專利名稱：一種用無載體固定化酶去除酚類污染物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酚類污染物的處理領(lǐng)域，尤其涉及一種用無載體固定化酶去除酚類污染物的方法。
背景技術(shù)：
酚類污染物是一種危害大且污染范圍廣的環(huán)境污染物，是一種原生質(zhì)毒物，在低濃度時就會致癌、致畸、致突變，其廣泛存在于工業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動中，當(dāng)其被排放到環(huán)境中，會在土壤以及水環(huán)境中累積。水中酚的質(zhì)量濃度達到O. lmg/L時，魚肉即有異味，不能食用；達到lmg/L時，會影響魚類產(chǎn)卵；達到5mg/L時，魚類則會大量死亡；飲用水中含有酚會影響人類健康，即使?jié)舛戎挥蠴. 002mg/L，用氯消毒也會產(chǎn)生氯酚惡臭。低濃度的酚水溶液會影響農(nóng)作物的生長，不能用于灌溉。而且酚由于其毒性還會抑制微生物的生長，破壞生態(tài)平衡。因此，酚類污染物的處理越來越受到社會的重視。目前，有關(guān)酚類污染物的處理主要包括化學(xué)法、物理法和生物法。化學(xué)法處理效果好，但成本較高，而且容易造成二次污染。物理法操作復(fù)雜，成本較高，而且只適用于較高濃度的酚類污染物處理。而生物法則相對應(yīng)用范圍更廣，操作簡便，成本較低。生物法主要包括用微生物處理和酶催化法處理酚類污染物。微生物處理相對較復(fù)雜，且其處理速率較慢，周期長。而酶催化法處理酚類污染物處理速率較快，成本較低，并且酶經(jīng)固定化后還可以反復(fù)使用。目前，酶催化法處理酚類污染物存在酶的來源局限、分離提純復(fù)雜、價格昂貴等問題。另外，傳統(tǒng)的酶固定化方法都需要用到大量載體，將酶通過共價交聯(lián)、物理吸附或包埋法等方式固定到載體上，這存在下列幾個缺點(1)需要用純化和半純化的酶，導(dǎo)致制備工藝較復(fù)雜；(2)大量的載體稀釋了酶的濃度；(3)交聯(lián)或包埋法會導(dǎo)致酶失活，而物理吸附容易使酶分子脫落，導(dǎo)致催化劑的重復(fù)利用率低；(4)制備酶制劑的成本較高。酶催化法所用到的酶主要包括漆酶、過氧化物酶及酪氨酸酶。當(dāng)用漆酶和過氧化物酶處理酚類污染物時通常需要添加其他輔助性物質(zhì)，這增大了處理成本，并且可能帶來二次污染，處理效果也不夠理想。而有關(guān)酪氨酸酶處理含酚污水的研究普遍的處理效果不佳，重復(fù)利用性差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種用無載體固定化酶去除酚類污染物的方法，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)用于處理酚類污染物的酶的重復(fù)利用率低，對酚類污染物的處理效果不理想，且酶的固定化方法工藝復(fù)雜，制備成本高昂的問題。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種用無載體固定化酶去除酚類污染物的方法，該方法是利用一種酚類污染物處理劑處理酚類污染物，酚類污染物處理劑含有無載體固定化酪氨酸酶，酚類污染物含有酚類化合物，酚類污染物處理劑利用無載體固定化酪氨酸酶將酚類化合物催化反應(yīng)生成對應(yīng)的醌類化合物，以去除酚類化合物。
根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實施例，酚類化合物包括如下化合物中的一種或多種苯酚、甲基酚、硝基酚、對氯苯酚、壬基酚、辛基酚、氨基酚及雙酚A。根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實施例，該方法還包括如下步驟利用高效液相色譜法檢測酚類化合物的殘留情況以及處理率。根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實施例，該方法還包括如下步驟利用水螅對經(jīng)該方法處理后的酚類污染物的毒性進行檢測。