)晶構(gòu)造未知的情況下，通過(guò)分子置換法確定結(jié)構(gòu)是不可能的，必須通過(guò)重原子同晶置換法解決相位問(wèn)題。重原子同晶置換法是一種在結(jié)晶中引入汞、鉬等原子序號(hào)大的金屬原子，利用金屬原子大的X射線散射能力對(duì)X-射線衍射數(shù)據(jù)的貢獻(xiàn)而獲得相位信息的方法。確定的相位可通過(guò)使結(jié)晶中的溶劑區(qū)域的電子密度平滑化從而得到改善。由于溶劑區(qū)域的水分子波動(dòng)大而導(dǎo)致幾乎無(wú)法觀察到電子密度，所以通過(guò)將該區(qū)域的電子密度近似為零，從而能夠接近真正的電子密度，進(jìn)而改善相位。另外，不對(duì)稱(chēng)單元中含有多個(gè)分子時(shí)，通過(guò)將這些分子的電子密度平均化從而相位進(jìn)一步得到顯著改善。在使用這樣改善的相位計(jì)算得到的電子密度圖中，擬合蛋白質(zhì)的模型。該過(guò)程可在計(jì)算機(jī)圖像中使用MSI公司(美國(guó))的QUANTA等程序進(jìn)行。然后，用MSI公司的X-PLOR等程序進(jìn)行結(jié)構(gòu)精密化，進(jìn)而完成結(jié)構(gòu)分析。對(duì)于目標(biāo)蛋白質(zhì)，在類(lèi)似蛋白質(zhì)的晶體結(jié)構(gòu)已知的情況下，使用已知的蛋白質(zhì)的原子坐標(biāo)通過(guò)分子置換法來(lái)確定。分子置換和結(jié)構(gòu)精密化可使用程序CNS_SOLVE ver.11 等進(jìn)行。
[0131]本發(fā)明的突變對(duì)象酶的例子為人麥芽糖酶-糖化酶(Human Maltase-glucoamylase)、黑曲霉的 α-葡萄糖苷酶(Aspergillus niger alpha-glucosidase)、人中性α -葡萄糖苷酶C(Human Neutral alpha-glucosidase 0、鼠溶酶體<1-葡萄糖音酶(Mouse Lysosomal alpha-glucosidase)、酵母的 α-葡萄糖音酶(Yeast GLU2A)、構(gòu)巢曲霉的 α -葡萄糖苷酶 A(Aspergillus nidulans Alpha-glucosidase AgdA)、構(gòu)巢曲霉的 α -葡萄糖苷酶 B (Aspergillus nidulans Alpha-glucosidase AgdB)、爪卩圭毛霉的α -葡萄糖苷酶(Mucor javanicus alpha-glucosidase)、米曲霉的α-葡萄糖苷酶(Aspergillus oryzae alpha-glucosidase)、蔥狀被抱霉的 α -葡萄糖苷酶(Mortierellaalliacea alpha-glucosidase)、粟酒裂殖酵母的 α -葡萄糖音酶(Schizosaccharomycespombe alpha-glucosidase)、德巴利酵母的 α -葡萄糖音酶(Debaryomycesoccidentalis alpha-glucosidase)、大麥的 α-葡萄糖苷酶(Hordeum vulgare subsp.vulgare alpha-glucosidase)、擬南芥的 α-葡萄糖苷酶(Arabidopsis thalianaalpha-glucosidase)、疲菜的 α -葡萄糖音酶(Spinacia oleracea alpha-glucosidase)、甜菜的α-葡萄糖苷酶(Beta vulgaris alpha-glucosidase)、馬鈴薯的α -葡萄糖苷酶(Solanum tuberosum alpha-glucosidase) □登錄在公共的數(shù)據(jù)庫(kù)的這些α -葡萄糖苷酶的氨基酸序列如下所示。
[0132]人麥芽糖酶-糖化酶(HumanMaltase-glucoamylase):序列號(hào) I
[0133]黑曲霉的α -葡萄糖苷酶(Aspergillus niger alpha-glucosidase):序列號(hào) 2
[0134]人中性α -葡萄糖苷酶 C (Human Neutral alpha-glucosidase C):序列號(hào) 3
[0135]鼠溶酶體ct -葡萄糖音酶(Mouse Lysosomal alpha-glucosidase):序列號(hào) 4
[0136]酵母的α -葡萄糖苷酶(Yeast GLU2A):序列號(hào)5
[0137]構(gòu)巢曲霉的α -葡萄糖苷酶 A(Aspergillus nidulans Alpha-glucosidaseAgdA):序列號(hào)6
[0138]構(gòu)巢曲霉的α -葡萄糖苷酶 B (Aspergillus nidulans Alpha-glucosidaseAgdB):序列號(hào)7
[0139]爪卩圭毛霉的α -葡萄糖苷酶(Mucor javanicus alpha-glucosidase):序列號(hào) 8
[0140]米曲霉的α -葡萄糖苷酶(Aspergillus oryzae alpha-glucosidase):序列號(hào) 9
[0141]蔥狀被抱霉的α-葡萄糖苷酶(Mortierella alliacea alpha-glucosidase):序列號(hào)10
[0142]粟酒裂殖酵母的α -葡萄糖音酶(Schizosaccharomyces pombealpha-glucosidase):序列號(hào) 11
[0143]德巴利酵母的α -葡萄糖音酶(Debaryomyces occidentalisalpha-glucosidase):序列號(hào) 12
[0144]大麥的α -葡萄糖苷酶(Hordeum vulgare subsp.vulgare alpha-glucosidase):序列號(hào)13
[0145]擬南芥的α-葡萄糖苷酶(Arabidopsis thaliana alpha-glucosidase):序列號(hào)14
[0146]疲菜的ct -葡萄糖音酶(Spinacia oleracea alpha-glucosidase):序列號(hào) 15
[0147]舌甘菜的α -葡萄糖苷酶(Beta vulgaris alpha-glucosidase):序列號(hào) 16
[0148]馬鈴薯的α -葡萄糖苷酶(Solanum tuberosum alpha-glucosidase):序列號(hào) 17
[0149]此處，將具有序列號(hào)2的氨基酸序列的源自黑曲霉的α-葡萄糖苷酶作為突變對(duì)象酶時(shí)，上述⑴的氨基酸為序列號(hào)2的第343位氨基酸；上述⑵的氨基酸為序列號(hào)2的第452位氨基酸；上述(3)的氨基酸為序列號(hào)2的第496位氨基酸；上述(4)的氨基酸為序列號(hào)2的第410位氨基酸；上述(5)的氨基酸為序列號(hào)2的第495位氨基酸；上述(6)的氨基酸為序列號(hào)2的第498位氨基酸；上述(7)的氨基酸為序列號(hào)2的第499位氨基酸；上述(8)的氨基酸為序列號(hào)2的第531位氨基酸；上述(9)的氨基酸為序列號(hào)2的第533位氨基酸；上述(10)的氨基酸為序列號(hào)2的第579位氨基酸；上述(11)的氨基酸為序列號(hào)2的第585位氨基酸；上述(12)的氨基酸為序列號(hào)2的第662位氨基酸；上述(13)的氨基酸為序列號(hào)2的第715位氨基酸；上述(14)的氨基酸為序列號(hào)2的第721位氨基酸。
[0150]取代后的氨基酸的種類(lèi)沒(méi)有特別的限制。因此，它可以是保守性氨基酸取代，也可以是非保守性氨基酸取代。此處，“保守性氨基酸取代”是指將某些氨基酸殘基取代為具有同樣性質(zhì)的側(cè)鏈的氨基酸殘基。氨基酸殘基通過(guò)其側(cè)鏈分為以下幾個(gè)家族，堿性側(cè)鏈(例如，賴(lài)氨酸，精氨酸，組氨酸)，酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸，谷氨酸)，不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如，甘氨酸，天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸，色氨酸)，β支鏈側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)，芳香族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。典型的保守性氨基酸替換可以是在同一家族內(nèi)的氨基酸殘基之間進(jìn)行替換。
[0151]作為將具有序列號(hào)2的氨基酸序列的源自黑曲霉的α-葡萄糖苷酶作為突變對(duì)相酶時(shí)的取代后的氨基酸的例子，可例舉為對(duì)于(I)的氨基酸為半胱氨酸、天冬氨酸、蛋氨酸、組氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、纈氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或異亮氨酸；對(duì)于(2)的氨基酸·為甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或丙氨酸；對(duì)于(3)的氨基酸為纈氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、異亮氨酸、精氨酸、半胱氨酸或蘇氨酸；對(duì)于(5)的氨基酸為甘氨酸、脯氨酸或纈氨酸；對(duì)于出)的氨基酸是亮氨酸或絲氨酸。
[0152]上述(I)?(14)的氨基酸中，可以有兩個(gè)以上的氨基酸被取代。作為被取代的氨基酸的組合，可以例示為⑴和⑵的組合以及⑴和⑶的組合。這些組合相當(dāng)于后述實(shí)施例中得到的結(jié)構(gòu)修飾酶。
[0153]此處，將修飾型酶的氨基酸序列的例子示于序列號(hào)18?42、74?78。這些序列是通過(guò)對(duì)黑曲霉的α-葡萄糖苷酶實(shí)施I個(gè)氨基酸取代(對(duì)(I)?(3)、(5)和(6)中任一個(gè)氨基酸)、實(shí)施2個(gè)氨基酸取代(對(duì)(I)和(2)的氨基酸、對(duì)(I)和(3)的氨基酸或?qū)?br> (2)和(3)的氨基酸)或?qū)嵤?個(gè)氨基酸取代(對(duì)⑴和⑵和(3)的氨基酸)而得到的修飾型酶的氨基酸序列。序列號(hào)和氨基酸取代的對(duì)應(yīng)關(guān)系如下所示。應(yīng)予說(shuō)明，黑曲霉的α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列(序列號(hào)2)中，第343位的色氨酸(W343)相當(dāng)于(I)的氨基酸，第452位的纈氨酸(V452)相當(dāng)于(2)的氨基酸，第496位的絲氨酸(S496)相當(dāng)于(3)的氨基酸，第410位的異亮氨酸(1410)相當(dāng)于(4)的氨基酸，第499位的纈氨酸(V499)相當(dāng)于(7)的氨基酸，第531位的谷氨酸(Ε531)相當(dāng)于(8)的氨基酸，第533位的苯丙氨酸(F533)相當(dāng)于(9)的氨基酸，第579位的組氨酸(Η579)相當(dāng)于(10)的氨基酸，第585位的天冬酰胺(Ν585)相當(dāng)于(11)的氨基酸，第662位的酪氨酸(Υ662)相當(dāng)于(12)的氨基酸，第715位的酪氨酸(Υ715)相當(dāng)于(13)的氨基酸，第721位的亮氨酸(L721)相當(dāng)于(14)的氨基酸。另外，構(gòu)巢曲霉的α-葡萄糖苷酶B的氨基酸序列(序列號(hào)7)中，第296位的酪氨酸(Υ296)相當(dāng)于(I)的氨基酸，第456位的天冬酰胺(Ν456)相當(dāng)于(3)的氨基酸，第363位的蛋氨酸(M363)相當(dāng)于(4)的氨基酸，第455位的丙氨酸(A455)相當(dāng)于(5)的氨基酸，第458位的酪氨酸(Y458)相當(dāng)于(6)的氨基酸，第459位的天冬酰胺(N459)相當(dāng)于(7)的氨基酸，第488位的天冬氨酸(D488)相當(dāng)于(8)的氨基酸，第490位的亮氨酸(L490)相當(dāng)于(9)的氨基酸，第565位的精氨酸(R565)相當(dāng)于(10)的氨基酸，第571位的谷氨酰胺(Q571)相當(dāng)于(11)的氨基酸，第646位的異亮氨酸(1646)相當(dāng)于(12)的氨基酸，第700位的苯丙氨酸(F700)相當(dāng)于(13)的氨基酸，第706位的異亮氨酸(1706)相當(dāng)于(14)的氨基酸。
[0154]氨基酸序列:氨基酸取代
[0155]A.序列號(hào) 18:W343C
[0156]B.序列號(hào) 19:W343D
[0157]C.序列號(hào) 20:W343M
[0158]D.序列號(hào) 21:W343H
[0159]Ε.序列號(hào) 22:W343A
[0160]F.序列號(hào) 23:W343F
[0161]G.序列號(hào) 24:W343G
[0162]H.序列號(hào) 25:W343T
[0163]1.序列號(hào) 26:W343E.[0164]J.序列號(hào) 27:W343V
[0165]K.序列號(hào) 28:W343Q
[0166]L 序列號(hào) 29:W343N
[0167]Μ.序列號(hào) 30:W343I
[0168]N.序列號(hào) 31:V452G
[0169]0.序列號(hào) 32:V452D
[0170]P.序列號(hào) 33:V452E
[0171]Q.序列號(hào):34:S496V
[0172]R.序列號(hào) 35:S496N
[0173]S.序列號(hào) 36:S496Q
[0174]T.序列號(hào) 37: W343D 和 V452A
[0175]U.序列號(hào) 38: W343D 和 V452G
[0176]V.序列號(hào) 39:W343D 和 S496I
[0177]W.序列號(hào) 40: W343D 和 S496R
[0178]X.序列號(hào) 41:W343M 和 S496C
[0179]Y.序列號(hào) 42: W343M 和 S496T
[0180]a.序列號(hào) 74:S495G
[0181]b.序列號(hào) 75:S495P
[0182]c.序列號(hào) 76:S495V
[0183]d.序列號(hào) 77:C498L
[0184]e.序列號(hào) 78:C498S
[0185]如果根據(jù)后述實(shí)施例(氨基酸取代的效果的確認(rèn))所示的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，特別是在糖轉(zhuǎn)移活性這點(diǎn)上，A?C、0、Q?S的修飾型α-葡萄糖苷酶的有用性高。另外，在水解活性非常低這點(diǎn)上，V和W的有用性高。另一方面，在對(duì)α-1，6鍵的降解活性非常低這點(diǎn)上，U、X和Y的有用性高。在糖轉(zhuǎn)移活性?xún)?yōu)異這點(diǎn)上，Y的有用性也高。另外，a?c以顯示al，6位特異性轉(zhuǎn)移活性為特征。d和e的α -1, 4位特異性轉(zhuǎn)移活性?xún)?yōu)異。
[0186]另外，通常，某些蛋白質(zhì)的氨基酸序列一部分發(fā)生突變的情況下，突變后的蛋白質(zhì)與突變前的蛋白質(zhì)有時(shí)具有同等的功能。即氨基酸序列的突變對(duì)于蛋白質(zhì)的功能沒(méi)有產(chǎn)生實(shí)質(zhì)的影響，突變前后蛋白質(zhì)的功能得以保持。考慮到該技術(shù)常識(shí)，與由選自上述(I)?
