專利名稱：一種利用糖質(zhì)原料連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種利用糖質(zhì)原料連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及米用丙酮丁醇梭菌(Oo1Sirit/i應(yīng)saccharobutylicum)DSM 13864,以葡萄糖、甘蔗糖蜜或玉米秸桿水解液等糖質(zhì)原料連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法。
背景技術(shù)：
丁醇作為一種重要的四碳平臺(tái)化合物，具有非常廣泛的用途，主要用于醋酸丁酯、鄰苯二甲酸正丁酯(DBP)、丙烯酸丁酯、脂肪二元酸和磷酸類增塑劑等的制造。丁醇還是油月旨、醫(yī)藥和樹脂等工業(yè)中重要的添加劑，也是香料、染料和印刷工業(yè)中常用的溶劑、脫蠟劑
坐寸ο近年來，丁醇被認(rèn)為是繼生物柴油、生物乙醇之后出現(xiàn)的一種最具發(fā)展?jié)摿Φ纳锶剂稀Ｅc其它生物燃料相比，生物丁醇有許多顯著的優(yōu)勢(shì)丁醇可以和汽油以任意比混合，在不改造汽車發(fā)動(dòng)機(jī)的條件下，汽車幾乎可以直接使用丁醇，而乙醇與汽油的摻混比為15%，甲醇為10% ;丁醇的熱值和辛烷值與汽油更接近，能量密度較高，是乙醇的I. 3倍；丁醇的親水性較弱，與汽油混合后蒸汽壓較低、腐蝕性較小，可實(shí)現(xiàn)管道便捷輸送；丁醇燃燒時(shí)不會(huì)有SOx或NOx等傳統(tǒng)化石液體燃料所產(chǎn)生的環(huán)境污染廢氣；另外，丁醇也可以作為各種燃料的添加劑。發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇可以追溯到第一次世界大戰(zhàn)期間，其規(guī)模曾僅次于乙醇發(fā)酵。傳統(tǒng)的分批發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇存在產(chǎn)物對(duì)菌體有毒害、溶劑總濃度低、生產(chǎn)率和得率低等缺點(diǎn)。在中國，傳統(tǒng)的發(fā)酵法生產(chǎn)丙酮丁醇主要是以玉米等糧食類淀粉質(zhì)原料為底物(ApplMicrobiol Biotechnol, 83:415 - 423，2009)，生產(chǎn)成本較高。為降低生產(chǎn)成本，近年來許多高校和研究機(jī)構(gòu)開始研究采用各種價(jià)廉的糖質(zhì)原料代替糧食淀粉質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)丙酮丁醇(Qureshi N, et al, Biomass Bioenergy, 34:559-565，2010 ；Qureshi N, et al, Biofuels, Bioprod. Bioref. 2, 319 - 330,2008 ；ffang L, et al, Process Biochem.46，604 - 607，2011)，這些報(bào)道采用的均為分批發(fā)酵的操作方式。近年也有關(guān)于連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)丙酮丁醇的研究報(bào)道，連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)率較分批發(fā)酵高，但是總?cè)軇┊a(chǎn)量往往較低，如Lee等人采用固定化細(xì)胞以葡萄糖為原料的連續(xù)發(fā)酵，當(dāng)稀釋率為O. 04 時(shí)，獲得10_13g/L 丁醇，生產(chǎn)率達(dá)到 O. 4 g/(L*h) (Lee SM, et al, Energy Fuels, 22:3459 - 3464,2008)。Richter 等以 67ossaccharoperbutylacetonicum Nl-4 為發(fā)酵菌種，丁酸和葡萄糖為底物，采用耦合氣提兩級(jí)連續(xù)發(fā)酵的操作方式，在O. 025 h—1的稀釋率下獲U 15. 7 g/L 的總?cè)軇〈忌a(chǎn)率為 O. 39 g/(L.h) (Richter H, et al, Biotechnol.Bioeng. 109 :913 - 921，2011)。Malaviya 等米用 CViosirii//應(yīng) pasteurianum ATCC6103菌株，以甘油為底物，采用細(xì)胞循環(huán)連續(xù)發(fā)酵的操作方式，在O. 9 h—1的稀釋率下獲得了 9. 