根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實施例，制備無載體固定化酪氨酸酶的方法包括如下步驟獲取酪氨酸酶酶液；室溫下對酪氨酸酶酶液進行攪拌并加入硫酸銨固體，使酪氨酸酶酶液的硫酸銨飽和度在(TC時達到50%，并進行沉淀反應(yīng)10分鐘，以獲取部分沉淀的酪氨酸酶酶液；將重量比為12. 5%的戊二醛逐滴加入部分沉淀的酪氨酸酶酶液中，并在4°C下攪拌反應(yīng)以獲取交聯(lián)懸濁液，其中，12. 5%的戊二醛與酪氨酸酶酶液的體積比為1:50 ;將交聯(lián)懸濁液離心并獲取不溶于水的顆粒，用磷酸緩沖液清洗顆粒至少一次，顆粒即為無載體固定化酪氨酸酶；將清洗后的顆粒冷凍干燥后并研磨粉碎以獲取粉末狀的無載體固定化酪氨酸酶。根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實施例，獲取酪氨酸酶酶液的步驟包括如下步驟將酪氨酸酶原料物與摩爾濃度為50毫摩爾每升，pH值為6. O的磷酸緩沖液混合搗碎得到混合液，將混合液過濾并獲取濾液；將濾液低溫冷藏，以獲取活性較高的酪氨酸酶粗提液；將酪氨酸酶粗提液進行低溫離心并去除沉淀，以獲取酪氨酸酶酶液。根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實施例，將濾液低溫冷藏的步驟包括將濾液置于_20°C的冰箱中保存至少I個月。根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實施例，酪氨酸酶原料物包括如下物質(zhì)的一種或多種馬鈴薯、香蕉、蘋果、山芋、芋艿、蠶豆及蘑菇。根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實施例，4°C下攪拌反應(yīng)的時間為16小時。根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實施例，用磷酸緩沖液清洗顆粒的步驟包括用摩爾濃度為50毫摩爾每升，pH值為6. O的磷酸緩沖液清洗顆粒。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有益效果在于本發(fā)明的用無載體固定化酶去除酚類污染物的方法能非常有效地從酚類污染物中除去酚類化合物，其處理效果和重復(fù)利用率相對于其他酶法處理酚類污染物有顯著的提升，所采用的無載體固定化酪氨酸酶既避免了二次污染又節(jié)約了處理成本，且由于該無載體固定化酪氨酸酶的來源廣泛且制備工藝簡單，因而本發(fā)明的用無載體固定化酶去除酚類污染物的方法成本低廉，且經(jīng)過本發(fā)明方法處理過的酚類污染物的生物毒性被大大降低。


圖I是本發(fā)明實施例提供的用無載體固定化酶去除酚類污染物的方法的反應(yīng)原理圖；圖2是本發(fā)明實施例提供的無載體固定化酪氨酸酶的制備方法的流程圖；圖3是本發(fā)明的用無載體固定化酶去除酚類污染物的方法的第一實施例的處理結(jié)果示意圖；圖4是本發(fā)明的用無載體固定化酶去除酚類污染物的方法的第四實施例的處理結(jié)果示意圖5是本發(fā)明的用無載體固定化酶去除酚類污染物的方法的第五實施例中水螅對本發(fā)明方法處理后的酚類污染物水樣毒性檢測的結(jié)果示意圖。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對·本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。本發(fā)明提供了一種用無載體固定化酶去除酚類污染物的方法，該用無載體固定化酶去除酚類污染物的方法是利用一種酚類污染物處理劑處理酚類污染物，該酚類污染物處理劑含有無載體固定化酪氨酸酶，該酚類污染物含有酚類化合物，該酚類污染物處理劑利用本發(fā)明的無載體固定化酪氨酸酶將酚類化合物催化反應(yīng)生成對應(yīng)的醌類化合物，以去除酚類化合物。其中，酚類污染是指酚類化合物對環(huán)境造成的污染。