(14)中的一個(gè)或兩個(gè)以上的氨基酸被其它氨基酸取代而成的氨基酸序列構(gòu)成的修飾型酶進(jìn)行比較時(shí)，盡管氨基酸序列略有差異(其中，氨基酸序列的區(qū)別是在進(jìn)行上述的氨基酸取代的位置以外的位置產(chǎn)生)但在特性方面并沒(méi)有觀察到實(shí)質(zhì)性差異的酶，可以看做與上述修飾型酶實(shí)質(zhì)相同的酶。此處，“氨基酸序列略有差異”典型地是指，通過(guò)構(gòu)成氨基酸序列的I個(gè)?多個(gè)(其上限例如為3個(gè)、5個(gè)、7個(gè)、10個(gè))氨基酸缺失、取代或者I個(gè)?多個(gè)(其上限例如為3個(gè)、5個(gè)、7個(gè)、10個(gè))氨基酸的添加、插入或者是它們的組合，從而在氨基酸序列中產(chǎn)生突變(變化)?！皩?shí)質(zhì)相同的酶”的氨基酸序列與作為基準(zhǔn)的上述修飾型酶的氨基酸序列的同源性(％)，例如為90%以上，優(yōu)選為95%以上，更優(yōu)選為98%以上，最優(yōu)選為99%以上。應(yīng)予說(shuō)明，氨基酸序列的差異可以在多個(gè)位置上發(fā)生。“氨基酸序列略有差異”優(yōu)選由保守型氨基酸取代而產(chǎn)生。
[0187](編碼修飾型α-葡萄糖苷酶的核酸等) [0188]本發(fā)明的第二方面提供了與本發(fā)明的修飾酶相關(guān)的核酸。即，提供了編碼修飾型酶的基因、可作為用于確定編碼修飾型酶的核酸的探針使用的核酸、可作為用于使編碼修飾型酶的核酸進(jìn)行擴(kuò)增或突然突變的弓I物使用的核酸。
[0189]編碼修飾酶的基因典型地用于修飾型酶的制備。通過(guò)使用了編碼修飾酶的基因的基因工程學(xué)制備方法，能夠獲得更均勻狀態(tài)的修飾型酶。另外，該方法對(duì)于制備大量修飾型酶的情況也是一種合適的方法。應(yīng)予說(shuō)明，編碼修飾型酶的基因的用途不限于修飾型酶的制備。例如，作為以闡明修飾型酶的作用機(jī)理為目的的實(shí)驗(yàn)用工具，或者作為用于設(shè)計(jì)或制備酶的進(jìn)一步的修飾體的工具，可以利用該核酸。
[0190]本說(shuō)明書(shū)中“編碼修飾型酶的基因”是指將其表達(dá)時(shí)得到該修飾型酶的核酸，具有與該修飾型酶的氨基酸序列對(duì)應(yīng)的堿基序列的核酸當(dāng)然包含在內(nèi)，另外也包含在這樣的核酸中增加不編碼氨基酸序列的序列而成的核酸。另外，也可考慮密碼子的簡(jiǎn)并。
[0191]將編碼修飾型酶的基因的序列(堿基序列)的例子示于序列號(hào)43?67和79?83。這些序列為編碼在黑曲霉的α-葡萄糖苷酶中進(jìn)行特定的氨基酸取代而得的修飾型酶的基因。序列號(hào)和氨基酸取代的對(duì)應(yīng)關(guān)系如下所示。
[0192]堿基序列:氨基酸取代
[0193]Α.序列號(hào) 43:W343C
[0194]B.序列號(hào) 44:W343D
[0195]C.序列號(hào) 45:W343M
[0196]D.序列號(hào) 46:W343H
[0197]Ε.序列號(hào) 47:W343A
[0198]R 序列號(hào) 48:W343F[0199]G.序列號(hào) 49:W343G
[0200]H.序列號(hào) 50:W343T
[0201]1.序列號(hào) 51:W343E
[0202]J.序列號(hào) 52:W343V
[0203]K.序列號(hào) 53:W343Q
[0204]L 序列號(hào) 54:W343N
[0205]Μ.序列號(hào) 55:W343I
[0206]N.序列號(hào) 56:V452G
[0207]0.序列號(hào) 57:V452D
[0208]P.序列號(hào) 58:V452E
[0209]Q.序列號(hào) 59:S496V
[0210]R.序列號(hào) 60:S496N
[0211]S.序列號(hào) 61:S496Q
[0212]T.序列號(hào) 62: W343D 和 V452A
[0213]U.序列號(hào) 63: W3 43D 和 V452G
[0214]V.序列號(hào) 64:W343D 和 S496I
[0215]W.序列號(hào) 65: W343D 和 S496R
[0216]X.序列號(hào) 66: W343M 和 S496C
[0217]Y.序列號(hào) 67: W343M 和 S496T
[0218]a.序列號(hào) 79:S495G
[0219]b.序列號(hào) 80:S495P
[0220]c.序列號(hào) 81:S495V
[0221]d.序列號(hào) 82:C498L
[0222]e.序列號(hào) 83:C498S
[0223]本發(fā)明的核酸可通過(guò)參考本說(shuō)明書(shū)或附加的序列表公開(kāi)的序列信息并使用標(biāo)準(zhǔn)的基因工程技術(shù)、分子生物學(xué)技術(shù)、生物化學(xué)技術(shù)等而制備成純化的狀態(tài)。
[0224]本發(fā)明的其它方式提供與編碼本發(fā)明的修飾型酶的基因的堿基序列比較時(shí)，雖然其編碼的蛋白質(zhì)的功能相同，但是部分堿基序列不同的核酸(以下也稱(chēng)為“相同核酸”，另夕卜，將規(guī)定相同核酸的堿基序列稱(chēng)為“相同堿基序列”)。作為相同核酸的例子，可以例舉為以編碼本發(fā)明的修飾型酶的核酸的堿基序列為基準(zhǔn)由含有I個(gè)或多個(gè)堿基的替換、缺失、插入、添加或倒置的堿基序列構(gòu)成，編碼具有修飾型酶中特征性的酶活性(即糖轉(zhuǎn)移活性)的蛋白質(zhì)的DNA。堿基的替換和缺失等可以發(fā)生在多個(gè)位點(diǎn)。此處的“多個(gè)”是指，根據(jù)該核酸編碼的蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的位置、種類(lèi)的不同而不同，例如，可以為2?40個(gè)堿基，優(yōu)選為2?20個(gè)堿基，更優(yōu)選為2?10個(gè)堿基。
[0225]上述相同核酸，例如，通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶處理、利用核酸外切酶或DNA連接酶等進(jìn)行的處理、利用指定位置突然突變引入法(Molecular Cloning, ThirdEdition, Chapterl3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York)或隨機(jī)突然突變引入法(Molecular Cloning, Third Edition, Chapterl3, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, New York)進(jìn)行的突變引入等而得到。另外，通過(guò)紫外線照射等等其它的方法，也能夠獲得相同核酸。
[0226]本發(fā)明的其它形式涉及具有與編碼修飾型酶的基因的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的核酸。本發(fā)明的進(jìn)一步的其它形式提供了相對(duì)于編碼本發(fā)明的修飾型酶的基因的堿基序列或與之互補(bǔ)的堿基序列具有至少約60%、70%、80%、90%、95%、99%、99.9%同源性的堿基序列的核酸。
[0227]本發(fā)明的進(jìn)一步的其它形式涉及具有對(duì)與編碼本發(fā)明修飾型酶的基因的堿基序列或其相同堿基序列互補(bǔ)的堿基序列、在嚴(yán)格的條件下進(jìn)性雜交的堿基序列的核酸。此處，“嚴(yán)格的條件”是指形成所謂特異性雜交而未形成非特異性雜交的條件。這種嚴(yán)格的條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，例如，可以參考Molecular Cloning (Third Edition, ColdSpring Harbor Laboratory Press, New York)或 Current protocols in molecularbiology (edited by Frederick M.Ausubel et al.，1987)進(jìn)行設(shè)定。作為嚴(yán)格的條件，可以例舉為使用雜交液(50%甲酰胺，10XSSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate，pH值
7.0)，5XDenhardt溶液，I % SDS, 10%葡聚糖硫酸酯，10 μ g/ml的變性鮭魚(yú)精子DNA，50mM的磷酸緩沖液(PH7.5))，在約42°C?約50°C進(jìn)行孵育，然后使用0.1XSSC、0.1% SDS，在約65°C?約70°C進(jìn)行清洗的條件。作為進(jìn)一步優(yōu)選的嚴(yán)格條件，可以例舉為，使用50%甲酰胺，5 XSSC (0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 值 7.0)、I XDenhardt 溶液、I % SDS、10%葡聚糖硫酸酯、10 μ g/ml的變性鮭魚(yú)精子DNA、50mM的磷酸緩沖液(pH7.5))作為雜交液的條件。
[0228]本發(fā)明的進(jìn)一步的其它形式是提供具有編碼本發(fā)明修飾型酶的基因的堿基序列或與其互補(bǔ)的堿基序列的一部分的核酸(核酸片段)。這樣的核酸片段可用于具有編碼本發(fā)明修飾型酶的基因的堿基序列的核酸等的檢測(cè)、確定和/或擴(kuò)增等。核酸片段可以按照例如至少含有與編碼本發(fā)明修飾型酶的基因的堿基序列中連續(xù)的核苷酸部分(例如，約10?約100個(gè)堿基長(zhǎng)度，優(yōu)選為約`20?約100個(gè)堿基長(zhǎng)度，更優(yōu)選為約30?約100個(gè)堿基長(zhǎng)度)雜交的部分的方式來(lái)進(jìn)行設(shè)計(jì)。作為探針使用時(shí)，可以將核酸片段進(jìn)行標(biāo)記化。標(biāo)記化例如可以使用熒光物質(zhì)、酶、酶放射性同位素。
[0229]本發(fā)明的再一方面涉及含有本發(fā)明基因(編碼修飾型酶的基因)的重組DNA。本發(fā)明的重組DNA，例如以載體的形式提供。本說(shuō)明書(shū)中術(shù)語(yǔ)“載體”是指能夠?qū)⒈徊迦氲狡渲械暮怂徇\(yùn)輸?shù)郊?xì)胞等的靶標(biāo)內(nèi)的核酸性分子。
[0230]根據(jù)使用目的(克隆、蛋白質(zhì)的表達(dá))，以及考慮宿主細(xì)胞的種類(lèi)，可選擇出適當(dāng)?shù)妮d體。作為以大腸桿菌為宿主的載體可以例舉為M13噬菌體或其變體、λ噬菌體或其變體、PBR322或其變體(pB325、pAT153、pUC8等)等，作為以酵母為宿主的載體，例示為pYepSecUpMFa, pYES2等，作為以昆蟲(chóng)細(xì)胞為宿主的載體，可例示為pAc、pVL等，作為以哺乳類(lèi)細(xì)胞為宿主的載體，可例示為pCDM8、pMT2PC等。
[0231]本發(fā)明的載體優(yōu)選為表達(dá)載體。“表達(dá)載體”是指，能夠?qū)⒈徊迦氲狡渲械暮怂釋?dǎo)入到目標(biāo)細(xì)胞(宿主細(xì)胞)內(nèi)且在該細(xì)胞內(nèi)能夠使其表達(dá)的載體。表達(dá)載體通常含有對(duì)被插入的核酸的表達(dá)所必須的啟動(dòng)子序列、促進(jìn)表達(dá)的增強(qiáng)子序列等。也可以使用含有選擇性標(biāo)記的表達(dá)載體。使用該表達(dá)載體時(shí)，能夠利用選擇性標(biāo)記確認(rèn)表達(dá)載體導(dǎo)入的有無(wú)(及其程度)。
[0232]本發(fā)明的核酸向載體的插入、選擇性標(biāo)記基因的插入(必要時(shí))、啟動(dòng)子的插入(必要時(shí))等，可以使用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)(例如，可參考Molecular Cloning, ThirdEdition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York,使用限制性?xún)?nèi)切酶和DNA連接酶的公知方法)進(jìn)行。
[0233]作為宿主細(xì)胞，從處理容易性的角度出發(fā)，優(yōu)選使用大腸桿菌(Escherichiacoli)、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)等微生物。但是只要是重組DNA能夠復(fù)制且修飾型酶的基因能夠表達(dá)的宿主細(xì)胞就可以使用。作為大腸桿菌的例子，在使用T7系啟動(dòng)子的情況下，可例舉為大腸桿菌BL21 (DE3) pLysS，在并非如此的情況下，可例舉出大腸桿菌JMl09。另外，作為出芽酵母的例子，可例舉出出芽酵母SHY2、出芽酵母AH22或出芽酵母INVScl (Invitrogen 公司)。
[0234]本發(fā)明的其它方面涉及具有本發(fā)明的重組DNA的微生物(即轉(zhuǎn)化體)。本發(fā)明的微生物，可通過(guò)使用上述本發(fā)明的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化而得到。例如，可通過(guò)氯化隹丐法(Journal of Molecular Biology (J.Mol.Biol.),第 53 卷，第 159 頁(yè)(1970))、Hanahan 法(Journal of Molecular Biology,第 1冊(cè)卷，第 557 頁(yè)(1983))、SEM 法(Gene,第 96 卷，第 23 頁(yè)(1990))、Chung 等的方法(Proc Natl Acad Sci U S A.,第 86 卷，第 2172 頁(yè)(1989))、憐酸I丐共沉淀法、電穿孔(Potter, H.et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.81，7161-7165 (1984))、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(Feigner, P.L.et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.84，7413-7417 (1984))等實(shí)施。應(yīng)予說(shuō)明，本發(fā)明的微生物可用于生產(chǎn)本發(fā)明的修飾型酶(參照后述的修飾型α-葡萄糖苷酶的制備方法一欄)。