2g/L 的總?cè)軇?，丁醇的生產(chǎn)率為 7. 8 g/(L.h) (Malaviya A, et al, AppI. Microbiol.Biotechnol. 93，1485 - 1494, 2012)。連續(xù)發(fā)酵通過不斷地補(bǔ)加新鮮的培養(yǎng)基同時(shí)排出等量的發(fā)酵醪液，使菌體處于穩(wěn)定的生長狀態(tài)，與其它的發(fā)酵方式相比可以縮短發(fā)酵周期，提高設(shè)備利用率，降低溶劑對(duì)菌體的毒害作用，提高溶劑的生產(chǎn)率。本發(fā)明以saccharobu tyli cum DSM 13864為發(fā)酵菌種，采用多級(jí)連續(xù)發(fā)酵的操作模式，發(fā)酵的原料采用廉價(jià)的糖質(zhì)原料，如糖蜜和玉米秸桿水解液等，既降低了原料成本又獲得了較高的生產(chǎn)率。到目前為止還沒有利用玉米秸桿水解液或糖蜜連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的工業(yè)化生產(chǎn)實(shí)例?！?br>
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，為工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)丁醇提供一種生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)強(qiáng)度高、易于自動(dòng)化操作的連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)新方法；為使用廉價(jià)原料連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)丙酮丁醇提供一種方法依據(jù)。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案一種利用糖質(zhì)原料連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，采用多個(gè)發(fā)酵罐串聯(lián)組合成多級(jí)連續(xù)發(fā)酵裝置，多級(jí)連續(xù)發(fā)酵裝置的級(jí)數(shù)N為4-6,步驟為
(1)種子的活化
菌種丙酮丁醇梭菌(CViosirii/itt saccharobuty licum') DSM 13864,購于德國微生物菌種保藏中心。將C saccharobu tyli cum DSM 13864菌株孢子懸液以1%_10%的接種量接入種子培養(yǎng)基(RCM培養(yǎng)基)中，置于真空干燥器中抽真空至O. 065 MPa，于35-38°C下靜置培養(yǎng) 16-18h ；
(2)多級(jí)連續(xù)發(fā)酵
發(fā)酵培養(yǎng)基為(/L):總糖 60 g, (NH4) 2S04 1-2 g, K2HPO4 O. 5g，MnSO4 · H2O O. 01 g，玉米漿干粉 10-15 g, CaCO3 2-4 g,以純水配制，pH 6. 0-6. 25 ；
連續(xù)發(fā)酵過程中新鮮培養(yǎng)基的補(bǔ)加速率與發(fā)酵罐中培養(yǎng)基體積的恒定均使用蠕動(dòng)泵控制，新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基及前后罐之間發(fā)酵液的流加均從各級(jí)發(fā)酵罐底部補(bǔ)加，發(fā)酵液從發(fā)酵罐上部流出的操作方式；采用如下三種操作方式中的一種進(jìn)行；
A、第一種操作方式
連續(xù)發(fā)酵前，第一級(jí)和第二級(jí)罐中裝有體積為V的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，后面幾級(jí)為空罐。首先，在第一級(jí)和第二級(jí)發(fā)酵罐中按V的2%-8%的接種量接入種子液，培養(yǎng)16-24 h到達(dá)產(chǎn)溶劑期，然后按照O. 03-0. 15 V/h流速恒速補(bǔ)加新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基到第一級(jí)發(fā)酵罐中，同時(shí)第一級(jí)發(fā)酵罐中的發(fā)酵液以相同的速率流入到第二級(jí)發(fā)酵罐中，第二級(jí)發(fā)酵罐中的發(fā)酵液以相同的速率流入到第三級(jí)發(fā)酵罐中，待第三級(jí)發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基體積積累到V后開始以相同的速率流入到第四級(jí)發(fā)酵罐中，再繼續(xù)以相同的方式將最后一級(jí)發(fā)酵罐中的發(fā)酵液流入收集罐；