酚類污染物主要來源于焦化廠、煤氣廠、石油化工廠、絕緣材料廠等工業(yè)部門以及石油裂解制乙烯、合成苯酚聚酰胺纖維、合成染料、合成有機農(nóng)藥和酚醛樹脂生產(chǎn)過程。酚類化合物包括如下化合物中的一種或多種甲基酚(間甲基苯酚、鄰甲基苯酚及對甲基苯酚)、硝基酚、苯酚、對氯苯酚、壬基酚、辛基酚、氨基酚、五氯酚及雙酚A等對環(huán)境產(chǎn)生污染的各種酚類化合物，但不限于此，此處不再例舉。圖I是本發(fā)明實施例提供的用無載體固定化酶去除酚類污染物的方法的反應(yīng)原理圖，如圖I所示，酚類化合物經(jīng)本發(fā)明的無載體固定化酪氨酸酶催化反應(yīng)后氧化會生成鄰苯酚并進一步氧化生成對應(yīng)的醌類化合物，醌類化合物在自然條件下會通過一系列的非酶促反應(yīng)生成黑色素并自動聚集而沉淀下來，從而達到對酚類污染物進行處理的目的。本發(fā)明中，無載體固定化酪氨酸酶的用量和處理時間根據(jù)酚類化合物的種類和濃度而定，在利用本發(fā)明用無載體固定化酶去除酚類污染物的方法處理酚類污染物后，優(yōu)選再利用高效液相色譜法(HPLC)檢測酚類化合物的殘留情況以及處理率，并優(yōu)選用水螅對處理后的酚類污染物的毒性進行檢測。本發(fā)明實施例還進一步提供了一種制備本發(fā)明的無載體固定化酪氨酸酶的方法。圖2是本發(fā)明實施例提供的無載體固定化酪氨酸酶的制備方法的流程圖。如圖2所示，本發(fā)明的實施例的無載體固定化酪氨酸酶的制備方法包括步驟SI、步驟S2、步驟S3、步驟S4及步驟S5。其中，步驟SI :獲取酪氨酸酶酶液。其中，酪氨酸酶酶液可以是目前可獲取的無需完全純化的各種來源的酪氨酸酶酶液。例如，在本實施例中，步驟SI包括如下步驟步驟Sll :將酪氨酸酶原料物與摩爾濃度為50毫摩爾每升，pH值為6. O的磷酸緩沖液混合搗碎得到混合液，將混合液過濾并獲取濾液；步驟S12 :將濾液低溫冷藏，以獲取活性較高的酪氨酸酶粗提液；步驟S13 :將酪氨酸酶粗提液進行低溫離心并去除沉淀，以獲取酪氨酸酶酶液。本發(fā)明中不對酪氨酸酶的來源進行限制，酪氨酸酶原料物可以包括如下物質(zhì)的一種或多種馬鈴薯、香蕉、蘋果、山芋、芋艿、蠶豆及蘑菇等含有豐富的酪氨酸酶的原料物，但不限于此,此處不再--例舉。本實施例中，步驟Sll中例如可以采用IOOg的酪氨酸酶原料物與200ml摩爾濃度為50毫摩爾每升，pH值為6. O的磷酸緩沖液進行混合搗碎，并可以采用食物加工器等設(shè)備搗碎酪氨酸酶原料物。本實施例中，步驟S12中將濾液低溫冷藏的步驟包括如下步驟將濾液置于_20°C的冰箱中保存至少I個月。當(dāng)采用_20°C的冰箱將濾液低溫冷藏后，在4°C的冰箱中對凍存的濾液解凍，以方便進行之后的制備步驟。步驟S2 :室溫下對酪氨酸酶酶液進行攪拌并加入硫酸銨固體，使酪氨酸酶酶液的硫酸銨飽和度在0°C時達到50%，并進行沉淀反應(yīng)10分鐘，以獲取部分沉淀的酪氨酸酶酶液。本實施例中，步驟S2中可以采用磁力攪拌的方式對酪氨酸酶酶液進行攪拌，沉淀反應(yīng)的時間則優(yōu)選為10分鐘。步驟S3 :將重量比為12. 5%的戊二醛逐滴加入部分沉淀的酪氨酸酶酶液中，并在4°C下攪拌反應(yīng)以獲取交聯(lián)懸濁液，其中，12. 5%的戊二醛與酪氨酸酶酶液的體積比為1:50。本實施例中，步驟S3中的4°C下攪拌反應(yīng)的時間優(yōu)選為16小時。步驟S4 :將交聯(lián)懸濁液離心并獲取不溶于水的顆粒，用磷酸緩沖液清洗顆粒至少一次，該顆粒即為無載體固定化酪氨酸酶。本實施例中，步驟S4中用磷酸緩沖液清洗顆粒的步驟包括如下步驟用摩爾濃度為50mM的pH值為6. O的磷酸緩沖液清洗所述顆粒。清洗顆粒的次數(shù)優(yōu)選為數(shù)次，更優(yōu)選清洗至清洗液中不含有酪氨酸酶活性為止。步驟S5 :將清洗后的顆粒冷凍干燥并研磨粉碎以獲取粉末狀的無載體固定化酪氨酸酶。本實施例中，將不溶于水的顆粒經(jīng)冷凍干燥并研磨后得到棕褐色的粉末狀的酶粉即為無載體固定化酪氨酸酶(Cross-Linked Enzyme Aggregates)的粉末，當(dāng)然,在其他實施例中還可以采取其他既不會破壞酶活性同時干燥效果好的干燥方式獲取粉末狀的無載體固定化酪氨酸酶，此處不再贅述。