專利名稱：一種預(yù)測前列腺癌易感性的檢測試劑和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種預(yù)測前列腺癌易感性的檢測試劑和方法，更具體的說是通過測定與前列腺癌相關(guān)基因GPRC6A的第二外顯子上rs2274911位點多態(tài)性預(yù)測受試者對于前列腺癌的易感性，該方法可用于疾病的輔助診斷和新藥開發(fā)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
前列腺癌(prostate cancer, PCa)是發(fā)生在男性生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤。美國在對1975-2006癌癥發(fā)病率進行統(tǒng)計后，估算2010年P(guān)Ca新發(fā)病例為217，730例，位居男性好發(fā)腫瘤中第一位，PCa的死亡人數(shù)估計為32，050，在男性腫瘤死亡率中位居第二。年齡是PCa的一個重要風險因素，年齡45歲以下的基本很少發(fā)病，隨年齡的增長而增加。美國癌癥協(xié)會統(tǒng)計，40歲以下的男性PCa發(fā)病率為1/8499,40-59歲男性中為1/38，60_69歲男性中為1/15，70歲以上男性中則為1/8。隨著我們國家人口老齡化，PCa的發(fā)病率在我國正逐年上升，上海標化發(fā)病率從1973 1975年的1. 8/10萬上升至1997 1999年的
5.5/10萬，貴州省南部地區(qū)部分縣市PCa的發(fā)病率已從1994 1998年的1. 72/10萬上升到2004 2008年的4. 28/10萬，成為威脅我國男性健康的公共問題。目前進行PCa遺傳病因研究，多采用大規(guī)模全基因組關(guān)聯(lián)研究和小樣本多人群中的驗證，并且GWAS鑒定的多個PCa易感SNPs已在多個不同人群中被復(fù)制確定，證明了 SNPs作為基因組標志的關(guān)聯(lián)分析方法在PCa遺傳研究中的有效性。SNPs是指染色體基因組水平上單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，在人群中的頻率需>1%，SNPs是雙等位基因標記，這種單堿基變化中有70. 1%為同型堿基之間的轉(zhuǎn)換如G/A或T/C，29. 1%為發(fā)生在嘌呤和嘧啶之間的顛換。SNPs包含了已知多態(tài)性的80-90%，是最常見的遺傳變異。由于生存的選擇壓力導(dǎo)致SNP在單一基因和整個基因組中的分布呈不均勻性。SNPs在基因非編碼區(qū)的數(shù)量是編碼區(qū)的4倍，總數(shù)可達3百萬個。SNPs以其密度高(平均每Ikb就有I個)、代表性強(位于基因內(nèi)部的SNPs可能直接影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或表達水平)、遺傳穩(wěn)定性好(同微衛(wèi)星多態(tài)性比較而言)、易于自動化分析(因SNPs在人群中為雙等位基因標記，可簡單以“+ / -或1/0”直接分型)等特點成為很好的遺傳標志。GPRC6A(G蛋白偶聯(lián)受體C家族6組A亞型)(G protein-coupled receptor, family
C,group 6, member A,GPRC6A)基因是Wellendorph P等在2004年發(fā)現(xiàn)提出的，編碼G蛋白偶聯(lián)受體C家族6組A成員,G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors, GPCRs)是一類有7次跨膜區(qū)域，是人類基因組上由約近千個基因編碼的大的受體家族，在許多生理病理進程包括發(fā)育、造血、血管生成、炎癥、精神障礙、代謝疾病及病毒感染等中起重要作用。研究表明許多GPCRs和他們的配體參與腫瘤發(fā)生發(fā)展，如內(nèi)皮縮血管肽類通過與GPCRs相互作用介導(dǎo)組織分化、發(fā)育和細胞增殖，通過增強細胞增殖抑制凋亡和調(diào)節(jié)基質(zhì)成分在PCa和其他腫瘤中起重要作用。