B、第二種操作方式
連續(xù)發(fā)酵前，各個(gè)發(fā)酵罐中均裝有體積為V的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基。首先，對(duì)第N-2級(jí)(N為多級(jí)連續(xù)發(fā)酵中的發(fā)酵罐罐數(shù))及其以后的發(fā)酵罐按V的2%-8%的接種量接入種子液，發(fā)酵培養(yǎng)16-24 h;然后前兩級(jí)發(fā)酵罐按V的2%-8%的接種量接入種子液，發(fā)酵培養(yǎng)16-24 h后，按照O. 03-0. 15 V/h流速恒速補(bǔ)加新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基至第一級(jí)發(fā)酵罐中，同時(shí)以相同的流速將前一級(jí)發(fā)酵罐中的發(fā)酵液流入后一級(jí)發(fā)酵罐中，最后一級(jí)發(fā)酵罐中的發(fā)酵液流入收集罐。C、第三種操作方式
連續(xù)發(fā)酵前，各個(gè)發(fā)酵罐中均裝有體積為V的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基。首先，多個(gè)發(fā)酵罐中同時(shí)按V的2%-8%的接種量接入種子液，發(fā)酵培養(yǎng)16-24 h到達(dá)產(chǎn)溶劑期，然后按照O. 03-0. 15V/h流速恒速補(bǔ)加新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基到第一級(jí)發(fā)酵罐中，同時(shí)以相同的流速將前一級(jí)發(fā)酵罐中的發(fā)酵液流入后一級(jí)發(fā)酵罐中，最后一級(jí)發(fā)酵罐中的發(fā)酵液流入收集罐。連續(xù)發(fā)酵中各級(jí)發(fā)酵條件為發(fā)酵罐接種前用100% CO2通入罐頂以維持厭氧環(huán)境直至菌體產(chǎn)氣，發(fā)酵溫度維持在33-40°C，控制每一級(jí)發(fā)酵罐的稀釋率D為O. 02-0. 2 h—1，攪拌轉(zhuǎn)速維持在20-100 r/min。稀釋率(D)定義為新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基的補(bǔ)加速率F (mL/h)與發(fā)酵罐中培養(yǎng)基體積 V (mL)的比值。使用的糖質(zhì)原料為葡萄糖、甘蔗糖蜜或玉米秸桿水解液。所使用的多級(jí)連續(xù)發(fā)酵裝置選用包含4個(gè)發(fā)酵罐。本發(fā)明的有益效果與分批發(fā)酵相比，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在使用廉價(jià)的糖質(zhì)原料可以降低生產(chǎn)成本，并獲得較高的溶劑生產(chǎn)率；只需一次滅菌和接種，節(jié)約了反復(fù)洗罐、滅菌等非發(fā)酵時(shí)間，縮短了生產(chǎn)周期，大大提高了設(shè)備的利用率；且發(fā)酵設(shè)備簡(jiǎn)單，易于自動(dòng)化控制，適用于工業(yè)化。根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式，以丙酮丁醇梭菌saccharobu tyli cumDSM 13864連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)丁醇，原料為葡萄糖、甘蔗糖蜜或玉米秸桿水解液。以葡萄糖為主要碳源，按照第一種操作方式進(jìn)行四級(jí)連續(xù)發(fā)酵，當(dāng)稀釋率為O. 05 h—1時(shí)，四級(jí)罐中總?cè)軇┳罡邽?1. 57 g/L (其中丁醇7. 29 g/L)，四級(jí)發(fā)酵罐的總生產(chǎn)率為O. 145 g/(L*h)。以甘蔗糖蜜為主要碳源，按照第二種操作方式進(jìn)行四級(jí)連續(xù)發(fā)酵時(shí)，使用梯度稀釋率(即四個(gè)罐的稀釋率分別為O. 15，0. 15，0. 125及0.1 IT1)條件下，第四級(jí)罐中總?cè)軇┳罡邽?3. 75 g/L (其中丁醇8. 26 g/L)，四級(jí)發(fā)酵罐的總生產(chǎn)率為O. 439 g/(L*h)。當(dāng)以玉米秸桿水解液為主要碳源，采用第三種操作方式進(jìn)行四級(jí)連續(xù)發(fā)酵時(shí)，當(dāng)稀釋率為O. I IT1時(shí)，第四級(jí)罐流出液中總?cè)軇┳罡邽?3.44 g/L(其中丁醇9. 29 g/L)，四級(jí)發(fā)酵罐的總生產(chǎn)率為O. 336 g/(L.h)。
