專利名稱：利用柚子皮粉生產(chǎn)低溫果膠酶及低溫澄清蘋果汁的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵領(lǐng)域及食品加工領(lǐng)域，具體地說是一種利用柚子皮粉生產(chǎn)低溫果膠酶及低溫澄清蘋果汁的方法。
背景技術(shù)：
果膠(Pectin)是植物組織中與纖維素、半纖維素、木質(zhì)素及蛋白質(zhì)等結(jié)合的不溶于水的一類物質(zhì)。果膠廣泛存在于高等植物，如水果、大豆以及玉米等谷物中。果膠酶(Pectinase)是指一組可以協(xié)同分解果膠的多酶復(fù)合物，通常包括果膠裂解酶(PL)、聚半乳糖醛酸酶(PG)和果膠酯酶(PE)等。果膠酶初見于1930年，用來制備酒水和果汁。一般果汁自然pH值為3. O 4. 0，所以食品工業(yè)用果膠酶多為酸性果膠酶。近年來，隨著我國國家政策和產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，果汁和果酒行業(yè)得到迅猛發(fā)展。農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè)“十一五”發(fā)展規(guī)劃以來，原料主產(chǎn)區(qū)建立濃縮加工廠，發(fā)展?jié)饪s果蔬汁及果蔬漿等半成品。果膠酶作為果蔬汁加工的重要酶制劑，市場需求量巨大。柚子多見于南方，現(xiàn)在中國的廣東、廣西、福建、江西、湖南、浙江、四川等地均有大量栽培。柚子皮果膠含量較高，但柚子經(jīng)食用后，柚皮常被廢棄而沒有得到有效利用。因而利用柚子皮生產(chǎn)果膠酶，成本低廉，具有潛在的開發(fā)價值。蘋果在世界各地均有栽培，是世界上主要的栽培果樹品種之一。蘋果是我國產(chǎn)量最大的水果，蘋果制汁也開始進(jìn)入蓬勃發(fā)展的階段。蘋果汁的澄清是決定產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵工序，目前使用的澄清方法主要有離心分離法、過濾法和加凈化劑的方法，但是除非在采用這些工藝步驟之前對果蔬原汁進(jìn)行了酶法處理或凈化處理，否則單獨使用這些工藝步驟往往是不可行或者不經(jīng)濟的。在低溫條件下對鮮榨蘋果汁進(jìn)行酶法澄清，不僅可以降低微生物在其中生長而造成污染的幾率，還可以節(jié)省能源以及保持蘋果汁的風(fēng)味和品質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用柚子皮粉生產(chǎn)低溫果膠酶及低溫澄清蘋果汁的方法。本發(fā)明利用柚子皮粉為碳源，利用棘孢青霉菌(Penicillium aculeatum)為菌種，發(fā)酵生產(chǎn)低溫果膠酶，發(fā)酵單位達(dá)16. 5U mL \具體方法如下
(1)在溫度為28 32°C、轉(zhuǎn)速為120 180rpm條件下，棘孢青霉菌在種子活化培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 60h ；
(2)將活化后的種子液以I.O 3. 0% (v/v)接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度為28 32°C、轉(zhuǎn)速為120 180rpm條件下，培養(yǎng)75 147h ；
(3)離心除去菌體后得到的上清液即為低溫果膠酶酶液；
所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為(w/v):柚子皮粉O. 5 2%、蛋白胨O. 5 2%，七水硫酸鎂O. 2%，磷酸二氫鉀O. 2%，無水氯化鈣O. 01%, pH4. O 6. O。所述的種子活化培養(yǎng)基為(w/v):葡萄糖O. 8%，果膠O. 2%，硫酸銨O. 5%，七水硫酸鎂O. 2%，磷酸二氫鉀O. 2%，無水氯化鈣O. 01%, pH自然。低溫澄清蘋果汁的方法具體步驟如下
(1)將蘋果去皮，削成I.5cm3的小塊，稱重；
(2)力口水(w/v=l/l),再力口O. 5% (w/v)的抗壞血酸；
