帕尼單抗、西妥昔單抗靶向用藥基因的檢測方法及其引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學基因【技術領域】和醫(yī)學領域，具體公開了用于檢測帕尼單抗和西妥昔單抗靶向用藥相關基因突變的方法及其引物。本發(fā)明對KRAS和BRAF這兩個基因的突變位點相關核酸序列進行分析，設計相應的引物，對樣本基因組DNA特定位點經過多重PCR擴增后，最后以Ion?Torrent半導體芯片測序技術進行檢測。本發(fā)明的檢測方法具有通量大，特異性及靈敏度高，結果穩(wěn)定，重復性好，檢測速度快的優(yōu)點。為帕尼單抗和西妥昔單抗靶向用藥的檢測、測試、分析和評估提供了一條快速、可靠、準確的新途徑，從而為篩選敏感個體的個性化用藥提供理論基礎。
【專利說明】帕尼單抗、西妥昔單抗靶向用藥基因的檢測方法及其引物
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學基因【技術領域】和醫(yī)學領域，涉及用分子生物學方法對靶向用藥基因突變位點檢測的引物，特別涉及用1n Torrent半導體芯片測序技術對帕尼單抗、西妥昔單抗靶向用藥基因突變進行定性、定量檢測的相關引物及其試劑盒。
【背景技術】
[0002]結直腸癌是人類最常見的消化道惡性腫瘤之一，目前世界范圍內其發(fā)病率占所有惡性腫瘤第3位，在中國結直腸癌的發(fā)病率和死亡率也呈逐年提高，2011年我國的結直腸癌的發(fā)病率也位居全部惡性腫瘤的第3位。約半數的結直腸癌患者可以通過手術治愈，但大部分患者會發(fā)生轉移或復發(fā)，并最終導致死亡。
[0003]近年來，隨著腫瘤分子祀向治療的興起，帕尼單抗(Panitumumab,商品名:維克替比)和西妥昔單抗(Cetuximab，商品名:愛必妥)這兩種針對表皮生長因子受體(epidermal growthfactor receptor, EGFR)的單克隆抗體類藥物在結直腸癌的治療中顯示了很好的療效。
[0004]腫瘤分子靶向用藥是以腫瘤細胞中所具有的特異性分子作為靶點，利用分子靶向藥物特異性阻斷該靶點的生物學功能，從而從分子水平逆轉腫瘤細胞的惡性生物學行為，達到抑制腫瘤的目的。
[0005]表皮生長因子受體是一種跨膜受體，本身具有酪氨酶激酶活性，配體與受體細胞外區(qū)結合后通過誘導兩個鄰近受體結合形成受體二聚體而激活受體，從而激活胞內酪氨酸結構域，引發(fā)激酶自磷酸化和下游分子的磷酸化，激活包括增殖和存活在內的多種細胞功倉泛。
[0006]帕尼單抗和西妥昔單抗是一類針對EGFR的單克隆抗體，能阻止EGFR與其天然配體的結合，抑制腫瘤細胞增生，誘導細胞凋亡，增強細胞毒藥物的抗癌能力。
[0007] KRAS基因是EGFR傳導通路中一個重要的下游信號分子，該基因突變或過度表達后成為致癌基因。KRAS基因突變主要集中在第2號外顯子的第12-13位密碼子上、也有密碼子61位的突變。KRAS基因的突變使RAS蛋白一直處于激活狀態(tài)，不受上游EGFR信號分子的影響，使信號傳遞通道一直處于持續(xù)激活狀態(tài)，刺激細胞不斷的生長或分化。即使使用了 EGFR佶抗劑(如帕尼單抗和西妥昔單抗等)阻斷了上游信號傳導，但KRAS促進腫瘤增殖的作用不受影響，即EGFR佶抗劑對KRAS基因突變的結直腸癌不能發(fā)揮抗腫瘤作用。
[0008]BRAF基因的突變是帕尼單抗和西妥昔單抗的另一個療效預測因子。BRAF是EGFR信號轉導通路中位于KRAS下游的一個重要的絲氨酸激酶。BRAF V600E基因突變是第十五號外顯子的1799位核苷酸由胸腺嘧啶T轉換為腺嘌呤A，導致編碼氨基酸序列第600位的纈氨酸突變?yōu)楣劝彼?，該突變導致EFGR激活的MAPK信號途徑的組成型活化(持續(xù)活化狀態(tài))而使帕尼單抗和西妥昔單抗不能發(fā)揮抗腫瘤作用。結直腸癌患者BRAF基因突變的發(fā)生率很低，且BRAF基因突變只發(fā)生于KRAS基因野生型患者，在KRAS基因突變型患者中未曾檢測到BRAF基因的突變。[0009]通過檢測KRAS和BRAF這兩個基因的突變堿基，可以判斷結直腸癌患者個體對帕尼單抗和西妥昔單抗的敏感性，篩選靶向治療的最適合人群，從而避免了因為不合理用藥而引起不必要的不良反應和經濟損失。
[0010]目前，已報道的用于帕尼單抗和西妥昔單抗靶向用藥相關基因突變的方法主要包括傳統的如PCR產物直接測序法、高分辨率溶解曲線法(HRM)、單鏈構象多態(tài)性分析方法(SSCP)、限制性片段長度多態(tài)性方法(RFLP)、焦磷酸測序方法、變性高效液相色譜法等，每種方法都各有優(yōu)缺點，在應用上受到不同的限制。
