專利名稱：具有電流和阻抗檢測功能的活體單細胞電穿孔裝置的制作方法
技術領域：
本實用新型涉及一種活體單細胞電穿孔裝置，尤其涉及一種具有電流和阻抗檢測功能的活體單細胞電穿孔裝置。
背景技術：
活體電穿孔利用脈沖電場作用于細胞膜表面，產生疏水或親水的微小通道，這種通道能維持很短時間，生物大分子可通過這種微小的通道進入細胞。由于活體電穿孔的轉染效率高、外源基因大小沒有限制、操作簡單快速等優(yōu)點，目前國內外活體電穿孔法介導外源基因轉染的應用越來越多。一般商業(yè)化的活體電穿孔儀會在局部組織大量轉染細胞，當需要轉染極少數(shù)幾個細胞，甚至是特定靶向轉染單細胞時，這種方法就遇到了困難，并且無法在空間上精確定位到單個細胞水平。近年來出現(xiàn)了為數(shù)不多的方法試圖克服這種局限。Cline H.T.研究組(具體請參見以下文獻:Haas, K., Sin, ff.C., Javaherian, A., Li, Z., and Cline, Η.T.(2001).Single-cell electroporation for gene transfer in viv0.Neuron 29，583-591.)首次使用結合微電極、脈沖發(fā)生器和示波器實現(xiàn)活體單細胞電穿孔標記。通常，電極接近細胞膜表面阻抗會升高，此時電脈沖可以有效地在細胞膜表面穿孔，而遠離細胞膜表面時電穿孔的效率會急劇下降，由于該方法不能檢測電極接近細胞膜的程度，也就不能可靠地轉染活體細胞。此外，該方法需要多臺儀器發(fā)配合使用，造成功能冗余、操作復雜、工作效率低，而且復雜的系統(tǒng)組成也會降低系統(tǒng)工作的穩(wěn)定性。

實用新型內容本實用新型要解決的技術問題是提供一種活體單細胞電穿孔裝置，能夠實時獲取電極阻抗和電流強度信息，有利于提高轉染效率，簡化系統(tǒng)組成和操作。為解決上述技術問題，本實用新型提供了一種具有電流和阻抗檢測功能的活體單細胞電穿孔裝置，包括:單片機；按鍵，與所述單片機的第一 1/0端相連；數(shù)模轉換器，所述數(shù)模轉換器的輸入端與所述單片機的第二 1/0端相連；脈沖發(fā)生模塊，所述脈沖發(fā)生模塊的輸入端與所述數(shù)模轉換器的輸出端相連；選擇開關，所述選擇開關的兩個輸入端分別與所述數(shù)模轉換器和脈沖發(fā)生模塊的輸出端相連，所述選擇開關的選擇切換由所述單片機控制；電流檢測器，其輸入端與所述選擇開關的輸出端相連；輸出電極，與所述電流檢測器的刺激輸出端相連；模數(shù)轉換器，所述模數(shù)轉換器的輸入端與所述電流檢測器的信號出端相連，所述模數(shù)轉換器的輸出端與所述單片機的第三I/o端相連。根據(jù)本實用新型的一個實施例，所述活體單細胞電穿孔裝置還包括:顯示屏，與所述單片機的第四I/o端相連。根據(jù)本實用新型的一個實施例，所述活體單細胞電穿孔裝置還包括:觸發(fā)開關，與所述單片機的第五I/o端相連，用于控制所述單片機對所述選擇開關進行選擇切換。根據(jù)本實用新型的一個實施例，所述活體單細胞電穿孔裝置還包括:玻璃微電極，其內設置有與所述輸出電極相連的金屬絲電極，所述玻璃微電極內還容置有需要轉染的極性分子，所述玻璃電極的尖端與實驗組織接觸，所述實驗組織接地。根據(jù)本實用新型的一個實施例，所述玻璃微電極的尖端直徑為0.5 μ πΓ μ m。根據(jù)本實用新型的一個實施例，所述玻璃微電極安裝在微操作手上。根據(jù)本實用新型的一個實施例，所述模數(shù)轉換器的輸入端經(jīng)由運算放大器與所述電流檢測器的信號 輸出端相連。根據(jù)本實用新型的一個實施例，所述活體單細胞電穿孔裝置還包括:電源，為所述單片機、選擇開關、數(shù)模轉換器、模數(shù)轉換器、脈沖發(fā)生模塊供電。與現(xiàn)有技術相比，本實用新型具有以下優(yōu)點:本實用新型實施例的活體單細胞電穿孔裝置能實時獲取電極阻抗和電流強度信息，有利于提高轉染效率，簡化系統(tǒng)組成和操作。而且克服了現(xiàn)有技術中單一的脈沖發(fā)生器僅能產生脈沖、不能測量微電流和阻抗、依賴于其他專業(yè)儀器配合，從而造成功能冗余、成本昂貴和操作復雜等缺陷。