(3)用榨汁機將蘋果塊榨成汁；
(4)用八層紗布將蘋果渣濾掉，得到鮮榨蘋果汁；
(5)每毫升鮮榨蘋果汁添加3 7U果膠酶酶液，在10 30°C下保溫反應(yīng)I 3h;
(6)反應(yīng)結(jié)束后即得到澄清蘋果汁。在10°C、20°C和30°C下保溫反應(yīng)2h后，澄清的蘋果汁透光率分別為43. 3%,53. 3%和 62. 4%ο本發(fā)明使用柚子皮為碳源誘導(dǎo)棘孢青霉菌產(chǎn)具有低溫活性的果膠酶，該酶在低溫環(huán)境下對鮮榨蘋果汁的澄清效果顯著。低溫條件下對鮮榨蘋果汁的澄清，不僅可以降低微生物在其中生長而造成污染的幾率，還可以節(jié)省能源以及保持蘋果汁的風(fēng)味和品質(zhì)。


圖I :本發(fā)明的低溫果膠酶的pH活性。圖2 :本發(fā)明的低溫果膠酶的pH穩(wěn)定性。圖3 :本發(fā)明的低溫果膠酶的溫度活性。圖4 :本發(fā)明的低溫條件下低溫果膠酶對鮮榨蘋果汁的澄清率。
具體實施例方式實施例I :
I、低溫果膠酶酶液的制備
(1)將-20°c保存的IO6個棘孢青霉菌孢子懸液接種于50mL種子活化培養(yǎng)基，在溫度30°C、轉(zhuǎn)速150rpm條件下，棘孢青霉菌在種子活化培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h ；
(2)將活化后的種子液4mL接種于200mL發(fā)酵培養(yǎng)基，在溫度30°C，轉(zhuǎn)速150rpm條件下，培養(yǎng)76h ；
(3)離心除去菌體后得到的上清液即為低溫果膠酶酶液。所述的種子活化培養(yǎng)基(w/v):葡萄糖O. 8%，果膠O. 2%，硫酸銨O. 5%，七水硫酸鎂O. 2%，磷酸二氫鉀O. 2%，無水氯化鈣O. 01%, pH自然。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基(w/v):柚子皮粉I. 0%，蛋白胨O. 5%，七水硫酸鎂O. 2%，磷酸二氫鉀O. 2%，無水氯化鈣O. 01%, ρΗ5· 5。2、酶活測定方法
(1)O. IM ρΗ5. O 甘氨酸-NaOH 緩沖液配制 O. 5% (w/v)的 Pectin (Sigma 公司),添加
O.2mM CaCl2，然后吸取900 μ L在60°C條件下預(yù)熱5min ；
(2)加入100μ L適量低溫果膠酶酶液，反應(yīng)IOmin ；
(3)加入I.5mL 3，5 一二硝基水楊酸(DNS)終止反應(yīng)，煮沸5min ；(4)將反應(yīng)體系冷卻至室溫后在540nm下測定OD值；
(5)I個酶活單位(U)定義為在給定的條件下每分鐘分解底物產(chǎn)生I μ mol半乳糖醛酸所需的酶量，酶活力計算公式
酶活力(U/mL)=2.9936XXN/ (TXV) 式中X——吸光度；
N—酶液稀釋倍數(shù)；
V——反應(yīng)中加酶量(mL)；
T——酶-底物反應(yīng)時間(min)。
制備獲得的低溫果膠酶酶活力為16. 5U/mL。3、低溫果膠酶的最適pH及pH穩(wěn)定性測定
酶的最適pH測定將低溫果膠酶在37°C下和O. IM pHl. 0-8.0的緩沖液中進(jìn)行酶促反應(yīng)。酶的PH穩(wěn)定性測定將酶液置于O. IM pHl. O 10. O的緩沖液中，在37°C下處理lh，然后在pH5.0及60°C下進(jìn)行酶促反應(yīng)，以未處理的酶液作為對照。緩沖液為O. IM甘氨酸-NaOH和甘氨酸-HCl。以含O. 2mM CaCl2的O. 5% (w/v)的Pectin為底物，反應(yīng)IOmin,測定低溫果膠酶的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明該酶的最適PH為5. 0，在pH3. O 5. 5范圍內(nèi)酶活性保持83%以上(圖I) j5pH3. O 8. O的緩沖液處理lh，酶活剩余在77%以上(圖2)。4、低溫果膠酶的最適溫度測定