[0011]1n Torrent半導體芯片測序技術是新一代的測序技術，它的核心技術是使用半導體技術在化學和數字信息之間建立直接的聯系。在半導體芯片的微孔中的微球上固定DNA鏈，隨后依次摻入單核苷酸dATP、dCTP、dGTP、dTTP。隨著每個堿基的摻入，釋放出H+,H+在它們穿過每個孔底部時能被檢測到，通過對H+的檢測，實時判讀堿基。由于其化學測序原理自然簡單，無修飾的核苷酸、無激光器或光學檢測設備，因而可達到極小的測序偏差和出色的測序覆蓋均衡度，一臺儀器即可適合各種測序通量需求的科學研究，在較短的時間內獲得真實可靠的實驗結果。
[0012]1nTorrent半導體芯片測序技術與傳統測序技術比較，1nTorrent技術有以下優(yōu)勢:系統無激光光源，無光學系統，無照相系統；使用無標記的核苷酸及酶進行測序，本底干擾低；通過對H+的檢測，可以改善堿基判讀準確性；測序通量大、速度快，完成IG通量的測序檢測僅需2~3小時，是傳統測序方法通量的數千倍以上，同時彌補了已有二代高通量測序方法工作時間過長的缺陷；此外，1n Torrent技術大通量測序可以實現定量檢測，實現對腫瘤相關基因稀有突變的定量檢測，提高檢測的靈敏度，降低常規(guī)檢測方法的假陰性率。
[0013]目前尚無報道1nTorrent半導體芯片測序技術專門用于檢測帕尼單抗和西妥昔單抗靶向用藥相關基因突變的檢測。

【發(fā)明內容】

[0014]本發(fā)明的目的是為了彌補現有技術的不足，提供針對帕尼單抗和西妥昔單抗靶向用藥相關基因突變進行定性、定量檢測的方法及其引物。
[0015]為解決上述問題，本發(fā)明采取以下技術方案:
[0016]利用生物信息學知識和相關生物信息學軟件，對公開數據庫中所能檢索到的KRAS和BRAF兩種基因序列的突變位點，用Primer Premier 5.0軟件設計PCR引物。
[0017]用于檢測KRAS突變的引物，是由序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2組成的引物對。
[0018]上游引物:5，-gtcatcaagtataaacttgtggtagttggagc-3，SEQ ID No:I
[0019]下游引物:5，-tctattgttggatcatattcgt-3JSEQ ID No:2
[0020]用于檢測BRAF突變的引物，是由序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4組成的引物對。
[0021]上游引物:5，-gtcatcaagtacagtaataataggtgattttggtcc-3，SEQID No:3
[0022]下游引物:5，-gacgactgttcaaactgatggg-3JSEQ ID No -A
[0023]采用多重P CR的方法用上述引物組對待檢測樣本進行PCR擴增。[0024]將PCR擴增產物進行擴增子文庫的構建、ISP (1n Sphere? Particles，1n微球)模板的制備，在1n Torrent PGM系統上進行測序，并用軟件對相關測序序列進行分析。
[0025]本發(fā)明利用多重PCR方法結合1n Torrent半導體芯片測序技術同時對決定帕尼單抗和西妥昔單抗靶向用藥的兩種基因序列的突變位點——KRAS和BRAF基因突變位點進行并行檢測，其優(yōu)勢在于通量大，特異性及靈敏度高，結果穩(wěn)定，重復性好，檢測速度快的優(yōu)點。
【具體實施方式】
[0026]本發(fā)明結合具體實施例做進一步說明。應理解，這些實施例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。
[0027]實施例1、用于帕尼單抗和西妥昔單抗靶向用藥相關基因突變檢測引物的設計
[0028]利用生物信息學知識和相關生物信息學軟件，對公開數據庫中所能檢索到的KRAS和BRAF兩種基因序列的突變位點，用Primer Premier 5.0軟件設計PCR引物，引物序列為:檢測KRAS突變的引物:
[0029]上游引物:5，-gtcatcaagtataaacttgtggtagttggagc-3，SEQ ID No:I
[0030]下游引物:5，-tctattgttggatcatattcgt-3JSEQ ID No:2
[0031]檢測BRAF突變的引物:
[0032]上游引物:5，-gtcatcaagtacagtaataataggtgattttggtcc-3，SEQID No:3
[0033]下游引物:5，-gacgactgttcaaactgatggg-3JSEQ ID No -A
[0034]每個檢測位點的上游引物5’端均包含一段用于識別樣本信息的barcode序列5’ -gtcatcaagt-3>?