[0235](含有修飾型α-葡萄糖苷酶的酶制劑)
[0236]本發(fā)明的修飾型酶，例如可以以酶制劑的形式提供。酶制劑，除有效成分(本發(fā)明的修飾型酶)以外，還可含有賦形劑、緩沖劑、懸浮劑、穩(wěn)定劑、保存劑、防腐劑、生理鹽水等。作為賦形劑，可使用淀粉、糊精、麥芽糖、海藻糖、乳糖、D-葡萄糖、山梨糖醇、D-甘露糖醇、蔗糖、甘油等。作為緩沖劑，可以使用磷酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽等。作為穩(wěn)定劑，可以使用丙二醇、抗壞血酸等。作為保存劑，可以使用苯酚、苯扎氯銨、芐醇、氯丁醇、尼泊金甲酯等。作為防腐劑，可以使用 乙醇、苯扎氯銨、對(duì)羥基苯甲酸、氯丁醇等。
[0237](修飾型α-葡萄糖苷酶的用途)
[0238]本發(fā)明的再一方面涉及修飾型酶的用途。作為該用途之一，提供低聚糖的制造方法。本發(fā)明的低聚糖的制造方法的第I方式中，為了利用對(duì)α-1，4鍵的特異性高的本發(fā)明的修飾型酶的特征，使用具有α-1，4鍵的二糖以上的低聚糖或多糖作為底物，使本發(fā)明的修飾型酶對(duì)該底物進(jìn)行作用。該方式中，可以使用后述實(shí)施例所示的修飾型酶W343M、W343M/S496T、C498L、C498S等對(duì)α -1, 4鍵特異性高的酶。底物的例子為麥芽糖、麥芽三糖、潘糖、普魯蘭多糖、麥芽四糖、麥芽五糖、麥芽六糖、麥芽七糖、麥芽八糖、糊精、淀粉(馬鈴薯淀粉、甘薯淀粉、玉米淀粉、小麥淀粉、木薯淀粉等)等。也可以將兩種以上的低聚糖或多糖的混合物作為底物。利用本發(fā)明的制造方法，能夠特異性且高效地制造支鏈少的低聚糖。反應(yīng)條件可以基于在使用α-葡萄糖苷酶制造低聚糖時(shí)通常采取的條件。
[0239]本發(fā)明的低聚糖的制造方法的第2方式中，使用顯示α-1，6鍵特異性的糖轉(zhuǎn)移活性的修飾型酶(例如，后述實(shí)施例所示的S495G、S495P、S495V)。此時(shí)底物的例子為異麥芽糖、異麥芽三糖、潘糖、異潘糖、淀粉(馬鈴薯淀粉、甘薯淀粉、玉米淀粉、小麥淀粉、木薯淀粉等)。通過(guò)該方式，典型地能夠特異性且高效地制造支鏈多的低聚糖。[0240]為了提高目標(biāo)低聚糖(第I方式中支鏈少的低聚糖，第2方式中典型的支鏈多的低聚糖)的產(chǎn)量，在修飾型酶之外還使用野生型酶。只要適于目標(biāo)低聚糖的生產(chǎn)即可，野生型酶無(wú)特別限制。例如，可以采用與使用的修飾型酶相對(duì)應(yīng)的野生型酶(即，為了得到該修飾型酶而進(jìn)行修飾的酶)。與該例子對(duì)照地，也可以將來(lái)源不同的修飾型酶與野生型酶并用。作為一個(gè)示例，可以是將黑曲霉的α-葡萄糖苷酶的修飾酶(修飾型酶)與構(gòu)巢曲霉的野生型α-葡萄糖苷酶B并用。
[0241]此處，如后述實(shí)施例所示，將顯示α -1, 6鍵特異性的糖轉(zhuǎn)移活性的修飾型酶與野生型酶并用時(shí)可知，能夠由具有α-1，4鍵的底物生成低聚糖。因此，本發(fā)明進(jìn)一步的方式中，使顯示α-1，6鍵特異性的糖轉(zhuǎn)移活性的修飾型酶(例如，后述實(shí)施例所示的S495G、S495P, S495V)和野生型酶、與具有α-1，4鍵的底物進(jìn)行作用，從而制得低聚糖。
[0242]對(duì)于本發(fā)明的修飾型酶，可期待通過(guò)其糖轉(zhuǎn)移活性而實(shí)現(xiàn)防止淀粉老化的效果、改善食品風(fēng)味的效果、調(diào)節(jié)腸功能效果等。因此，作為本發(fā)明的修飾型酶的用途的例子，可以舉出防止食品中淀粉老化、食品風(fēng)味的改善、調(diào)節(jié)腸功能等?？紤]到用于這些用途，作為本發(fā)明的又一方面，提供含有修飾型酶的組合物(醫(yī)藥組合物、準(zhǔn)醫(yī)藥組合物、化妝品組合物、食品組合物或餌料組合物)。
[0243]本發(fā)明的醫(yī)藥組合物和準(zhǔn)醫(yī)藥組合物的制劑化可以根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行。在制劑化時(shí)，可以含有制劑上可接受的其它成分(例如，載體、賦形劑、崩解齊U、緩沖齊U、乳化齊U、懸浮齊U、無(wú)痛化劑、穩(wěn)定劑、保存劑、防腐劑、生理鹽水等)。作為賦形劑可以使用乳糖、淀粉、山梨糖醇、D-甘露糖醇、蔗糖等。作為崩解劑，可以使用淀粉、羧甲基纖維素、碳酸鈣等。作為緩沖劑，可以使用磷酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽等。作為乳化劑，可以使用阿拉伯膠、精氨酸鈉、黃蓍膠等。作為懸浮劑，可以使用單硬脂酸甘油酯、單硬脂酸鋁、甲基纖維素、羧甲基纖維素、羥甲基纖維素、月桂基硫酸鈉等。作為無(wú)痛化劑，可以使用芐醇、氯丁醇、山梨糖醇等。作為穩(wěn)定劑，可以使用丙二醇，抗壞血酸等。作為保存劑，可以使用苯酚、苯扎氯銨、芐醇、氯丁醇、尼泊金甲酯等。作為防腐劑，可以使用苯扎氯銨、對(duì)羥基苯甲酸、氯丁醇等。
.[0244]制劑化時(shí)的劑型也無(wú)特別限制，例如可以以片劑、散劑、微粒劑、顆粒劑、膠囊劑、糖漿劑、注射劑、外用劑以及栓劑等提供本發(fā)明的醫(yī)藥組合物或準(zhǔn)醫(yī)藥組合物。
[0245]本發(fā)明的醫(yī)藥組合物中含有對(duì)達(dá)到期待的治療效果或預(yù)防效果所必需的量(即，治療有效量)的有效成分(修飾型酶)。同樣，本發(fā)明的準(zhǔn)醫(yī)藥組合物中含有對(duì)達(dá)到期待的治療效果或預(yù)防效果所必需的量的有效成分。本發(fā)明的醫(yī)藥組合物或準(zhǔn)醫(yī)藥組合物中含有的有效成分量通常隨劑型?形態(tài)不同而不同，但是為了達(dá)到期望的給藥量，將有效成分量設(shè)定在例如約0.1重量％?約95重量％的范圍內(nèi)。
[0246]本發(fā)明的醫(yī)藥組合物和準(zhǔn)醫(yī)藥組合物根據(jù)其劑型.形態(tài)以口服或非口服(靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、或腹腔注射、經(jīng)皮、經(jīng)鼻、經(jīng)粘膜、涂布等)的方式適用于對(duì)象。此處的“對(duì)象”無(wú)特別限制，其包括人和人以外的哺乳動(dòng)物(包括寵物動(dòng)物、家畜、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。具體例如小鼠、大鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠、猴、牛、豬、山羊、羊、狗、貓、雞、鵪鶉等)。優(yōu)選的一個(gè)實(shí)施方式中，適用對(duì)象是人。
[0247]本發(fā)明的醫(yī)藥組合物和準(zhǔn)醫(yī)藥組合物的給藥量.用量，可以根據(jù)得到期待的效果進(jìn)行設(shè)定。在有效的給藥量的設(shè)定中，通常要考慮適用對(duì)象的癥狀、年齡、性別、體重等。應(yīng)予說(shuō)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠考慮到這些事項(xiàng)而設(shè)定出適當(dāng)?shù)慕o藥量。作為給藥方案，可以采用例如I日I次?數(shù)次、2日I次或3日I次等。制定給藥方案的過(guò)程中，需要考慮適用對(duì)象的癥狀、有效成分的效果持續(xù)時(shí)間等。
[0248]本發(fā)明的化妝品組合物通過(guò)將修飾型酶和化妝品中通常使用的成分.基質(zhì)(例如,各種油脂、礦物油、凡士林、角鯊?fù)?、羊毛脂、蜂蠟、改性醇、棕櫚酸糊精、甘油、甘油脂肪酸酯、乙二醇、?duì)羥基苯甲酸酯、樟腦、薄荷醇、多種維生素、氧化鋅、氧化鈦、苯甲酸、乙二胺四乙酸、洋甘菊油、卡拉膠、幾丁質(zhì)粉末、殼聚糖、香料、著色劑等)配合而制得。作為化妝品組合物的形式，可例示為面部或身體用乳液、化妝水、霜、洗液、精華液、油、面膜、片、清潔劑等。化妝品組合物中修飾型酶的添加量無(wú)特別限制。例如，可以以0.01重量％?10重量％添加修飾型酶。
[0249]另一方面，作為本發(fā)明的“食品組合物”的例子，可例舉出普通食品(米飯類(lèi)、面包類(lèi)、谷物、蔬菜、肉類(lèi)、各種加工食品、點(diǎn)心類(lèi)、牛奶、清涼飲料、酒精飲料等)、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充食品(補(bǔ)充劑、營(yíng)養(yǎng)飲料等)、食品添加劑。對(duì)于營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充食品或食品添加劑的情形，可以以粉末、顆粒末、片、膏、液體等形式提供。
[0250]本發(fā)明的“餌料組合物”的例子為寵物食品(狗、貓、鳥(niǎo)、魚(yú)、爬行動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、
嚙齒動(dòng)物等的餌料)、飼料(家畜、家禽、觀賞魚(yú)等的餌料)。
[0251](修飾型α-葡萄糖苷酶的設(shè)計(jì)方法)
[0252]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及修飾型酶的設(shè)計(jì)方法，本發(fā)明的設(shè)計(jì)方法中實(shí)施以下步驟(i )和(? )，
[0253]步驟(i):在作為突變對(duì)象酶的α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列中，確定選自下述(I)?(14)中的一種或兩種以上的氨基酸。
[0254](I)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第385位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0255](2)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第491位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0256](3)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第535位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0257](4)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第450位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0258](5)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第534位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0259](6)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第537位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0260](7)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第538位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0261](8)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第554位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0262](9)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第556位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0263](10)與序列號(hào)2所示的氨基酸序列的第579位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0264](11)與序列號(hào)2所示的氨基酸序列的第585位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0265](12)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第630位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0266](13)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第683位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0267](14)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第689位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔?br> [0268]取代對(duì)象氨基酸⑴?(14)是作為對(duì)酶的特性重要的氨基酸而確定的氨基酸。因此，如果取代這些氨基酸，則能夠大大期待α-葡萄糖苷酶的特性發(fā)生變化。特別期待變化的特性是糖轉(zhuǎn)移活性和水解活性。本發(fā)明的設(shè)計(jì)方法作為設(shè)計(jì)這兩個(gè)活性的平衡發(fā)生改變的酶的方法特別有用。