圖1是本實用新型實施例的活體單細胞電穿孔裝置的結構框圖。
具體實施方式
下面結合具體實施例和附圖對本實用新型作進一步說明，但不應以此限制本實用新型的保護范圍。參考圖1，本實施例的活體單細胞電穿孔裝置包括:按鍵101、觸發(fā)開關102、單片機103、顯示屏104、數(shù)模轉換器(DAC)105、脈沖發(fā)生模塊106、電源107、選擇開關108、電流檢測器109、運算放大器110、模數(shù)轉換器(ADC) 111、輸出電極112、玻璃微電極113。其中，按鍵101與單片機103的第一 I/O端相連，操作者可以通過按鍵101進行操作參數(shù)的設置，例如可以設置脈沖次數(shù)、脈沖寬度以及數(shù)模轉換器105輸出的電壓值。顯示屏104與單片機103的第四I/O端相連，其上可以顯示單片機103輸出的各種計算結果，例如電極的阻抗、檢測到的電流值等。按鍵101和顯示屏104共同形成了該電穿孔裝置的人機交互界面。電源模塊107可以采用220V、110V等交流電來為其他模塊供電，例如可以為單片機103、顯示屏104、數(shù)模轉換器105、選擇開關108、模數(shù)轉換器111、運算放大器110提供±5V的電源電壓,另外還可以為脈沖發(fā)生模塊106提供O ±80V的直流電壓。數(shù)模轉換器105的輸入端與單片機103的第二 I/O端相連，數(shù)模轉換器105受單片機103的第二 I/O端輸出的控制信號控制，從而實現(xiàn)數(shù)模轉換。數(shù)模轉換器105輸出的電壓信號能夠控制脈沖發(fā)生模塊106產生不同的脈沖信號。脈沖發(fā)生模塊106的輸入端與數(shù)模轉換器105的輸出端相連,在數(shù)模轉換器105輸出端輸出的不同電壓信號控制下，脈沖發(fā)生模塊106的輸出端產生不同的脈沖信號。選擇開關108的兩個輸入端分別與數(shù)模轉換器105和脈沖發(fā)生模塊106的輸出端相連，選擇開關108的選擇切換由單片機103控制。換言之，單片機103可以控制選擇開關108將數(shù)模轉換器105輸出的信號傳輸至電流檢測器109,也可以切換為將脈沖發(fā)生模塊106輸出的信號傳輸至電流檢測器109。也就是說，選擇開關108受單片機103的控制，在數(shù)模轉換器105輸出的模擬電壓和脈沖發(fā)生模塊106輸出的電壓之間選擇接入電流檢測器109的回路。觸發(fā)開關102與單片機103的第五I/O端相連，用于控制單片機103對選擇開關108進行選擇切換。例如，觸發(fā)開關102可以是一個手動或者腳踩的開關，用于觸發(fā)選擇開關108輸出脈沖發(fā)生模塊106產生的脈沖序列，或者輸出數(shù)模轉換器105輸出的模擬電壓。電流檢測器109的輸入端與選擇開關108的輸出端相連，用于檢測流經(jīng)該電流檢測器109的電流信號的電流值 。輸出電極112與電流檢測器109的刺激輸出端相連，將流經(jīng)電流檢測器109的電
流信號傳輸出。模數(shù)轉換器111的輸入端經(jīng)由運算放大器110與電流檢測器109的信號輸出端相連。其中運算放大器110對電流檢測器109輸出的檢測信號進行放大，模數(shù)轉換器111將該檢測信號轉換為數(shù)字信號并傳輸至單片機103的第三I/O端。玻璃微電極113可以安裝在微操作手上，玻璃微電極113內裝載有極性分子，例如需要轉染的DNA、RNA、嗎啉寡聚核苷酸(Morpholinooligonucleotides)或染料等極性分子。玻璃微電極113內設置有金屬絲電極，該金屬絲電極與輸出電極112相連。優(yōu)選地，該玻璃微電極113的尖端直徑為0.5 μ m^l μ m,玻璃微電極113的尖端與實驗組織114 (例如動物組織)相接觸,該動物組織接地,即動物組織114與整個電穿孔裝置共地。