酶的最適溫度測定在PH5. O的緩沖液中，于10 70°C下進(jìn)行酶促反應(yīng)。以含O. 2mMCaCl2的O. 5% (w/v)的Pectin為底物，反應(yīng)IOmin,測定低溫果膠酶的酶學(xué)性質(zhì)。結(jié)果表明該酶的最適溫度為60°C，在10-70°C范圍內(nèi)都具有活性，其中10°C時相對酶活剩余7. 4%(圖 3)。實施例2
I、低溫果膠酶酶液的制備
(1)將-20°c保存的IO6個棘孢青霉菌孢子懸液接種于50mL種子活化培養(yǎng)基，在溫度28°C、轉(zhuǎn)速120rpm條件下，棘孢青霉菌在種子活化培養(yǎng)基中培養(yǎng)36h ；
(2)將活化后的種子液2mL接種于200mL發(fā)酵培養(yǎng)基，在溫度28°C，轉(zhuǎn)速130rpm條件下，培養(yǎng)88h ；
(3)離心除去菌體后得到的上清液即為低溫果膠酶酶液。所述的種子活化培養(yǎng)基(w/v):葡萄 糖O. 8%，果膠O. 2%，硫酸銨O. 5%，七水硫酸鎂O. 2%，磷酸二氫鉀O. 2%，無水氯化鈣O. 01%, pH自然。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基(w/v):柚子皮粉O. 5%，蛋白胨1%，七水硫酸鎂O. 2%，磷酸二氫鉀O. 2%，無水氯化鈣O. 01%, ρΗ4· O。2、酶活測定方法
(1)O. IM ρΗ5. O 甘氨酸-NaOH 緩沖液配制 O. 5% (w/v)的 Pectin (Sigma 公司),添加
O.2mM CaCl2，然后吸取900 μ L在60°C條件下預(yù)熱5min ；
(2)加入100μ L適量低溫果膠酶酶液，反應(yīng)IOmin ；
(3)加入I.5mL 3，5 一二硝基水楊酸(DNS)終止反應(yīng)，煮沸5min ；
(4)將反應(yīng)體系冷卻至室溫后在540nm下測定OD值；
(5)I個酶活單位(U)定義為在給定的條件下每分鐘分解底物產(chǎn)生I μ mol半乳糖醛酸所需的酶量，酶活力計算公式
酶活力(U/mL) =2. 9936XXN/ (TXV)
式中X——吸光度；
N—酶液稀釋倍數(shù)；
V——反應(yīng)中加酶量(mL)；
T——酶-底物反應(yīng)時間(min)。制備獲得的低溫果膠酶酶活力為7. 7U/mL。 實施例3
I、低溫果膠酶酶液的制備
(1)將-20°c保存的IO6個棘孢青霉菌孢子懸液接種于50mL種子活化培養(yǎng)基，在溫度32°C、轉(zhuǎn)速180rpm條件下，棘孢青霉菌在種子活化培養(yǎng)基中培養(yǎng)60h ；
(2)將活化后的種子液6mL接種于200mL發(fā)酵培養(yǎng)基，在溫度32°C，轉(zhuǎn)速180rpm條件下，培養(yǎng)147h ；
(3)離心除去菌體后得到的上清液即為低溫果膠酶酶液。所述的種子活化培養(yǎng)基(w/v):葡萄糖O. 8%，果膠O. 2%，硫酸銨O. 5%，七水硫酸鎂
O.2%，磷酸二氫鉀O. 2%，無水氯化鈣O. 01%, pH自然。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基(w/v):柚子皮粉2%，蛋白胨2%，七水硫酸鎂O. 2%，磷酸二氫鉀
O.2%，無水氯化鈣 O. 01%, ρΗ6· O。2、酶活測定方法
(1)O. IM ρΗ5. O 甘氨酸-NaOH 緩沖液配制 O. 5% (w/v)的 Pectin (Sigma 公司),添加
O.2mM CaCl2，然后吸取900 μ L在60°C條件下預(yù)熱5min ；
(2)加入100μ L適量低溫果膠酶酶液，反應(yīng)IOmin ；
(3)加入I.5mL 3，5 一二硝基水楊酸(DNS)終止反應(yīng)，煮沸5min ；
(4)將反應(yīng)體系冷卻至室溫后在540nm下測定OD值；
(5)I個酶活單位(U)定義為在給定的條件下每分鐘分解底物產(chǎn)生I μ mol半乳糖醛酸所需的酶量，酶活力計算公式
酶活力(U/mL)=2.9936XXN/ (TXV)
式中X——吸光度；
N—酶液稀釋倍數(shù)；
V——反應(yīng)中加酶量(mL)；
T——酶-底物反應(yīng)時間(min)。制備獲得的低溫果膠酶酶活力為14.0U/mL。實施例4