應(yīng)當(dāng)指出的是，本發(fā)明實施例提供的無載體固定化酪氨酸酶不僅限于本實施例的方法，使用其他無載體固定化固定化酪氨酸酶的方法并使用本發(fā)明構(gòu)思處理酚類污染物的方案，皆應(yīng)視為被本發(fā)明的權(quán)利要求所覆蓋。下面結(jié)合具體實施例更進一步說明本發(fā)明的用無載體固定化酶去除酚類污染物的方法。第一實施例分別在IOOml的苯酚(濃度為2. 5mM)、IOOml的對甲基苯酚(濃度為2. 5mM)、IOOml的對氯苯酹(濃度為2. 5mM)> IOOml的雙酹A (濃度為O. 022mM)中加入50mg的無載體固定化酪氨酸酶并混合，各混合液在恒溫搖床(30°C，250r/min)中反應(yīng)，每隔一定時間取Iml各混合液檢測其中酚類化合物濃度的變化情況。如圖3所示，雙酚A經(jīng)無載體固定化酪氨酸酶處理I小時后可以被完全處理，對甲基苯酚經(jīng)無載體固定化酪氨酸酶處理I. 5小時后的處理率為99. 6%，對氯苯酚經(jīng)無載體固定化酪氨酸酶處理2小時后的處理率為99. 6%，苯酚經(jīng)無載體固定化酪氨酸酶處理3小時后的處理率為99. 5%。所有酚類污染物經(jīng)無載體固定化酪氨酸酶處理4小時后均能被完全處理。第二實施例將50mg的無載體固定化酪氨酸酶加入IOOml的混合酹(含濃度皆為2. 5mM的苯酚、對甲基苯酚及對氯苯酚)中，并將混合液置于恒溫搖床(30°C，250r/min)中反應(yīng)。結(jié)果顯示，經(jīng)無載體固定化酪氨酸酶處理6小時后，對甲基苯酚能完全去除，對氯苯酚的處理率為99. 3%，而經(jīng)過11小時處理后苯酚的處理率為75. 9%。
第三實施例將30mg的無載體固定化酪氨酸酶分別用于重復(fù)處理20ml的苯酹、對甲基苯酹、對氯苯酚溶液(濃度均為5mM)，每次處理時間為2小時，經(jīng)過5次重復(fù)使用后，苯酚、對甲基苯酚、對氯苯酚的處理率分別為51. 3%,97. 7%、78%。第四實施例將45mg的無載體固定化酪氨酸酶分別用于重復(fù)處理20ml的雙酚A (濃度為
O.022mM)溶液，每次處理時間為O. 5小時，經(jīng)過10次重復(fù)使用，酚處理率仍然達78% (如圖4所示)。第五實施例用水螅對無載體固定化酪氨酸酶處理后的酚類污染物水樣毒性進行檢測。用吸管取普通水螅(Hydra vulgaris)置于載波片上,用吸水紙吸去水后立即滴加2_3滴下列待測水樣至水螅上無污染水樣、無載體固定化酪氨酸酶處理前的對氯苯酹水樣、無載體固定化酪氨酸酶處理后的對氯苯酚水樣、無載體固定化酪氨酸酶處理前的混合酚水樣、無載體固定化酪氨酸酶處理后的混合酚水樣，并以滴加無污染水樣的水螅組為對照組，每隔I小時用正置熒光顯微鏡觀察水螅的生活狀態(tài)并拍照記錄，結(jié)果如圖5所示。水螅在經(jīng)本發(fā)明處理后的含酚水樣中的生活狀態(tài)明顯優(yōu)于處理前的水樣，與在無酚類物質(zhì)污染的水樣中的生活狀態(tài)相同。這表明酚類污染物經(jīng)本發(fā)明方法處理后，生物毒性大大降低。本發(fā)明的用無載體固定化酶去除酚類污染物的方法能非常有效地從酚類污染物中除去酚類化合物，其處理效果和重復(fù)利用率相對于其他酶法處理酚類污染物有顯著的提升，所采用的無載體固定化酪氨酸酶既避免了二次污染又節(jié)約了處理成本，且由于該無載體固定化酪氨酸酶的來源廣泛且制備工藝簡單，因而本發(fā)明的用無載體固定化酶去除酚類污染物的方法成本低廉，且經(jīng)過本發(fā)明方法處理過的酚類污染物的生物毒性能被大大降低。此外，本發(fā)明的無載體固定化酪氨酸酶的制備方法采用無載體固定化方法對酪氨酸酶進行固定化，該制備方法無需純化的酶，只需粗酶液即可進行制備，整個制備過程工藝簡單，所選用的酪氨酸酶在處理過程中無需引入添加劑，既避免了二次污染又節(jié)約了處理成本,且酶的來源廣泛,成本低廉。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用無載體固定化酶去除酚類污染物的方法，其特征在于，所述方法是利用一種酚類污染物處理劑處理酚類污染物，所述酚類污染物處理劑含有無載體固定化酪氨酸酶，所述酚類污染物含有酚類化合物，所述酚類污染物處理劑利用所述無載體固定化酪氨酸酶將所述酚類化合物催化反應(yīng)生成對應(yīng)的醌類化合物，以去除所述酚類化合物。