在檢測電極阻抗時，選擇開關108的輸出端切換至于數(shù)模轉換器105相連，數(shù)模轉換器105輸出的電壓經(jīng)過電流檢測器109、玻璃微電極13、動物組織114以及地電極形成回路，電流檢測器109可以檢測出在該電壓條件下的電流值，該電流值經(jīng)過運算放大器110放大后，由模數(shù)轉換器111將模擬信號轉換為數(shù)字信號，進而輸入至單片機103。單片機103根據(jù)數(shù)模轉換器105輸出的模擬電壓以及電流檢測器109檢測到的電流值可以計算出電阻值，即電極的阻抗，并顯示在顯示屏104上。在測量電穿孔電流時，選擇開關108的輸出端切換至于脈沖發(fā)生模塊106的輸出端相連。脈沖發(fā)生模塊106輸出的脈沖信號經(jīng)過電流檢測器109、輸出電極112、玻璃微電極113、動物組織114以及地電極形成回路，電流檢測器109檢測到的電流值經(jīng)過運算放大器110放大，由模數(shù)轉換器111進行模數(shù)轉換后傳輸至單片機103，從而獲得脈沖刺激時的電流值。作為一個非限制性的例子，本實施例的電穿孔裝置能夠根據(jù)操作者設定的小于5V的電壓輸出來檢測回路中的電流，從而計算得到阻抗變化；由阻抗的變化可以判斷出電極接近細胞膜的程度。此外，該裝置可以根據(jù)實際需要的參數(shù)來設定脈沖序列、脈沖寬度以及電壓，最大電壓范圍為±80V，并檢測出在相應脈沖信號刺激下的脈沖電流。下面參考兩個實例來對圖1所示的電穿孔裝置的使用方法以及工作過程作更詳細的描述。[0040]實例I單細胞活體標記非洲爪蟾蝌抖神經(jīng)元非洲爪蟾蝌蚪經(jīng)麻醉后，用含鹽溶液的低熔點瓊脂糖固定。低熔點瓊脂糖經(jīng)導線接地。輸出電極112與玻璃微電極113內的金屬絲電極相連，玻璃微電極113內裝有需要轉染的DNA。玻璃微電極113尖端直徑為0.5 μ m I μ m，玻璃微電極113安裝在微操手上。移動玻璃微電極113穿刺進入動物組織114內的特定位置，此時數(shù)模轉換器105輸出的IOOmV電壓接入電流檢測回路，電流檢測器109檢測到的電流強度經(jīng)單片機103計算后，單片機103將電流強度和阻抗值顯示在顯示屏上104上。移動玻璃微電極113，阻抗提高時，說明玻璃微電極113的尖端接近細胞膜。本實例中，脈沖發(fā)生模塊106產生的脈沖信號的脈沖次數(shù)可以為100次，脈沖寬度可以為0.5ms，脈沖頻率可以為100HZ，設置脈沖的電壓為40V，設置阻抗檢測用的電壓為100mV。玻璃微電極113的尖端移動過程中檢測電極阻抗的變化。通常玻璃微電極113沒有接近細胞膜時，阻抗為10 30ΜΩ ;而接近細胞膜時，阻抗升高。由此可以有效地轉染細胞。當阻抗升高1.1 1.3倍左右時，按動觸發(fā)開關102，切換選擇開關108，此時脈沖發(fā)生模塊106輸出的電壓接入回路，經(jīng)電流檢測器109作用于動物組織114的細胞，電流檢測器109檢測到的電流經(jīng)過運算放大器110和模數(shù)轉換器111傳輸至單片機103，最終單片機103將電流強度顯示在顯示屏4上。單細胞電穿孔的電流一般在μ A和亞μ A水平，太高的電流會導致局部組織的損傷和炎癥。轉染完成，把動物放回培養(yǎng)溶液中清醒和恢復。24 48h后，單細胞電穿孔轉染的熒光蛋白表達。實例2活體電穿孔組織轉染非洲爪蟾放射狀膠質細胞除了單細胞電穿孔轉染活體細胞，圖1所示的裝置還可用于活體動物組織的多細胞組織轉染。非洲爪蟾蝌蚪經(jīng)麻醉后，用含鹽溶液的低熔點瓊脂糖固定其位置。低熔點瓊脂糖經(jīng)導線接地。輸出電極112與玻璃微電極113內的金屬絲電極相連，放置在需要轉染組織上方的動物體表。在非洲蝌蚪腦室內預先注入需要轉染的DNA。接通電源后，通過按鍵101以及顯示屏104設置參數(shù)，脈沖次數(shù)可以為10次，脈沖寬度可以為5ms，脈沖頻率可以為1HZ，設置脈沖的電壓為18V，設置阻抗檢測用的電壓為10mV。