例如，在降低水解活性或使其消失的同時(shí)提高糖轉(zhuǎn)移活性的目的下，可以利用本發(fā)明的設(shè)計(jì)方法。[0269]本發(fā)明的設(shè)計(jì)方法中的突變對(duì)象酶為α-葡萄糖苷酶。突變對(duì)象酶典型地為野生型酶(自然中發(fā)現(xiàn)的酶)。但是，這并不妨礙將已實(shí)施任何的突變或修飾的酶作為突變對(duì)象酶。突變對(duì)象酶的例子為人麥芽糖酶-糖化酶(Human Maltase-glucoamylase) >黑曲霉的 α_ 葡萄糖苷酶(Aspergillus niger alpha-glucosidase)、人中性 α-葡萄糖苷酶 C (Human Neutral alpha-glucosidase C)、鼠溶酶體 α-葡萄糖苷酶(MouseLysosomal alpha-glucosidase)、酵母的 ct -葡萄糖昔酶(Yeast GLU2A)、構(gòu)巢曲霉的 α_ 葡萄糖苷酶 A (Aspergillus nidulans Alpha-glucosidase AgdA)、構(gòu)巢曲霉的 α _ 葡萄糖苷酶 B (Aspergillus nidulans Alpha-glucosidase AgdB)、爪睡毛霉的ct -葡萄糖苷酶(Mucor javanicus alpha-glucosidase)、米曲霉的α-葡萄糖苷酶(Aspergillus oryzae alpha-glucosidase)、蔥狀被抱霉的 α -葡萄糖苷酶(Mortierellaalliacea alpha-glucosidase)、粟酒裂殖酵母的 ct -葡萄糖昔酶(Schizosaccharomycespombe alpha-glucosidase)、德巴利酵母的 ct -葡萄糖昔酶(Debaryomycesoccidentalis alpha-glucosidase)、大麥的 α -葡萄糖苷酶(Hordeum vulgare subsp.vulgare alpha-glucosidase)、擬南芥的 ct -葡萄糖苷酶(Arabidopsis thalianaalpha-glucosidase)、疲菜的 ct -葡萄糖昔酶(Spinacia oleracea alpha-glucosidase)、甜菜的ct-葡萄糖苷酶(Beta vulgaris alpha-glucosidase)、馬鈴薯的α -葡萄糖苷酶(Solanum tuberosum alpha-glucosidase)。如上所述,這些α -葡萄糖苷酶的氨基酸序列在公共的數(shù)據(jù)庫(kù)中有收載(序列號(hào)I?17)。優(yōu)選的一個(gè)實(shí)施方式中，將由它們中任意一個(gè)氨基酸序列構(gòu)成的酶作為突變對(duì)象酶。
[0270]本發(fā)明中步驟(i)之后，進(jìn)行以下的步驟(ii)。
[0271]步驟(ii):在 突變對(duì)象酶的氨基酸序列的基礎(chǔ)上，構(gòu)建將步驟(i)中確定的氨基酸序列取代為其它氨基酸而得的氨基酸序列。
[0272]取代后的氨基酸的種類(lèi)無(wú)特別限制。因此，其可以為保守性氨基酸取代，也可以為非保守性氨基酸取代。
[0273](修飾型α-葡萄糖苷酶的制備方法)
[0274]本發(fā)明的又一個(gè)方面涉及修飾型酶的制備方法。本發(fā)明的制備方法的一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明人等應(yīng)用基因工程方法制備修飾型酶取得成功。該實(shí)施方式的情況下，準(zhǔn)備編碼序列號(hào)18?42、74?78中任意一個(gè)氨基酸序列的核酸(步驟(I ))。此處，“編碼特定的氨基酸序列的核酸”是在將其表達(dá)時(shí)得到具有該氨基酸序列的多肽的核酸，由與該氨基酸序列相對(duì)應(yīng)的堿基序列構(gòu)成的核酸當(dāng)然可以，也可以在這樣的核酸中增加多余的序列(可以是編碼氨基酸序列的序列，也可以是不編碼氨基酸序列的序列)。另外，也可以考慮密碼子的簡(jiǎn)并。“編碼序列號(hào)18?42、74?78中任意一個(gè)氨基酸序列的核酸”可以通過(guò)參考本說(shuō)明書(shū)或附加的序列表公開(kāi)的序列信息，使用標(biāo)準(zhǔn)的基因工程學(xué)方法、分子生物學(xué)方法、生物化學(xué)方法等而制備成純化的狀態(tài)。此處，序列號(hào)18?42、74?78的氨基酸序列均是對(duì)源自黑曲霉的α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列實(shí)施突變而得的氨基酸序列。因此，通過(guò)對(duì)編碼源自黑曲霉的α-葡萄糖苷酶的基因(序列號(hào)73)進(jìn)行必要的突變，也能夠得到編碼序列號(hào)18?42、74?78中任意一個(gè)氨基酸序列的核酸(基因)。用于位置特異性堿基序列取代的方法在該【技術(shù)領(lǐng)域】中已知道很多(例如,可參考Molecular Cloning, ThirdEdition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York),可以從中選擇出的適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ褂?。作為位置特異性突變?dǎo)入法，可以采用位置特異性氨基酸飽和突變法。位置特異性氨基酸飽和突變法是以蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，推定與所需功能相關(guān)的位置，導(dǎo)入氨基酸飽和突變的 “Sem1-rational, sem1-random” 方法(J.Mol.Biol.331，585-592 (2003))。例如，可以使用 KOD-Plus-Mutagenesis Kit (東洋紡公司)、Quick change (Stratagene 公司)等試劑盒、Overlap extention PCR (Nucleic Acid Res.16, 7351-7367 (1988))導(dǎo)入位置特異性氨基酸飽和突變。用于PCR的DNA聚合酶可以使用Taq聚合酶等。其中優(yōu)選使用KOD-PLUS-(東洋紡公司)、Pfu turbo (Stratagene公司)等質(zhì)量高的DNA聚合酶。
[0275]本發(fā)明的其它的實(shí)施方式中，以利用本發(fā)明的設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)的氨基酸序列為基礎(chǔ)，制備修飾型酶。該實(shí)施方式情況下，步驟(I )中，準(zhǔn)備編碼由本發(fā)明的設(shè)計(jì)方法構(gòu)建的氨基酸序列的核酸。例如，以由本發(fā)明的設(shè)計(jì)方法構(gòu)建的氨基酸序列為基礎(chǔ)，對(duì)編碼修飾型酶的基因進(jìn)行必要的突變(即，作為表達(dá)產(chǎn)物的蛋白質(zhì)中的特定位置上的氨基酸取代)，從而得到編碼修飾型酶的核酸(基因)。
[0276]步驟(I )之后，將準(zhǔn)備的核酸進(jìn)行表達(dá)(步驟(II ))。例如，首先準(zhǔn)備插入有上述核酸的表達(dá)載體，用其將宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化。“表達(dá)載體”是指能夠?qū)⒉迦肫渲械暮怂釋?dǎo)入目標(biāo)細(xì)胞(宿主細(xì)胞)內(nèi)，且在該細(xì)胞內(nèi)能夠表達(dá)的載體。表達(dá)載體通常含有對(duì)插入的核酸的表達(dá)所必需的啟動(dòng)子序列、促進(jìn)表達(dá)的增強(qiáng)子序列等。也可以使用含有選擇標(biāo)記的表達(dá)載體。使用上述表達(dá)載體時(shí)，能夠利用選擇標(biāo)記確認(rèn)是否導(dǎo)入表達(dá)載體(及其程度)。
[0277]接下來(lái)，在作為表達(dá)產(chǎn)物的修飾型酶的產(chǎn)生的條件下，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)可以采用常規(guī)方法。作為培養(yǎng)基中使用的碳源，可以是能夠同化的碳化合物，例如，可使用葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、蜜糖、丙酮酸等。另外，作為氮源，可以是能夠使用的氮化合物，例如，可使用蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白水解物、豆柏堿提取物等。以外，可根據(jù)需要使用磷酸鹽、碳酸鹽、硫酸鹽、鎂、鈣、鉀、鐵、錳、鋅等鹽類(lèi)、特定的氨基酸、特定的維生素等。
[0278]另一方面，可以將培養(yǎng)溫度設(shè)定在30°C?40°C的范圍內(nèi)(優(yōu)選為37°C附近)?？煽紤]培養(yǎng)對(duì)象轉(zhuǎn)化體的繁殖特性、修飾型酶的產(chǎn)生特性等對(duì)培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行設(shè)定。培養(yǎng)基的pH在轉(zhuǎn)化體繁殖且產(chǎn)生酶的范圍內(nèi)進(jìn)行`調(diào)節(jié)。優(yōu)選的培養(yǎng)基的pH在6.0?9.0左右(優(yōu)選為ρΗ7.0附近)。
[0279]接下來(lái)，回收表達(dá)產(chǎn)物(修飾型酶)(步驟(III ))。培養(yǎng)后的含有菌體的培養(yǎng)液保持原狀，或經(jīng)過(guò)濃縮、去除雜質(zhì)等之后，作為酶溶液進(jìn)行利用，但是，通常從培養(yǎng)液或菌體中一度回收表達(dá)產(chǎn)物。表達(dá)產(chǎn)物為分泌型蛋白質(zhì)時(shí)從培養(yǎng)液回收，除此以外的情況從菌體內(nèi)回收。從培養(yǎng)液進(jìn)行回收時(shí)，例如，過(guò)濾培養(yǎng)上清液、離心處理去除不溶物之后，通過(guò)將減壓濃縮、膜濃縮、使用硫酸銨或硫酸鈉進(jìn)行鹽析、通過(guò)甲醇、乙醇或丙酮等進(jìn)行分別沉淀法、透析、加熱處理、等電點(diǎn)處理、凝膠過(guò)濾、吸附色譜法、離子交換色譜法、親和色譜法等各種色譜法(例如，通過(guò)葡聚糖(Sephadex)凝膠(GE Healthcare Science公司)等凝膠過(guò)濾,DEAE 瓊脂糖 CL_6B(GE Healthcare Science 公司)、辛基瓊脂糖 CL_6B(GE HealthcareScience公司)、CM瓊脂糖CL-6B(GE Healthcare Science公司))等組合進(jìn)行分離、純化，得到修飾型酶的純化品。另一方面，從菌體內(nèi)回收時(shí)，通過(guò)過(guò)濾培養(yǎng)液、離心處理等收集菌體，然后，通過(guò)加壓處理、超聲波處理等機(jī)械方法或通過(guò)溶菌酶等酶方法將菌體破碎后，通過(guò)進(jìn)行與前文相同的分離、純化，能夠制得修飾型酶的純化品。[0280]可以通過(guò)例如冷凍干燥、真空干燥或噴霧干燥等將如上得到的純化酶以粉末化的形式進(jìn)行提供。此時(shí)，可以將純化酶預(yù)先溶解于磷酸緩沖液、三乙醇胺緩沖液、Tris-HCl緩沖液或GOOD的緩沖液中。優(yōu)選使用磷酸緩沖液、三乙醇胺緩沖液。應(yīng)予說(shuō)明，此處，作為GOOD的緩沖液，可例舉為PIPES、MES或MOPS。
[0281]通常如上所述利用合適的宿主-載體系統(tǒng)，進(jìn)行基因的表達(dá)?表達(dá)產(chǎn)物(修飾型酶)的回收，但是也可以利用無(wú)細(xì)胞合成系統(tǒng)。此處，“無(wú)細(xì)胞合成系統(tǒng)(無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)、無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng))”是指不使用活細(xì)胞，而利用源自活細(xì)胞的(或者通過(guò)基因工程方法得到的)核糖體、轉(zhuǎn)錄.翻譯因子等，由作為模板的核酸(DNA或mRNA)在體外合成其編碼的mRNA、蛋白質(zhì)。無(wú)細(xì)胞合成系統(tǒng)中，通常使用根據(jù)需要將細(xì)胞破碎液純化得到的細(xì)胞提取液。細(xì)胞提取液中，通常含有蛋白質(zhì)合成所必需的核糖體、起始因子等各種因子、tRNA等各種酶。進(jìn)行蛋白質(zhì)合成時(shí)，在該細(xì)胞提取液中，可添加各種氨基酸、ATP、GTP等能量源、磷酸肌酸等蛋白質(zhì)合成必需的其它物質(zhì)。當(dāng)然，蛋白質(zhì)合成時(shí)，也可以根據(jù)需要補(bǔ)充另外準(zhǔn)備的核糖體或各種因子和/或各種酶等。
[0282]將蛋白質(zhì)合成中必需的各分子(因子)重新構(gòu)建的轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)也有報(bào)道(Shimizu, Y.et al.:Nature Biotech.，19，751-755，2001)。在該合成體系中，從大腸桿菌基因組將由構(gòu)成細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成體系統(tǒng)的3種起始因子、3種延伸因子、與終止相關(guān)的4種因子、將各個(gè)氨基酸與tRNA連接的20種氨基酰基tRNA合成酶以及甲硫氨酰tRNA甲酰轉(zhuǎn)移酶構(gòu)成的31種因子的基因進(jìn)行擴(kuò)增，使用這些在體外重新構(gòu)建蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)。本發(fā)明中也可以利用這種重新構(gòu)建的合成系統(tǒng)。