具體實(shí)施例方式以下，本發(fā)明將以多種實(shí)施案例來詳細(xì)描述利用糖質(zhì)原料連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法。下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅限于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例I、葡萄糖培養(yǎng)基的四級(jí)連續(xù)發(fā)酵
采用四個(gè)3 L攪拌式發(fā)酵罐串聯(lián)組合成四級(jí)連續(xù)發(fā)酵裝置，單罐的裝液量為I L，補(bǔ)料培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為60 g/L，使用的培養(yǎng)基組成為葡萄糖60 g/L，玉米漿干粉10 g/L,CaCO3 4 g/L, (NH4)2SO4 2 g/L，K2HPO4 0.5 g/L，MnSO4*H2O 0.01 g/L ;采用第一種或第二種操作方式，四個(gè)罐的溫度都控制在37°C，轉(zhuǎn)速為50 r/min，稀釋率分別控制在O. 03 ^17O. 05IT1及O. I 1Γ1，結(jié)果見表I和表2。表I葡萄糖培養(yǎng)基四級(jí)連續(xù)發(fā)酵法生產(chǎn)丁醇(第一種操作方式)
權(quán)利要求
1.一種利用糖質(zhì)原料連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，其特征在于采用多個(gè)發(fā)酵罐串聯(lián)組合成多級(jí)連續(xù)發(fā)酵裝置，N為多級(jí)連續(xù)發(fā)酵中的發(fā)酵罐罐數(shù)#為4-6，步驟為 (1)種子的活化 菌種丙酮丁醇梭菌(CViosirii/itt saccharobutylicum') DSM 13864,購于德國微生物菌種保藏中心，將C saccharobuty I i cum DSM 13864菌株孢子懸液以1%_10%的接種量接入種子培養(yǎng)基RCM培養(yǎng)基中，置于真空干燥器中抽真空至O. 065 MPa，于35-38°C下靜置培養(yǎng) 16-18h ； (2)多級(jí)連續(xù)發(fā)酵 發(fā)酵培養(yǎng)基以 g/L 計(jì)為總糖 60，(NH4) 2S04 1-2，K2HPO4 O. 5，MnSO4 · H2O O. 01，玉米漿干粉 10-15，CaCO3 2-4，以純水配制，pH 6. 0-6. 25 ； 連續(xù)發(fā)酵過程中新鮮培養(yǎng)基的補(bǔ)加速率與發(fā)酵罐中培養(yǎng)基體積的恒定均使用蠕動(dòng)泵控制，新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基及前后罐之間發(fā)酵液的流加均從各級(jí)發(fā)酵罐底部補(bǔ)加，發(fā)酵液從發(fā)酵罐上部流出的操作方式；采用如下三種操作方式中的一種進(jìn)行； A、第一種操作方式 連續(xù)發(fā)酵前，第一級(jí)和第二級(jí)罐中裝有體積為V的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，后面幾級(jí)為空罐；首先，在第一級(jí)和第二級(jí)發(fā)酵罐中按V的2%-8%的接種量接入種子液，培養(yǎng)16-24 h到達(dá)產(chǎn)溶劑期，然后按照O. 03-0. 