2.如權(quán)利要求I所述的用無載體固定化酶去除酚類污染物的方法，其特征在于，所述酚類化合物包括如下化合物中的一種或多種苯酚、甲基酚、硝基酚、對氯苯酚、壬基酚、辛基酚、氨基酚及雙酚A。
3.如權(quán)利要求I所述的用無載體固定化酶去除酚類污染物的方法，其特征在于，所述方法還包括如下步驟利用高效液相色譜法檢測所述酚類化合物的殘留情況以及處理率。
4.如權(quán)利要求I所述的用無載體固定化酶去除酚類污染物的方法，其特征在于，所述方法還包括如下步驟利用水螅對經(jīng)所述方法處理后的酚類污染物的毒性進行檢測。
5.如權(quán)利要求I所述的用無載體固定化酶去除酚類污染物的方法，其特征在于，制備所述無載體固定化酪氨酸酶的方法包括如下步驟獲取酪氨酸酶酶液；室溫下對所述酪氨酸酶酶液進行攪拌并加入硫酸銨固體，使所述酪氨酸酶酶液的硫酸銨飽和度在0°C時達到50%，并進行沉淀反應(yīng)10分鐘，以獲取部分沉淀的酪氨酸酶酶液；將重量比為12. 5%的戊二醛逐滴加入所述部分沉淀的酪氨酸酶酶液中，并在4°C下攪拌反應(yīng)以獲取交聯(lián)懸濁液，其中，所述12. 5%的戊二醛與所述酪氨酸酶酶液的體積比為1:50 ；將所述交聯(lián)懸濁液離心并獲取不溶于水的顆粒，用磷酸緩沖液清洗所述顆粒至少一次，所述顆粒即為無載體固定化酪氨酸酶；將清洗后的所述顆粒冷凍干燥后并研磨粉碎以獲取粉末狀的無載體固定化酪氨酸酶。
6.如權(quán)利要求5所述的用無載體固定化酶去除酚類污染物的方法，其特征在于，所述獲取酪氨酸酶酶液的步驟包括如下步驟將酪氨酸酶原料物與摩爾濃度為50毫摩爾每升，pH值為6. O的磷酸緩沖液混合搗碎得到混合液，將所述混合液過濾并獲取濾液；將所述濾液低溫冷藏，以獲取活性較高的酪氨酸酶粗提液；將所述酪氨酸酶粗提液進行低溫離心并去除沉淀，以獲取所述酪氨酸酶酶液。
7.如權(quán)利要求6所述的用無載體固定化酶去除酚類污染物的方法，其特征在于，所述將濾液低溫冷藏的步驟包括將所述濾液置于_20°C的冰箱中保存至少I個月。
8.如權(quán)利要求6所述的用無載體固定化酶去除酚類污染物的方法，其特征在于，所述酪氨酸酶原料物包括如下物質(zhì)的一種或多種馬鈴薯、香蕉、蘋果、山芋、芋艿、蠶豆及蘑菇。
9.如權(quán)利要求5所述的用無載體固定化酶去除酚類污染物的方法，其特征在于，所述4°C下攪拌反應(yīng)的時間為16小時。
10.如權(quán)利要求5所述的用無載體固定化酶去除酚類污染物的方法，其特征在于，所述用磷酸緩沖液清洗顆粒的步驟包括用摩爾濃度為50毫摩爾每升，pH值為6. O的磷酸緩沖液清洗所述顆粒。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用無載體固定化酶去除酚類污染物的方法,該方法利用一種酚類污染物處理劑處理酚類污染物，酚類污染物處理劑含有無載體固定化酪氨酸酶，酚類污染物含有酚類化合物，酚類污染物處理劑利用無載體固定化酪氨酸酶將酚類化合物催化反應(yīng)生成對應(yīng)的醌類化合物，以去除酚類化合物。本發(fā)明用無載體固定化酶去除酚類污染物的方法能非常有效地從含酚污水中把酚類化合物除去，其處理效果和重復(fù)利用率相對于其他酶法處理酚類污染物有顯著的提升。本發(fā)明方法成本低廉,且能大大降低含酚污水的生物毒性。
文檔編號C12N11/00GK102942248SQ20121040090
公開日2013年2月27日 申請日期2012年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月19日
發(fā)明者楊縝, 徐大友 申請人:深圳大學(xué)