[0283]術(shù)語(yǔ)“無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)”可與無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)、體外翻譯系統(tǒng)或體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)交換使用。體外翻譯系統(tǒng)中將RNA作為模板使用，合成蛋白質(zhì)。作為模板RNA可以使用全RNA、mRNA、體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物等。其它的體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中，使用DNA作為模板。模板DNA應(yīng)含有核糖體結(jié)合區(qū)域，另外優(yōu)選含有適當(dāng)?shù)慕K止子序列。應(yīng)予說(shuō)明，體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中，設(shè)定在 添加各反應(yīng)所必需的因子以使得轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和翻譯反應(yīng)連續(xù)進(jìn)行的條件。
[0284]實(shí)施例
[0285]A.修飾型α -葡萄糖苷酶的獲得I
[0286]以α-葡萄糖苷酶(別名轉(zhuǎn)葡萄糖苷酶。以下簡(jiǎn)稱(chēng)“TG”)為模型，利用蛋白質(zhì)工程學(xué)，對(duì)將水解反應(yīng)和脫水縮合反應(yīng)一方向化的技術(shù)(One direction technology)進(jìn)行研究。TG為在低聚糖制備中使用的酶，其具有水解糖苷鍵的活性，同時(shí)，也具有糖轉(zhuǎn)移活性，能夠由麥芽糖生成低聚糖類(lèi)。為了開(kāi)發(fā)出能夠更有效率地進(jìn)行糖轉(zhuǎn)移的TG，進(jìn)行了研究。
[0287](I)使用了計(jì)算機(jī)程序的突變導(dǎo)入點(diǎn)的研究
[0288]以在分子水平對(duì)TG進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，設(shè)計(jì)出低聚糖生成能力提高的新型酶為目的，實(shí)施計(jì)算機(jī)模擬。關(guān)于X射線結(jié)晶結(jié)構(gòu)解析已被報(bào)道的源自人小腸的α-葡萄糖苷酶(序列號(hào)I)，以基于TG的立體結(jié)構(gòu)、進(jìn)化的知識(shí)的功能預(yù)測(cè)為基礎(chǔ)，通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬確定突變導(dǎo)入點(diǎn)。具體而言，應(yīng)用HotSpot Wizard程序(非專(zhuān)利文獻(xiàn)Pavelka等Nucleic AcidsRes.37W376-83.(2009))，計(jì)算人α -葡萄糖苷酶中能夠預(yù)想成為突變導(dǎo)入點(diǎn)的氨基酸，結(jié)果選出3個(gè)位點(diǎn)的氨基酸(第385位氨基酸:Υ385、第491位氨基酸:V491、第535位氨基酸:N535)。能夠預(yù)見(jiàn)均在與底物相接的區(qū)域，與底物的活性相關(guān)(圖1，A)。接下來(lái)，選擇5種α -葡萄糖苷酶的同源物，應(yīng)用CLUSTALW對(duì)上述突變導(dǎo)入點(diǎn)附近的序列進(jìn)行比對(duì)比較。由于Y385、V491和N535均是附近的序列的同源性高地高度保守，所以可以預(yù)見(jiàn)它們是對(duì)酶的功能重要的區(qū)域。在黑曲霉(Asp.Niger)的TG中確定了與這些突變導(dǎo)入點(diǎn)對(duì)應(yīng)的氨基酸(圖1，C)。與Y385對(duì)應(yīng)的氨基酸是W343，與V491對(duì)應(yīng)的氨基酸是V452，與N535對(duì)應(yīng)的氨基酸是S496。設(shè)計(jì)用于對(duì)這些氨基酸導(dǎo)入突變的引物，通過(guò)使用隨機(jī)引物的反向PCR法進(jìn)行突變導(dǎo)入。在大腸桿菌中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，小量提取后進(jìn)行序列分析，確認(rèn)突變導(dǎo)入。
[0289](2)篩選系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)
[0290]將制備好的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母INVscI株進(jìn)行培養(yǎng)。離心處理回收培養(yǎng)上清液，將分泌的酶作為結(jié)構(gòu)修飾TG的樣品。通過(guò)應(yīng)用離心柱的超濾，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行濃縮和脫鹽，結(jié)果得到大約10?50倍濃縮的酶樣品。
[0291]使用作為酶底物的麥芽糖,測(cè)定水解活性。將底物的終濃度配制為1%,利用含有葡萄糖氧化酶(GO)和過(guò)氧化物酶(PO)的氨基安替比林.苯酚的著色溶液將由水解生成的葡萄糖顯色，測(cè)定0D500將其定量化。使用葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(Standard)，由吸光度計(jì)算出生成的葡萄糖量。
[0292]為了考察低聚糖合成活性，通過(guò)HPLC解析生成的低聚糖。使用50%麥芽糖水溶液作為底物，確定生成的低聚糖。HPLC的條件如下所示。
[0293]柱:TSKGELAmido-80 (TOSOH)
[0294]溶劑:MeCN/H20= 2/l
[0295]檢測(cè)器:RI
[0296]將HPLC的區(qū)域面積制成圖，由此推定分別生成的低聚糖的糖數(shù)。將上述的篩選方法的概述示于圖2。
[0297](3) I個(gè)氨基酸取代的結(jié)構(gòu)修飾TG的評(píng)價(jià)
[0298]黑曲霉的α-葡萄糖苷酶(序列號(hào)2)中，在與上述突變導(dǎo)入點(diǎn)(Y385、V491、Ν535)對(duì)應(yīng)的位置、即W343、V452或S496，通過(guò)PCR法導(dǎo)入隨機(jī)突變(I個(gè)氨基酸取代)。突變導(dǎo)入后，進(jìn)行序列分析，確定導(dǎo)入的點(diǎn)突變。對(duì)得到的3種結(jié)構(gòu)修飾TG(W343M、V452G、S496V)進(jìn)行解析。應(yīng)予說(shuō)明，進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確認(rèn)在培養(yǎng)上清液中發(fā)現(xiàn)源自質(zhì)粒的蛋白質(zhì)，且該酶具有水解活性。
[0299]首先，以高濃度麥芽糖溶液作為底物，測(cè)定低聚糖合成活性。作為其結(jié)果，在圖3中示出了典型的HPLC圖案。表達(dá)野生型(WT)TG的樣品中，底物麥芽糖的峰減少，出現(xiàn)葡萄糖、異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖的峰(圖3，A)。另外，在四糖的區(qū)域中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)分開(kāi)的峰。
[0300]另一方面，與WT進(jìn)行比較，在結(jié)構(gòu)修飾的TG中，底物麥芽糖的峰減少，發(fā)現(xiàn)葡萄糖、麥芽三糖、潘糖的峰(圖3，B?D)。另外，在四糖的區(qū)域中發(fā)現(xiàn)I個(gè)穩(wěn)固的峰(圖3，B?D)。結(jié)構(gòu)修飾TG生成的低聚糖與WT不同，異麥芽糖類(lèi)的低聚糖的生成量大幅降低。
[0301]接下來(lái)，通過(guò)將HPLC的區(qū)域進(jìn)行定量，將結(jié)構(gòu)修飾TG的低聚糖合成活性與WT進(jìn)行比較。圖4的圖形示出了三糖以上的區(qū)域面積的總和。雖然WT也生成了三糖以上的低聚糖，但是在任何結(jié)構(gòu)修飾TG中，生成的低聚糖的區(qū)域面積都比WT更大(大約增加20%)。
[0302]在考察取代后的氨基酸的種類(lèi)與糖轉(zhuǎn)移活性的關(guān)系的目的下，制備與突變導(dǎo)入點(diǎn)(385Y)對(duì)應(yīng)的氨基酸W343相關(guān)的各種結(jié)構(gòu)修飾TG，比較低聚糖合成能力。結(jié)果表明，取代后的氨基酸為半胱氨酸(W343C)、天冬氨酸(W343D)、蛋氨酸(W343M)、組氨酸(W343H)、丙氨酸(W343A)、苯丙氨酸(W343F)、甘氨酸(W343G)、蘇氨酸(W343T)、谷氨酸(W343E)、纈氨酸(W343V)、谷氨酰胺(W343Q)、天冬酰胺(W343N)或異亮氨酸(W343I)時(shí)，結(jié)構(gòu)修飾TG生成的三糖以上的低聚糖量與WT相比增加(圖5，上圖)。對(duì)四糖以上的低聚糖進(jìn)行同樣的比較，結(jié)果表明對(duì)于取代后的氨基酸為蛋氨酸(W343M)、天冬氨酸(W343D)、半胱氨酸(W343C)、苯丙氨酸(W343F)、谷氨酰胺(W343Q)、組氨酸(W343H)、蘇氨酸(W343T)、谷氨酸(W343E)、甘氨酸(W343G)、天冬酰胺(W343N)、纈氨酸(W343V)或丙氨酸(W343A)，結(jié)構(gòu)修飾TG比WT合成能力優(yōu)異(圖5，下圖)。可以評(píng)價(jià):三糖以上的低聚糖的合成量和四糖以上的低聚糖的合成量均較高的結(jié)構(gòu)修飾TGJP W343C、W343D、W343M，低聚糖合成能力特別優(yōu)異。另外，可以說(shuō)四糖以上的低聚糖的合成量與WT相比明顯多的W343M、W343D、W343C、W343F、W343Q和W343H對(duì)更長(zhǎng)鏈的低聚糖的合成有利。
[0303]通過(guò)對(duì)HPLC的區(qū)域面積進(jìn)行定量，將結(jié)構(gòu)修飾TG的低聚糖合成活性與WT進(jìn)行比較。制備與氨基酸V452相關(guān)的各種結(jié)構(gòu)修飾TG，比較低聚糖合成能力。結(jié)果表明，取代后的氨基酸為甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸時(shí)，三糖以上的低聚糖量與WT相比增加(圖6)。另夕卜，對(duì)四糖以上的低聚糖進(jìn)行同樣的比較，結(jié)果表明，取代后的氨基酸為天冬氨酸(V452D)時(shí)，結(jié)構(gòu)修飾TG與WT相比，其合成能力優(yōu)異(圖6)。同樣，制備與氨基酸S496相關(guān)的各種結(jié)構(gòu)修飾TG，比較低聚糖合成能力。結(jié)果表明，取代后的氨基酸為纈氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺時(shí)，對(duì)于三糖以上的低聚糖和四糖以上的低聚糖的任一情形，結(jié)構(gòu)修飾TG均比WT合成能力優(yōu)異(圖6)。
[0304]根據(jù)上述內(nèi)容，可知結(jié)構(gòu)修飾TG中，異麥芽糖系低聚糖的生成量大幅降低。因此，考慮到對(duì)糖苷鍵的反應(yīng)性發(fā)生變化，考察對(duì)各種糖苷鍵的水解活性。作為酶底物，制備作為二糖的麥芽糖U-l，4)、異麥芽糖(α-1，6)的水溶液。WT對(duì)α-1，4鍵和α-1，6鍵二者具有底物親和性(圖7)。對(duì)照地，盡管結(jié)構(gòu)修飾TG對(duì)α -1, 4鍵的水解活性與WT型相比基本沒(méi)有變化，但是對(duì)α -1, 6鍵的水解活性降低至1/5以下(圖7)。
[0305](4) 2個(gè)氨基酸.取代的結(jié)構(gòu)修飾TG的評(píng)價(jià)
[0306]取代第343位色氨酸的結(jié)構(gòu)修飾TG中，通過(guò)導(dǎo)入進(jìn)一步的突變(存在于隧道結(jié)構(gòu)的表面的2個(gè)氨基酸(V452、S496)的任意一個(gè))，制備對(duì)2個(gè)氨基酸導(dǎo)入突變的結(jié)構(gòu)修飾TG0對(duì)得到的結(jié)構(gòu)修飾TG的水解活性進(jìn)行測(cè)定。如圖8所示，在W343D/S496I (第343位W由D取代且第496位S由I取代)、W343D/S496R(第343位W由D取代且第496位S由R取代)完全未檢測(cè)出活性。另一方面，W343D/V452G (第343位W由D取代且第452位V由G取代)、W343M/S496C (第343位W由M取代且第496位S由C取代)、W343M/S496T (第343位W由M取代且第496位S由T取代)的3種結(jié)構(gòu)修飾TG，其異麥芽糖的水解活性大幅降低(約1/20)。
[0307]接下來(lái)，測(cè)定低聚糖合成活性。使WT型TG表達(dá)的樣品中，關(guān)于三糖，發(fā)現(xiàn)了潘糖和異麥芽三糖的峰(圖9，A)。另一方面，W343M中，與目前為止的結(jié)果同樣，關(guān)于三糖，發(fā)現(xiàn)麥芽三糖和潘糖的峰(圖9、B)。作為2個(gè)氨基酸取代TG的W343M/S496T和W343D/V452G中，關(guān)于三糖，僅發(fā)現(xiàn)I個(gè)峰，可以預(yù)見(jiàn)為麥芽三糖(圖9、C和D的箭頭)。另外，在四糖的區(qū)域中，通過(guò)HPLC僅發(fā)現(xiàn)了 I個(gè)峰，得到與WT型的分析圖案有很大差別的結(jié)果(圖9、C和D)。該四糖的峰是僅在2個(gè)氨基酸取代TG中看到的峰，表明生成的低聚糖與WT型不同。
[0308]通過(guò)對(duì)HPLC的區(qū)域面積進(jìn)行定量，將結(jié)構(gòu)修飾TG的低聚糖合成活性與WT進(jìn)行比較。所有的2個(gè)氨基酸取代TG，生成的低聚糖的區(qū)域面積均比WT大，三糖以上的低聚糖的合成量增加20-50%(圖10)。另外，W343M/S496T的四糖以上的低聚糖的合成量與WT相比顯著增多，增加近70%(圖10)。