15 V/h流速恒速補(bǔ)加新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基到第一級(jí)發(fā)酵罐中，同時(shí)第一級(jí)發(fā)酵罐中的發(fā)酵液以相同的速率流入到第二級(jí)發(fā)酵罐中，第二級(jí)發(fā)酵罐中的發(fā)酵液以相同的速率流入到第三級(jí)發(fā)酵罐中，待第三級(jí)發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基體積積累到V后開始以相同的速率流入到第四級(jí)發(fā)酵罐中，再繼續(xù)以相同的方式將最后一級(jí)發(fā)酵罐中的發(fā)酵液流入收集罐； B、第二種操作方式 連續(xù)發(fā)酵前，各個(gè)發(fā)酵罐中均裝有體積為V的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基；首先，對(duì)第N-2級(jí)及其以后的發(fā)酵罐按V的2%-8%的接種量接入種子液，發(fā)酵培養(yǎng)16-24 h ;然后前兩級(jí)發(fā)酵罐按V的2%-8%的接種量接入種子液，發(fā)酵培養(yǎng)16-24 h后，按照O. 03-0. 15 V/h流速恒速補(bǔ)加新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基至第一級(jí)發(fā)酵罐中，同時(shí)以相同的流速將前一級(jí)發(fā)酵罐中的發(fā)酵液流入后一級(jí)發(fā)酵罐中，最后一級(jí)發(fā)酵罐中的發(fā)酵液流入收集罐； C、第三種操作方式 連續(xù)發(fā)酵前，各個(gè)發(fā)酵罐中均裝有體積為V的新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基；首先，各級(jí)發(fā)酵罐中同時(shí)按V的2%-8%的接種量接入種子液，發(fā)酵培養(yǎng)16-24 h到達(dá)產(chǎn)溶劑期，然后按照O. 03-0. 15V/h流速恒速補(bǔ)加新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基到第一級(jí)發(fā)酵罐中，同時(shí)以相同的流速將前一級(jí)發(fā)酵罐中的發(fā)酵液流入后一級(jí)發(fā)酵罐中，最后一級(jí)發(fā)酵罐中的發(fā)酵液流入收集罐； 連續(xù)發(fā)酵中各級(jí)發(fā)酵條件為發(fā)酵罐接種前從發(fā)酵罐頂部通入100% CO2以維持厭氧環(huán)境直至菌體產(chǎn)氣，發(fā)酵溫度維持在33-40°C，控制每一級(jí)發(fā)酵罐的稀釋率D為O. 02-0. 2 h—1，攪拌轉(zhuǎn)速維持在20-100 r/min ； 稀釋率D定義為新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基的補(bǔ)加速率F與發(fā)酵罐中培養(yǎng)基體積V的比值，F(xiàn)的單位為mL/h, V的單位為mL。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于使用的糖質(zhì)原料為葡萄糖、甘蔗糖蜜或玉米秸桿水解液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所使用的多級(jí)連續(xù)發(fā)酵裝置選用4個(gè)發(fā)酵罐。
全文摘要
一種利用糖質(zhì)原料連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開了一種采用丙酮丁醇梭菌(Clostridiumsaccharobutylicum)DSM13864，以葡萄糖、甘蔗糖蜜或玉米秸稈水解液等糖質(zhì)原料，采用多個(gè)發(fā)酵罐串聯(lián)組合成多級(jí)連續(xù)發(fā)酵裝置，連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)丁醇的方法。采用多級(jí)連續(xù)發(fā)酵可獲得高的溶劑濃度和溶劑生產(chǎn)率，減少設(shè)備清洗次數(shù)和滅菌等非生產(chǎn)占用時(shí)間，降低勞動(dòng)強(qiáng)度，提高設(shè)備利用率，適用于工業(yè)化操作；采用玉米秸稈水解液原料時(shí)，平均總?cè)軇┛蛇_(dá)13.44g/L(其中丁醇9.29g/L)，總?cè)軇┥a(chǎn)率達(dá)到0.439g/(L h)。
文檔編號(hào)C12P7/16GK102925495SQ20121047133
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月20日
發(fā)明者倪曄, 夏子義, 王云 申請(qǐng)人:江南大學(xué)