測量計接入阻抗能獲得電導的大小，由此可以估計設置脈沖的電壓強度，太高的電壓會增大電流強度，從而導致動物組織的損傷；而過小的脈沖電流會導致效率低下，此外其效率還跟脈沖的次數(shù)，脈沖的寬度等參數(shù)有關。按動觸發(fā)開關102，給局部動物組織114脈沖刺激，從顯示屏104中可以讀取到脈沖產生的電流強度。轉染完成后，把非洲爪蟾蝌蚪放回培養(yǎng)溶液中清醒和恢復。24 48h后，組織電穿孔轉染的熒光蛋白表達。本實用新型雖然以較佳實施例公開如上，但其并不是用來限定本實用新型，任何本領域技術人員在不脫離本實用新型的精神和范圍內，都可以做出可能的變動和修改，因此本實用新型的保護范圍應當以本實用新型權利要求所界定的范圍為準。
權利要求1.一種具有電流和阻抗檢測功能的活體單細胞電穿孔裝置，其特征在于，包括: 單片機； 按鍵，與所述單片機的第一 I/o端相連； 數(shù)模轉換器，所述數(shù)模轉換器的輸入端與所述單片機的第二 I/o端相連； 脈沖發(fā)生模塊，所述脈沖發(fā)生模塊的輸入端與所述數(shù)模轉換器的輸出端相連； 選擇開關，所述選擇開關的兩個輸入端分別與所述數(shù)模轉換器和脈沖發(fā)生模塊的輸出端相連，所述選擇開關的選擇切換由所述單片機控制； 電流檢測器，所述電流檢測器的輸入端與所述選擇開關的輸出端相連； 輸出電極，與所述電流檢測器的刺激輸出端相連； 模數(shù)轉換器，所述模數(shù)轉換器的輸入端與所述電流檢測器的信號輸出端相連，所述模數(shù)轉換器的輸出端與所述單片機的第三I/o端相連。
2.根據(jù)權利要求1所述的活體單細胞電穿孔裝置，其特征在于，還包括: 顯示屏，與所述單片機的第四I/o端相連。
3.根據(jù)權利要求1所述的活體單細胞電穿孔裝置，其特征在于，還包括: 觸發(fā)開關，與所述單片機的第五I/o端相連，用于控制所述單片機對所述選擇開關進行選擇切換。
4.根據(jù)權利要求1所述的活體單細胞電穿孔裝置，其特征在于，還包括: 玻璃微電極，其內設置有與所述輸出電極相連的金屬絲電極，所述玻璃微電極內還容置有需要轉染的極性分子，所述玻璃電極的尖端與實驗組織接觸，所述實驗組織接地。
5.根據(jù)權利要求4所述的活體單細胞電穿孔裝置，其特征在于，所述玻璃微電極的尖端直徑為0.5 μ πΓ μ m。
6.根據(jù)權利要求4所述的活體單細胞電穿孔裝置，其特征在于，所述玻璃微電極安裝在微操作手上。
7.根據(jù)權利要求1所述的活體單細胞電穿孔裝置，其特征在于，所述模數(shù)轉換器的輸入端經(jīng)由運算放大器與所述電流檢測器的信號出端相連。
8.根據(jù)權利要求1至7中任一項所述的活體單細胞電穿孔裝置，其特征在于，還包括: 電源，為所述單片機、選擇開關、數(shù)模轉換器、模數(shù)轉換器、脈沖發(fā)生模塊供電。
專利摘要本實用新型提供了一種具有電流和阻抗檢測功能的活體單細胞電穿孔裝置，包括單片機；按鍵，與所述單片機的第一I/O端相連；數(shù)模轉換器，所述數(shù)模轉換器的輸入端與所述單片機的第二I/O端相連；脈沖發(fā)生模塊，輸入端與所述數(shù)模轉換器的輸出端相連；選擇開關，兩個輸入端分別與所述數(shù)模轉換器和脈沖發(fā)生模塊的輸出端相連，其選擇切換由所述單片機控制；電流檢測器，其輸入端與所述選擇開關的輸出端相連；輸出電極，與所述電流檢測器的刺激輸出端相連；模數(shù)轉換器，輸入端與所述電流檢測器的信號出端相連，輸出端與所述單片機的第三I/O端相連。本實用新型能夠在單細胞水平上活體電穿孔轉染細胞，有效提高了活體單細胞電穿孔的效率。
文檔編號C12M1/34GK202945245SQ201220612770

公開日2013年5月22日 申請日期2012年11月19日 優(yōu)先權日2012年11月19日
發(fā)明者黃玉斌, 胡兵 申請人:中國科學技術大學