[0309]另一方面，研究結(jié)構(gòu)修飾TG對(duì)糖苷鍵的水解活性。W343M/S496T中，對(duì)麥芽糖和麥芽三糖的水解活性為50%，對(duì)異麥芽糖的水解活性為10%以下(圖11)。對(duì)曲二糖的水解活性約為40%，對(duì)黑曲霉糖的水解活性降低至大約10%(圖11)。由上述的結(jié)果可知，將2個(gè)氨基酸取代的結(jié)構(gòu)修飾TG的水解活性降低，特別是對(duì)α -1, 6鍵和α -1, 3鍵的水解活性大幅降低。
[0310](5)結(jié)構(gòu)修飾TG生成的低聚糖的解析
[0311]根據(jù)以往的報(bào)告，如果低聚糖合成時(shí)使用的起始底物的糖數(shù)增加，則TG生成的低聚糖中的α-1，6鍵的比例增加。因此，以五糖的麥芽五糖為底物進(jìn)行低聚糖合成反應(yīng)，在WT型與結(jié)構(gòu)修飾TG之間比較生成的低聚糖。首先，測(cè)定作為標(biāo)準(zhǔn)的葡萄糖(G=I)、麥芽糖(G=2)、麥芽三糖(G=3)、麥芽五糖(G=5)確認(rèn)峰的位置(圖12)。WT型TG中，在葡萄糖?七糖以上的區(qū)域，大范圍地進(jìn)行分解和生產(chǎn)(圖12)。但是，五糖以下的比例多，能夠預(yù)見(jiàn)與低聚糖合成相比，水解占優(yōu)。另一方面、結(jié)構(gòu)修飾TG(W343M和W343M/S496T)中，水解到I糖、2糖的較少，六糖以上的生成量變多(圖12)。圖12的箭頭顯示的區(qū)域，在WT和結(jié)構(gòu)修飾TG之間的差異特別大。
[0312]接下來(lái)，將麥芽糖和異麥芽糖的混合溶液作為起始底物，進(jìn)行低聚糖合成。生成的低聚糖的比例沒(méi)有大的變化，但是，生成的三糖的種類(lèi)存在差別。WT型中具有2個(gè)α-1，6鍵的異麥芽三糖大量生成(圖13)。另一方面，結(jié)構(gòu)修飾TG(W343M和W343M/S496T)中，具有α_1，4鍵和α-1，6鍵的潘糖生成最多(圖13，箭頭)。另外，對(duì)于結(jié)構(gòu)修飾TG的情形，起始底物的異麥芽糖基本沒(méi)有被分解。
[0313]通過(guò)上述結(jié)果，啟示了 `WT型TG主要生成在α-1，6位進(jìn)行糖轉(zhuǎn)移的低聚糖，與此相對(duì)，結(jié)構(gòu)修飾TG特異性生成在α -1, 4位進(jìn)行糖轉(zhuǎn)移的低聚糖。
[0314]應(yīng)予說(shuō)明，在本次的研究中制成的各結(jié)構(gòu)修飾TG的氨基酸序列如下所示。
[0315]序列號(hào)18:W343C
[0316]序列號(hào)19:W343D
[0317]序列號(hào)20:W343M
[0318]序列號(hào)21:W343H
[0319]序列號(hào)22:W343A
[0320]序列號(hào)23:W343F
[0321]序列號(hào)24:W343G
[0322]序列號(hào)25:W343T
[0323]序列號(hào)26:W343E
[0324]序列號(hào)27:W343V
[0325]序列號(hào)28:W343Q
[0326]序列號(hào)29:W343N
[0327]序列號(hào)30:W343I
[0328]序列號(hào)31:V452G[0329]序列號(hào)32:V452D
[0330]序列號(hào)33:V452E
[0331]序列號(hào)34:S496V
[0332]序列號(hào)35:S496N
[0333]序列號(hào)36:S496Q
[0334]序列號(hào)37: W343D/V452A
[0335]序列號(hào)38: W343D/V452G
[0336]序列號(hào)39:W343D/S496I
[0337]序列號(hào)40: W343D/S496R
[0338]序列號(hào)41:W343M/S496C
[0339]序列號(hào)42: W343M/S496T
[0340]B.修飾型α -葡萄糖苷酶的獲得2
[0341 ] (I)使用了計(jì)算機(jī)模擬軟件MOE的突變導(dǎo)入點(diǎn)的研究
[0342]以用新方法確定突變導(dǎo)入點(diǎn)為目的，使用作為計(jì)算機(jī)模擬軟件的M0E(ChemicalComputing Group公司)研究TG的突變導(dǎo)入點(diǎn)。此時(shí)，將類(lèi)似的屬于麹菌的黑曲霉和構(gòu)巢曲霉的序列進(jìn)行比較，推定 突變導(dǎo)入點(diǎn)。
[0343]可以從公知的信息數(shù)據(jù)庫(kù)獲得黑曲霉的TG和構(gòu)巢曲霉的TG(a-葡萄糖苷酶B)的氨基酸序列，將其錄入Μ0Ε，在計(jì)算機(jī)上進(jìn)行蛋白質(zhì)建模。以各自氨基酸序列為基礎(chǔ)，從MOE的數(shù)據(jù)庫(kù)檢索同源性高的序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，均檢索到了相同的序列，選擇人TG。接下來(lái)，以該立體結(jié)構(gòu)為模板，將各自的蛋白質(zhì)進(jìn)行建模。在力場(chǎng)“AMBER99”中，制出5個(gè)中間體模型，最后制成I個(gè)模型結(jié)構(gòu)。
[0344]接下來(lái)，進(jìn)行對(duì)接模擬解析，預(yù)測(cè)底物口袋。將力場(chǎng)設(shè)定為“MMFF99X”，在MOE的Site Finder中檢索口袋。其結(jié)果能夠預(yù)測(cè)多個(gè)可能成為立體結(jié)構(gòu)的口袋的候選區(qū)域。因此，檢索以往論文等報(bào)告的成為T(mén)G活性中心的氨基酸，確定各自在模型上的位置。然后，將作為活性中心的含有多個(gè)氨基酸的區(qū)域確定為由模擬計(jì)算而得的底物口袋。
[0345]成功建模的各個(gè)立體結(jié)構(gòu)如圖14所示。如果比較黑曲霉的TG和構(gòu)巢曲霉的TG的結(jié)構(gòu)，則盡管以相同的人TG的立體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)建模，但各自的立體結(jié)構(gòu)之間發(fā)現(xiàn)有很大差別。比較模擬出的底物口袋時(shí)，與黑曲霉相比構(gòu)巢曲霉的底物口袋變小。黑曲霉中由30個(gè)氨基酸構(gòu)成底物口袋，與此相對(duì)，構(gòu)巢曲霉由22個(gè)氨基酸構(gòu)成(圖14)。
[0346]接下來(lái)，通過(guò)CLASTAL-W對(duì)黑曲霉的TG的氨基酸序列和構(gòu)巢曲霉的TG的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。比較全部的氨基酸序列時(shí)，這兩個(gè)蛋白質(zhì)的同源性低，計(jì)算得出氨基酸相同的比例為35%。但是，僅限于對(duì)底物口袋的序列進(jìn)行比較時(shí)，序列的同源性變高，黑曲霉的底物口袋的30個(gè)中19個(gè)氨基酸相同，構(gòu)巢曲霉的22個(gè)中19個(gè)氨基酸相同(圖15)。該結(jié)果提示與活性相關(guān)的氨基酸與全部序列相比是高度保守的。另一方面，判斷不一致的氨基酸進(jìn)化性保守性不高，可預(yù)期能夠?qū)胪蛔儭Ｒ虼?，將這些氨基酸作為突變導(dǎo)入的候選點(diǎn)位(圖15)。另外，由于選擇了已經(jīng)導(dǎo)入突變的W343和S496，所以認(rèn)為與應(yīng)用了目前為止使用的人TG的利用Hot spots wizard進(jìn)行的模擬具有相關(guān)性。
[0347]實(shí)際操作中，為了對(duì)黑曲霉的TG進(jìn)行突變導(dǎo)入而設(shè)計(jì)引物，并以應(yīng)用了隨機(jī)引物的反向PCR(inverse PCR)法進(jìn)行突變導(dǎo)入。對(duì)大腸桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，小量提取(min1-prep)后，進(jìn)行序列解析，確認(rèn)突變導(dǎo)入。另外，對(duì)酵母進(jìn)行轉(zhuǎn)化，表達(dá)重組的結(jié)構(gòu)修飾TG，進(jìn)行解析。實(shí)際操作中，示出了對(duì)于S495和C498的這2點(diǎn)的解析結(jié)果。
[0348](2) S495修飾型TG的評(píng)價(jià)
[0349]黑曲霉的TG中，在第495位的絲氨酸(S495)通過(guò)PCR法導(dǎo)入隨機(jī)突變(I個(gè)氨基酸取代)。進(jìn)行序列解析，確定導(dǎo)入的點(diǎn)突變，對(duì)修飾型TG進(jìn)行解析。
[0350]對(duì)于這些修飾型TG，使用HPLC測(cè)定低聚糖合成活性并進(jìn)行比較。作為底物，使用50%麥芽糖水溶液、異麥芽糖水溶液以及作為五糖的低聚糖的麥芽五糖水溶液。將反應(yīng)溫度設(shè)定為50°C孵育一定時(shí)間(麥芽糖、麥芽五糖:48小時(shí)，異麥芽糖:96小時(shí))。
[0351]通過(guò)對(duì)HPLC的區(qū)域面積進(jìn)行定量，比較修飾型TG的低聚糖合成活性。對(duì)于底物為麥芽糖的情形，三糖以上和四糖以上的區(qū)域面積的總和，S495G比WT大。但是，S495P和S495T反而減少(圖16)。
[0352]對(duì)于底物為異麥芽糖的情形，三糖以上的區(qū)域面積的總和，S495G、S495P和S495V比WT大(圖17)。另外，四糖以上的區(qū)域面積的總和，S495G和S495P比WT大，提示低聚糖合成能力提高(圖17)。觀察HPLC的峰，三糖中異麥芽三糖增加，能夠推測(cè)結(jié)構(gòu)修飾TG與WT同樣具有使糖向α-1,6轉(zhuǎn)移的活性。由以上結(jié)果可知，S495G、S495P和S495V這3種能夠使α 1，6鍵的低聚糖增加50%以上。
[0353]因此，考慮到結(jié)構(gòu)修飾TG對(duì)糖苷鍵的反應(yīng)性不同，研究了對(duì)各種糖苷鍵的水解活性(圖18)。作為底物使用麥芽糖水溶液和異麥芽糖水溶液，通過(guò)對(duì)生成的葡萄糖量進(jìn)行定量，來(lái)評(píng)價(jià)水解活性。結(jié)果 顯示，WT對(duì)α -1, 4鍵和α -1, 6鍵這兩種糖苷鍵具有底物親和性。另一方面，S495A、S495G、S495P、S495T和S495V對(duì)麥芽糖的水解活性比WT低，但是，對(duì)異麥芽糖的水解活性相對(duì)升高。通過(guò)以上內(nèi)容可知，取代S495的結(jié)構(gòu)修飾TG對(duì)α -1，6鍵特異性提聞。
[0354]最后，以五糖的麥芽五糖為起始底物，進(jìn)行低聚糖合成反應(yīng)，在WT型TG和結(jié)構(gòu)修飾TG之間比較生成的低聚糖(圖19)。WT型TG中從葡萄糖到六糖以上的區(qū)域內(nèi)大范圍地發(fā)生分解和生產(chǎn)。繪制成圖可以看出，一糖的量最多，可見(jiàn)反應(yīng)中進(jìn)行了水解。結(jié)構(gòu)修飾TG中，均發(fā)現(xiàn)低聚糖的增加。特別地，S495P型和S495V型的結(jié)構(gòu)修飾TG，被水解的糖類(lèi)較少，六糖以上的生成變多(圖19c)。
[0355]如上所述，成功獲得3種具有α 1，6位特異性轉(zhuǎn)移活性的結(jié)構(gòu)修飾TG。另外，可知由結(jié)構(gòu)修飾TG生成的低聚糖以含有α 1，6鍵的鍵合方式進(jìn)行聚合，低聚糖的生成量增加。
[0356](3) C498修飾型TG的評(píng)價(jià)
[0357]在黑曲霉的TG中，在第498位的半胱氨酸(C498)通過(guò)PCR法導(dǎo)入隨機(jī)突變(I個(gè)氨基酸取代)。進(jìn)行序列解析，確定導(dǎo)入的點(diǎn)突變，對(duì)修飾型TG進(jìn)行解析。
[0358]對(duì)于這些結(jié)構(gòu)修飾TG，使用HPLC測(cè)定低聚糖合成活性并進(jìn)行比較。使用60%麥芽糖水溶液作為底物，在反應(yīng)溫度50°C孵育48小時(shí)。
[0359]通過(guò)對(duì)HPLC的區(qū)域面積進(jìn)行定量，比較結(jié)構(gòu)修飾TG的低聚糖合成活性(圖20)。比較三糖以上的區(qū)域面積的總和，結(jié)果與WT相比，C498L和C498S的區(qū)域面積增大。另外，四糖以上的區(qū)域面積的總和也同樣地，與WT相比，C498L和C498S確認(rèn)增大。
[0360]以目前的研究為出基礎(chǔ)，考慮結(jié)構(gòu)修飾TG對(duì)糖苷鍵的反應(yīng)性產(chǎn)生變化，測(cè)定水解活性。使用麥芽糖水溶液和異麥芽糖水溶液作為底物，對(duì)生成的葡萄糖量進(jìn)行定量。如圖21所示，可知與WT相比，C498L和C498S對(duì)麥芽糖的水解活性高。另外，發(fā)現(xiàn)這些結(jié)構(gòu)修飾TG中，麥芽糖水解活性和異麥芽糖水解活性的比例發(fā)生大幅變化,可知對(duì)α 1,4鍵的特異性提聞。
[0361]如上所述，C498中通過(guò)突變導(dǎo)入低聚糖合成上升。另外，成功獲得2種低聚糖的合成能力提高的結(jié)構(gòu)修飾TG (顯示α 1，4位特異性轉(zhuǎn)移活性)。
[0362]另外，本次研究中制備的各結(jié)構(gòu)修飾TG的氨基酸序列如下所示。
[0363]序列號(hào)74:S495G
[0364]序列號(hào)75:S495P
[0365]序列號(hào)76:S495V
[0366]序列號(hào)77:C498L
[0367]序列號(hào)78:C498S
[0368]C.結(jié)構(gòu)修飾TG在食品領(lǐng)域的應(yīng)用