低溫條件下低溫果膠酶對鮮榨蘋果汁的澄清
(1)將蘋果去皮，削成I.5cm3的小塊，稱取30g蘋果塊；
(2)加入30mL水，再加入O.15g的抗壞血酸;
(3)用榨汁機將蘋果塊榨成汁；
(4)用八層紗布將蘋果渣濾掉，得到鮮榨蘋果汁；
(5)取5mL鮮榨蘋果汁，添加5U低溫果膠酶酶液，分別在10°C、20°C和30°C保溫反應(yīng)2h ;同時取5mL鮮榨蘋果汁，添加5U煮沸IOmin滅活的酶液，分別在10°C、20°C和30°C保溫反應(yīng)2h作為對照；
(6)反應(yīng)結(jié)束后即得到澄清蘋果汁。以水為對照，在660nm下測量吸光度，計算透光率。透光率(％) =102_°D，10°C、20°C和30°C下，滅活的低溫果膠酶酶液處理的鮮榨蘋果汁透光率皆為4. 4%，而低溫果膠酶酶液處理的鮮榨蘋果汁透光率分別為43. 3%,53. 3%和62. 4% (圖 4)。低溫果膠酶酶液的添加量還可以是3U或7U，或3U 7U中的其它數(shù)值，都可以得到與實施例4相近似的鮮榨蘋果汁透光率。
權(quán)利要求
1.一種低溫果膠酶的生產(chǎn)方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行 (1)在溫度為28 32°C、轉(zhuǎn)速為120 180rpm條件下，將棘孢青霉菌(Penicilliumaculeatum)在種子活化培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 60h ； (2)將活化后的種子液以I.O 3. 0% (v/v)接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度為28 32°C、轉(zhuǎn)速為120 180rpm條件下，培養(yǎng)75 147h ； (3)離心除去菌體后得到的上清液即為低溫果膠酶酶液； 所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為(w/v):柚子皮粉O. 5 2%、蛋白胨O. 5 2%、七水硫酸鎂O. 2%、磷酸二氫鉀O. 2%、無水氯化鈣O. 01%、pH值4. O 6. O。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的低溫果膠酶的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的活化培養(yǎng)基為(w/v):葡萄糖O. 8%，果膠O. 2%，硫酸銨O. 5%，七水硫酸鎂O. 2%，磷酸二氫鉀O. 2%，無水氯化 丐 O. 01%，pH 自然。
3.一種用權(quán)利要求I所述的低溫果膠酶澄清鮮榨蘋果汁的方法，其特征在于在每毫升鮮榨蘋果汁中添加3 7U果膠酶酶液，在10°C或20°C或30°C下保溫反應(yīng)I 3h后即得到澄清蘋果汁。
全文摘要
本發(fā)明是一種利用柚子皮粉生產(chǎn)低溫果膠酶及低溫澄清蘋果汁的方法。柚子皮粉為碳源誘導(dǎo)棘孢青霉菌(Penicilliumaculeatum)生產(chǎn)低溫果膠酶，利用該低溫果膠酶在低溫下對鮮榨蘋果汁進(jìn)行澄清。發(fā)酵菌種為棘孢青霉菌，發(fā)酵培養(yǎng)基為(w/v)柚子皮粉0.5～2%、蛋白胨0.5～2%、七水硫酸鎂0.2%、磷酸二氫鉀0.2%、無水氯化鈣0.01%、pH值5.5，發(fā)酵條件為接種量2%(v/v)、發(fā)酵時間75～147h、發(fā)酵溫度30℃、轉(zhuǎn)速150rpm。該低溫果膠酶在10℃、20℃和30℃下對鮮榨蘋果汁反應(yīng)2h，透光率分別為43.3%、53.3%和62.4%，澄清效果顯著。
文檔編號C12N9/26GK102936587SQ201210481378
公開日2013年2月20日 申請日期2012年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月23日
發(fā)明者黃遵錫, 吳倩, 周峻沛, 張蕊, 唐湘華, 李俊俊, 許波, 丁俊美, 高雅潔 申請人:云南師范大學(xué)