[0035]實施例2、帕尼單抗、西妥昔單抗靶向用藥相關基因突變的檢測
[0036]I)樣本基因組DNA的獲取
[0037]從腫瘤新鮮手術組織、穿刺組織或石蠟組織中抽提基因組DNA。腫瘤新鮮手術組織或穿刺組織用細胞裂解法提取DNA，將組織冷凍研磨后加入400 μ L細胞裂解緩沖液(10mmol/LTris-HCl, ρΗ8.0 ；0.1mol EDTA, ρΗ8.0 ；0.5% SDS)，混勻后置 50°C水浴中溫育30min;冷卻至室溫后加等體積的酚-氯仿-異戊醇(體積比25: 24: 1)，混勻，室溫靜置IOmin后5000 X g離心10min ;轉移上層水相至另一離心管中，重復酚_氯仿_異戊醇抽提I次；再轉移上層水相到另一離心管中，加1/10體積的3M NaAc (pH5.2)，混勻；加入2.5倍體積的95%冷乙醇，混勻，-20°C沉淀DNA30min ;10000Xg離心15min，棄上清；加lmL70%冷乙醇清洗沉淀，10000 X g離心15min，棄上清；37°C溫箱30min烘干；將DNA沉淀溶于50 μ LTE緩沖液中。石蠟包埋組織則用石蠟包埋組織DNA快速提取試劑盒(天根)抽提基因組DNA。抽提所得基因組DNA均用紫外分光光度計測OD值分析后置4°C暫存或_20°C長期保存。
[0038]2) PCR的擴增和測序
[0039]以步驟I)提取的樣本基因組DNA為模板，在實施例1所述引物的引導下，進行多重PCR擴增(950C 5min ；95°C 15s, 60°C lmin，共40個循環(huán))，獲得的擴增產物依次進行擴增子文庫的構建，ISP (1n Sphere? Particles, 1n微球)模板的制備，以及芯片上樣和在1n TorrentPGM系統上進行測序。[0040]3)分析并獲得結論
[0041]用IGV2.0軟件對測序結果進行分析，統計以下兩個基因檢測位點的讀序結果，包括每個基因檢測位點所測得的野生型測序數(W)和突變型測序數(M):
[0042]1.KRASmut
[0043]2.BRAFmutV600E
[0044]進行基因檢測位點的突變百分比判讀時，應滿足每個基因檢測位點的測序數應大于或等于1000,才能統計檢測到的相應基因位點突變比例；如該位點的測序數小于1000,則不判讀。
[0045]突變百分比(R)=(突變型的測序數(M)/總測序數(W+M)) X 100%
[0046]突變百分比分類評價:R >= 2%為陽性；R < 2%為陰性。
[0047]突變判讀規(guī)則見下表。
[0048]1.KRASmut
[0049]
【權利要求】
1.一種檢測帕尼單抗、西妥昔單抗靶向用藥基因突變的方法，其特征在于，具體步驟為: 利用生物信息學知識和相關生物信息學軟件，對公開數據庫中所能檢索到的KRAS和BRAF兩種基因序列的突變位點,用Primer Premier 5.0軟件設計PCR引物； 采用多重PCR的方法對待檢測樣本進行PCR擴增； 將PCR擴增產物進行擴增子文庫的構建，ISP (1n SphereTM Particles, 1n微球)模板的制備，在1n Torrent PGM系統上進行測序，并用軟件對相關測序序列進行分析。
2.如權利要求1所述的檢測帕尼單抗、西妥昔單抗靶向用藥基因突變的方法，其特征在于，所述的PCR引物包括針對兩種基因序列的突變位點的引物，其序列分別為:SEQ IDNo:1-SEQID No:4:
5，-gtcatcaagtataaacttgtggtagttggagc-3> SEQ ID No: I ； 5’ -tctattgttggatcatattcgt-3JSEQ ID No:2 ；
5， -gtcatcaagtacagtaataataggtgattttggtcc-3> SEQ ID No:3 ； 5，-gacgactgttcaaactgatggg-3JSEQ ID No:4。
3.用于如權利要求1-2所述檢測帕尼單抗、西妥昔單抗靶向用藥基因突變的PCR引物，其特征在于，包括針對兩種基因序列的突變位點的PCR引物，其序列分別為:SEQ ID No:1-SEQID No:4o
4.一種檢測帕尼單抗、西妥昔單抗靶向用藥基因突變的試劑盒，其特征在于包括如權利要求3所述的一組檢測帕尼單抗、西妥昔單抗靶向用藥基因突變PCR引物組。
【文檔編號】C12N15/11GK103898198SQ201210579146
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月27日 優(yōu)先權日:2012年12月27日
【發(fā)明者】謝毅 申請人:東龍脈(上海)健康管理服務有限公司