[0369]為了評(píng)價(jià)結(jié)構(gòu)修飾TG在健康食品領(lǐng)域的應(yīng)用可能性，使用人工消化模型系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。該模型系統(tǒng)中，使用源自唾液的淀粉酶將粥分解，考察TG對(duì)分解生成的低聚糖進(jìn)行怎樣的作用。對(duì)市售的粥，在接近胃液的PH的酸性范圍內(nèi)，使淀粉酶和TG作用(30分鐘?2小時(shí)，37°C加熱)，然后，采樣并終止酶反應(yīng)。然后，通過(guò)HPLC對(duì)生成的低聚糖進(jìn)行分析。淀粉酶的添加量，設(shè)定為相當(dāng)于唾液中淀粉酶的量1.45U/ml。另外，以事先的預(yù)研究的結(jié)果為基礎(chǔ)，將TG量設(shè)定為20 μ g/mL。以下，對(duì)實(shí)驗(yàn)報(bào)告詳細(xì)說(shuō)明。
.[0370](實(shí)驗(yàn)報(bào)告)
[0371]⑴將粥(味之素株式會(huì)社)由攪拌機(jī)進(jìn)行破碎，加入1/20量的IMNaOAc緩沖液(ρΗ5.0)。
[0372](ii)制備340 μ I的酶液(蛋白濃度:20 μ g/mL)。
[0373](iii)在玻璃試管中，加入⑴的粥0.65g、淀粉酶1.45U和酶液340 μ I。
[0374](iv)在37°C的熱水浴中進(jìn)行孵育，每30分鐘，取樣200 μ I置于微試管。
[0375](V)煮沸5分鐘，終止酶反應(yīng)。
[0376](vi) 12000rpm離心處理后，將上清液轉(zhuǎn)移至新的試管中。
[0377](vii)取120 μ 1，使用MilliQ (注冊(cè)商標(biāo))水稀釋到3倍。
[0378](viii)按以下條件進(jìn)行HPLC解析。
[0379](柱條件)
[0380]柱:TSKGELAmido-80
[0381]溶劑:MeCN/H20=2/l
[0382]檢測(cè)器:RI
[0383]流速:Iml/分鐘
[0384]對(duì)生成的低聚糖進(jìn)行HPLC解析的結(jié)果如圖22所示。通過(guò)淀粉酶的添加，全部的糖中40?50%變?yōu)辂溠刻?圖22 (a))。另外，生成三糖的麥芽三糖和四糖的麥芽四糖?；緵](méi)有生成葡萄糖，二糖沒(méi)有發(fā)生分解。添加野生型(WT) TG時(shí)，葡萄糖的生成量經(jīng)時(shí)增加，反應(yīng)開(kāi)始60分鐘后，發(fā)現(xiàn)生成異麥芽糖，伴隨時(shí)間的延長(zhǎng)三糖以上的低聚糖減少(圖22(b)、(d))。添加作為α 1，4位特異性的結(jié)構(gòu)修飾TG的W343M時(shí)，與野生型TG的情形同樣地麥芽糖分解發(fā)生糖轉(zhuǎn)移反應(yīng)。反應(yīng)開(kāi)始30分鐘后，與野生型TG之間，生成的低聚糖沒(méi)有大的差異，觀察到麥芽三糖、麥芽糖、葡萄糖的峰(圖22(c))。在另一方面中，W343M能夠抑制葡萄糖的生成，同時(shí)能夠?qū)Ⅺ溠刻寝D(zhuǎn)移成三糖以上的低聚糖(圖22(c))。與野生型TG相對(duì)照，添加W343M的情形中，很少見(jiàn)到三糖以上的低聚糖的減少，最終生成的低聚糖的量特別多(圖22 (d))。如果觀察實(shí)際的HPLC圖案(反應(yīng)開(kāi)始后90分鐘后)，則在添加W343M的情形中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)異麥芽糖的峰，而發(fā)現(xiàn)了尺寸更大的低聚糖的峰(圖23)。
[0385]如上所述，使用作為結(jié)構(gòu)修飾TG的W343M時(shí)，與使用野生型TG的情形相比，異麥芽糖的生成量減少，另一方面，麥芽三糖這類(lèi)鏈長(zhǎng)較長(zhǎng)的α 1，4鍵的低聚糖的生成量增加。反應(yīng)開(kāi)始90分鐘后進(jìn)行比較時(shí)，結(jié)構(gòu)修飾TG的葡萄糖生成量與野生型TG相比減少19.2%，三糖以上的低聚糖的生成量增加42.7%。這樣，證明了在人工消化模型系統(tǒng)中也適于低聚糖的生成這樣的結(jié)構(gòu)修飾TG的有用性。
[0386]D.野生型(WT) TG與結(jié)構(gòu)修飾TG的并用
[0387](I)以麥芽糖為底物的低聚糖合成
[0388]使用具有α 1，6位特異性轉(zhuǎn)移活性的結(jié)構(gòu)修飾TG，以作為α 1，4鍵的二糖的麥芽糖為底物，嘗試進(jìn)行低聚糖合成反應(yīng)，結(jié)果沒(méi)有發(fā)生低聚糖合成。其原因在于具有α 1，6位特異性轉(zhuǎn)移活性的結(jié)構(gòu)修飾TG對(duì)α 1，4鍵的反應(yīng)性低，即使底物為麥芽糖也不能夠充分推進(jìn)低聚糖合成反應(yīng)。因此，考慮如果與供給異麥芽糖的酶并用，則即使在以麥芽糖為底物的情形下也能夠推進(jìn)低聚糖合成反應(yīng)，將具有將麥芽糖變換為異麥芽糖的酶活性的WT型TG和結(jié)構(gòu)修飾TG(S495P)并用，進(jìn)行低聚糖合成。通過(guò)HPLC對(duì)生成的低聚糖進(jìn)行解析。應(yīng)予說(shuō)明，作為底物使用50%麥芽糖水溶液，在50°C反應(yīng)48小時(shí)。
[0389]對(duì)于S495P單獨(dú)的情形和混合WT型和S495P的情形(混合比例2:1、1:1或1:2)進(jìn)行低聚糖合成，通過(guò)HPLC對(duì)生成的低聚糖進(jìn)行解析。對(duì)于S495P單獨(dú)的情形，雖然生成作為三糖的潘糖，但是四糖以上的低聚`糖生成非常少。S卩，未發(fā)生四糖以上的反應(yīng)(圖24的S495P、圖25的S495P)。另一方面，將WT型與S495P并用的情形中，即使是以任意比例混合，三糖以上的低聚糖量與四糖以上的低聚糖量均出現(xiàn)增加(圖24的WT:S495=2:1、WT:S495=1:1、WT:S495=1:2)。特別需要注意的是，S495P單獨(dú)的情形時(shí)生成的低聚糖基本上都是潘糖，與此相對(duì)在WT型和S495P并用的情形中，發(fā)現(xiàn)潘糖和異麥芽三糖的產(chǎn)生(圖25，通過(guò)箭頭示出的峰)，進(jìn)而，也發(fā)現(xiàn)四糖以上的低聚糖的生成。如上所述，WT型與具有α 1，6位特異性轉(zhuǎn)移活性的結(jié)構(gòu)修飾TG的并用有效，由具有α 1，6位特異性轉(zhuǎn)移活性的結(jié)構(gòu)修飾TG單獨(dú)使用時(shí)未發(fā)生反應(yīng)的α 1，4鍵的糖類(lèi)也可以生成低聚糖。
[0390](2)結(jié)構(gòu)修飾TG在食品領(lǐng)域的應(yīng)用
[0391]對(duì)于具有α I, 6位特異性轉(zhuǎn)移活性的結(jié)構(gòu)修飾TG，使用人工消化模型系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)報(bào)告與上述C.的情形相同。
[0392]粥中僅添加淀粉酶時(shí)，生成的糖類(lèi)40?50%為麥芽糖。另外，生成三糖的麥芽三糖和四糖的麥芽四糖。可認(rèn)為它們都是al，4鍵的糖類(lèi)，所以具有al，6位特異性轉(zhuǎn)移活性的修飾型α-葡萄糖苷酶在單獨(dú)使用時(shí)不發(fā)生反應(yīng)。因此，與D的(I)同樣地，將WT型TG與結(jié)構(gòu)修飾TG(S495P)并用，嘗試低聚糖合成。
[0393]首先，對(duì)于在粥中添加淀粉酶和WT型的情形，30分鐘后反應(yīng)進(jìn)行，葡萄糖的生成量逐漸增加(圖26(a))。另外，反應(yīng)開(kāi)始60分鐘后生成異麥芽糖，三糖以上的低聚糖逐漸減少。另一方面，對(duì)于向粥中添加淀粉酶和S495P的情形，僅生成淀粉酶所致的糖類(lèi)，即使在反應(yīng)開(kāi)始120分鐘后，麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖基本保持原狀(圖26(b))。與此相對(duì)，將淀粉酶、WT型和S495P這3種酶并用的情形中(WT型與S495P的混合比例為1:2)，麥芽糖發(fā)生分解，糖轉(zhuǎn)移反應(yīng)進(jìn)行。反應(yīng)開(kāi)始60分鐘以后，與WT型單獨(dú)的情況相比，三糖以上的低聚糖增加(圖26(d))。將3種酶并用的情形中，發(fā)現(xiàn)麥芽糖的減少與三糖以上的低聚糖的比例增加(圖26 (c))，認(rèn)為進(jìn)行了低聚糖合成。如果觀察實(shí)際的HPLC圖案，則發(fā)現(xiàn)并用3種酶時(shí)，由淀粉酶生成的麥芽糖和麥芽三糖的峰減少，另一方面，發(fā)現(xiàn)了潘糖、四糖的低聚糖的峰(圖27右下圖，箭頭)。另外，與淀粉酶中僅并用WT型的情形(圖27左下圖)相t匕，可知三糖以上的低聚糖基本沒(méi)有減少，三種酶(淀粉酶、WT型和S495P)的并用對(duì)于低聚糖的生成是有效的。
[0394]如上所述，在生成低聚糖這點(diǎn)上，將WT型與具有α I, 6位特異性轉(zhuǎn)移活性的結(jié)構(gòu)修飾TG并用，顯示是非常有效果的。
[0395]產(chǎn)業(yè)上的可利用性
[0396]本發(fā)明的修飾型α-葡萄糖苷酶的糖轉(zhuǎn)移活性高。利用該特性，可期待用于低聚糖的制造(合成)。另外，本發(fā)明的設(shè)計(jì)方法，作為提高野生型酶等的糖轉(zhuǎn)移活性的手段是有用的，可用于各種α-葡萄糖苷酶的修飾。 [0397]本發(fā)明不受上述發(fā)明的實(shí)施方式以及實(shí)施例的說(shuō)明任何限制。在不脫離要求保護(hù)的范圍的記載、本領(lǐng)域技術(shù)術(shù)人員能容易想到的范圍內(nèi)進(jìn)行的各種變形方式也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本說(shuō)明書(shū)中給出的論文、公開(kāi)專(zhuān)利公報(bào)以及專(zhuān)利公報(bào)等的內(nèi)容，通過(guò)援引而引用其全部?jī)?nèi)容。
【權(quán)利要求】
1.一種修飾型a -葡萄糖苷酶，其特征在于，由a-葡萄糖苷酶的氨基酸序列中選自以下(I)?(14)中的一個(gè)或兩個(gè)以上的氨基酸被其它氨基酸取代而成的氨基酸序列構(gòu)成: (1)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第385位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔? (2)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第491位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔? (3)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第535位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔? (4)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第450位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔? (5)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第534位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔? (6)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第537位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔? (7)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第538位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔? (8)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第554位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔? (9)與序列號(hào)I所示的 氨基酸序列的第556位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔? (10)與序列號(hào)2所示的氨基酸序列的第579位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔? (11)與序列號(hào)2所示的氨基酸序列的第585位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔? (12)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第630位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔? (13)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第683位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔? (14)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第689位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被帷?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的修飾型a-葡萄糖苷酶，其中，a-葡萄糖苷酶為人麥芽糖酶-糖化酶(Human Maltase-glucoamylase)、黑曲霉的α -葡萄糖苷酶(Aspergillus niger alpha-glucosidase)、人中性 ct-葡萄糖苷酶 C (HumanNeutral alpha-glucosidase C)、鼠溶酶體 α -葡萄糖苷酶(Mouse Lysosomalalpha-glucosidase)、酵母的α -葡萄糖苷酶(Yeast GLU2A)、構(gòu)巢曲霉的α-葡萄糖苷酶 A (Aspergillus nidulans Alpha-glucosidase AgdA)、構(gòu)巢曲霉的 α-葡萄糖苷酶 B (Aspergillus nidulans Alpha-glucosidase AgdB)、爪睡毛霉的 ct -葡萄糖苷酶(Mucor javanicus alpha-glucosidase)、米曲霉的 α-葡萄糖苷酶(Aspergillusoryzae alpha-glucosidase)、蔥狀被抱霉的 α -葡萄糖苷酶(Mortierella alliaceaalpha-glucosidase)、粟酒裂殖酵母菌的 ct -葡萄糖昔酶(Schizosaccharomycespombe alpha-glucosidase)、德巴利酵母的 ct -葡萄糖昔酶(Debaryomycesoccidentalis alpha-glucosidase)、大麥的 α -葡萄糖苷酶(Hordeum vulgare subsp.vu lgare alpha-glucosidase)、擬南芥的 ct -葡萄糖苷酶(Arabidopsis thalianaalpha-glucosidase)、疲菜的 ct -葡萄糖昔酶(Spinacia oleracea alpha-glucosidase)、甜菜的ct-葡萄糖苷酶(Beta vulgaris alpha-glucosidase)或馬鈴薯的α_葡萄糖苷酶(Solanum tuberosum alpha-glucosidase)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的修飾型α-葡萄糖苷酶，其中，α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列為序列號(hào)2的氨基酸序列， (I)的氨基酸為該氨基酸序列第343位氨基酸；(2)的氨基酸為該氨基酸序列第452位氨基酸；(3)的氨基酸為該氨基酸序列第496位氨基酸；(4)的氨基酸為該氨基酸序列第410位氨基酸；(5)的氨基酸為該氨基酸序列第495位氨基酸；(6)的氨基酸為該氨基酸序列第498位氨基酸；(7)的氨基酸為該氨基酸序列第499位氨基酸；(8)的氨基酸為該氨基酸序列第531位氨基酸；(9)的氨基酸為該氨基酸序列第533位氨基酸；(12)的氨基酸為該氨基酸序列第662位氨基酸；(13)的氨基酸為該氨基酸序列第715位氨基酸；(14)的氨基酸為該氨基酸序列第721位氨基酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的修飾型α-葡萄糖苷酶，其中，被取代的氨基酸是(I)的氨基酸，取代后的氨基酸是半胱氨酸、天冬氨酸、蛋氨酸、組氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸，甘氨酸、蘇氨酸、谷氨酸、纈氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺或異亮氨酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的修飾型α-葡萄糖苷酶，其中，被取代的氨基酸是(2)的氨基酸，取代后的氨基酸是甘氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的修飾型α-葡萄糖苷酶，其中，被取代的氨基酸是(3)的氨基酸，取代后的氨基酸是纈氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的修飾型α-葡萄糖苷酶，其中，被取代的氨基酸是(I)的氨基酸和(2)的氨基酸，取代后的氨基酸是對(duì)于(I)的氨基酸而言為天冬氨酸，對(duì)于(2)的氨基酸而言為丙氨酸或甘氨酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的修飾型α-葡萄糖苷酶，其中，被取代的氨基酸是(I)的氨基酸和(3)的氨基酸，取代后的氨基酸是對(duì)于(I)的氨基酸而言為天冬氨酸或蛋氨酸，對(duì)于(3)的氨基酸而言為異亮氨酸、精氨酸、半胱氨酸或蘇氨酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的修飾型α-葡萄糖苷酶，其中，被取代的氨基酸是(5)的氨基酸，取代后的氨基酸是甘氨酸、脯氨酸或纈氨酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的修飾型α-葡萄糖苷酶，其中，被取代的氨基酸是￠)的氨基酸，取代后的氨基酸是亮.氨酸或絲氨酸。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的修飾型α-葡萄糖苷酶，其中，由序列號(hào)18?24以及77?78中的任意一個(gè)氨基酸序列構(gòu)成。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的修飾型α-葡萄糖苷酶，其中，由序列號(hào)74?76中的任意一個(gè)氨基酸序列構(gòu)成。
13.—種基因，其編碼權(quán)利要求1?12中任一項(xiàng)所述的修飾型α -葡萄糖苷酶。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的基因,含有序列號(hào)43?67以及79?83中的任意一個(gè)堿基序列。
15.一種重組DNA，含有權(quán)利要求13或14所述的基因。
16.—種微生物,具有權(quán)利要求15所述的重組DNA。
17.—種酶制劑，含有權(quán)利要求1?12中任一項(xiàng)所述的修飾型α -葡萄糖苷酶。
18.一種低聚糖的制造方法，其特征在于，使權(quán)利要求1?8、10和11中的任一項(xiàng)所述的修飾型α-葡萄糖苷酶與具有α-1，4鍵的二糖以上的低聚糖或多糖進(jìn)行作用。
19.一種低聚糖的制造方法，其特征在于，使權(quán)利要求9或12所述的修飾型α-葡萄糖苷酶與具有α-1，6鍵的二糖以上的低聚糖或多糖進(jìn)行作用。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的低聚糖的制造方法，其特征在于，與野生型的酶并用。
21.一種低聚糖的制造方法，其特征在于，使權(quán)利要求9或12所述的修飾型α-葡萄糖苷酶和野生型的酶、與具有α -1, 4鍵的二糖以上的低聚糖或多糖進(jìn)行作用。
22.—種醫(yī)藥組合物、準(zhǔn)醫(yī)藥組合物、化妝品組合物、食品組合物或餌料組合物，含有權(quán)利要求I?12中任一項(xiàng)所述的修飾型α -葡萄糖苷酶或權(quán)利要求17所述的酶制劑。
23.—種修飾型α-葡萄糖苷酶的設(shè)計(jì)方法，其包含以下步驟(i )和(ii )，(i)在作為突變對(duì)象酶的α-葡萄糖苷酶的氨基酸序列中，確定選自以下(I)?(14)中的一個(gè)或兩個(gè)以上氨基酸的步驟: (1)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第385位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔? (2)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第491位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔? (3)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第535位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔? (4)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第450位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔? (5)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第534位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔? (6)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第537位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔? (7)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第538位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔? (8)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第554位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔? (9)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第556位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔? (10)與序列號(hào)2所示的氨基酸序列的第579位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔? (11)與序列號(hào)2所示的氨基酸序列的第585位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔? (12)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第630位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔? (13)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第683位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔? (14)與序列號(hào)I所示的氨基酸序列的第689位氨基酸相當(dāng)?shù)陌被幔? (?)以突變對(duì)象酶的氨基酸序列為基礎(chǔ)，構(gòu)建將步驟(i)中確定的氨基酸序列取代為其它氨基酸的氨基酸序列的步驟。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的設(shè)計(jì)方法，其中，α-葡萄糖苷酶為人麥芽糖酶-糖化酶(Human Maltase-glucoamylase)、黑曲霉的 α-葡萄糖苷酶(Aspergillus nigeralpha-glucosidase)、人中性 α -葡萄糖苷酶C(Human Neutral alpha-glucosidase C)、鼠溶酶體α -葡萄糖昔酶(Mouse Lysosomal alpha-glucosidase)、酵母的ct -葡萄糖昔酶(Yeast GLU2A)、構(gòu)巢曲霉的 α -葡萄糖苷酶A (Aspergillus nidulans Alpha-glucosidaseAgdA)、構(gòu)巢曲霉的 ct -葡萄糖苷酶 B (Aspergillus nidulans Alpha-glucosidaseAgdB)、爪睡毛霉的 α-葡萄糖苷酶(Mucor javanicus alpha-glucosidase)、米曲霉的α -葡萄糖苷酶(Aspergillus oryzae alpha-glucosidase)、蔥狀被孢霉的α-葡萄糖苷酶(Mortierella alliacea alpha-glucosidase)、粟酒裂殖酵母的α-葡萄糖苷酶(Schizosaccharomyces pombe alpha-glucosidase)、德巴利酵母的 ct-葡萄糖昔酶(Debaryomyces occidentalis alpha-glucosidase)、大麥的 α -葡萄糖苷酶(Hordeumvu lgare subsp.vulgare alpha-glucosidase)、擬南芥的 α -葡萄糖苷酶(Arabidopsisthaliana alpha-glucosidase)、菠菜的 α -葡萄糖苷酶(Spinacia oleraceaalpha-glucosidase)、甜菜的 α -葡萄糖苷酶(Beta vulgaris alpha-glucosidase)或馬鈴薯的 α -葡萄糖苷酶(Solanum tuberosum alpha-glucosidase)。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的設(shè)計(jì)方法，其中，α-葡萄糖苷酶含有序列號(hào)I?17中任一個(gè)氨基酸序列。
26.根據(jù)權(quán)利要求23所述的設(shè)計(jì)方法，其中，α-葡萄糖苷酶由序列號(hào)2的氨基酸序列構(gòu)成，步驟(i )中被取代的氨基酸為選自(I)?(14)中的一個(gè)氨基酸、選自(I)?(14)中的兩個(gè)氨基酸或選自(I)?(14)中的三個(gè)氨基酸。
27.一種修飾型α-葡萄糖苷酶的制備方法，含有以下步驟(I )?(III):(I )準(zhǔn)備核酸的步驟，該核酸編碼序列號(hào)18?42和74?78中的任意一個(gè)氨基酸序列或通過(guò)權(quán)利要求23?26中任一項(xiàng)所述的設(shè)計(jì)方法構(gòu)建的氨基酸序列； (II )使所述核酸表達(dá)的步驟；以及 (III)回收表達(dá)產(chǎn)物的步驟。
28.一種α-葡萄糖苷酶，`其具有α_1，4位特異性或α _1，6位特異性轉(zhuǎn)移活性。
【文檔編號(hào)】C12P19/16GK103443273SQ201280013352
【公開(kāi)日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2012年3月5日 優(yōu)先權(quán)日:2011年3月16日
【發(fā)明者】石原聰 申請(qǐng)人:天野酶株式會(huì)社