許多趨化因子受體如CXCR4、CXCR2、CCR7等在許多腫瘤表達上調(diào)，在腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移中起重要作用。許多被稱為內(nèi)皮分化基因家族的GPCRs是溶血磷脂酸或鞘氨醇-1-磷酸鹽的受體，調(diào)節(jié)細胞的增殖、遷移和生存。如肺腺癌或肺腺癌3期時許多化學因子受體、神經(jīng)肽受體、激素受體等PAR2 (GPRll)、Edg2 (GPR2)等GPCRs表達上調(diào)；乳腺癌或乳腺癌3期時PAR2和CXCR-4表達增加；PCa時CXCR_3、GPR68等在PCa組織表達高于正常前列腺組織，其他腫瘤胃癌、轉(zhuǎn)移黑色素瘤等的發(fā)展中也有多種GPCRs參與。據(jù)估計，市場上接近30%的藥物靶標是GPCRs或者與其相關(guān)的信號通路，其研發(fā)依據(jù)部分為許多疾病與GPCRs的變異和多態(tài)性關(guān)聯(lián)，因此研究GPCRs與腫瘤包括GPCRs的多態(tài)性與腫瘤的關(guān)聯(lián)可以為以干擾GPCRs或其介導(dǎo)的信號通路為基礎(chǔ)的藥物研發(fā)提供理論依據(jù)。GPRC6A基因的功能已有研究，GPRC6A廣泛表達在腦和外周組織，在睪丸、腎臟、骨骼肌中高表達。GPRC6A敲除的小鼠表現(xiàn)為代謝綜合征成骨細胞缺陷介導(dǎo)的骨鈣化，腎臟處理鈣磷異常，脂肪肝，糖耐受和類固醇合成紊亂等性狀。最近的體內(nèi)體外GPRC6A功能研究也表明其是一個調(diào)節(jié)PCa生長和腫瘤發(fā)展相關(guān)的靶分子。再者，GPRC6A是骨-胰腺分泌環(huán)中調(diào)節(jié)骨鈣素應(yīng)答的基因，骨-胰腺分泌環(huán)調(diào)節(jié)胰島素信號通路，而胰島素受體和胰島素樣生長因子也在許多研究中被證明與PCa相關(guān)。從GPRC6A可以調(diào)節(jié)激素和影響胰島素信號通路這兩方面支持基因上位點的變異可能會影響PCa的易感性。2010年，Takata R等鑒定了位于RFX6基因上的rs339331和PCa風險關(guān)聯(lián)，此后，此位點在歐洲人群和中國人群中復(fù)制驗證。結(jié)合以上對GPRC6A功能的分析，我們推測GPRC6A基因為PCa易感基因并且選擇了位于其外顯子的rs2274911，在273個PCa患者和606個對照人群中分型后進行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果確定了 rs2274911與中國人群PCa關(guān)聯(lián)。

rs2274911在染色體上位置為117，237，396，位于GPRC6A的第二外顯子上，該外顯子有304個bp，rs2274911是距離該外顯子5’端76bp的SNP位點，此位點所在基因組位置可能會導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄mRNA，及翻譯氨基酸序列發(fā)生改變，進而影響蛋白質(zhì)行使功能。經(jīng)查詢檢索，截至目前，GPRC6A基因rs2274911與PCa風險還未見有報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供一種檢測前列腺癌易感性基因的方法。本發(fā)明的第二個目的是提供一種檢測前列腺癌易感性基因的試劑，包括PCR引物和含有該引物的試劑盒。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種檢測前列腺癌易感性的核苷酸序列，為序列表SEQ ID No.1所示核苷酸序列。所述核苷酸序列為GPRC6A基因第二外顯子上包含單苷酸多態(tài)性位點rs2274911的核苷酸片段。圖1為GPRC6A基因結(jié)構(gòu)及rs2274911多態(tài)性變異位點的示意圖，GPRC6A基因包含有6個外顯子，rs2274911位點標在GPRC6A基因圖中第6外顯子相應(yīng)位置。所述單苷酸多態(tài)性位點rs2274911的基因型為TT時，前列腺癌易感性最高；基因型為TC或CC時，前列腺癌易感性較低。一組檢測前列腺癌易感性的引物，能擴增得到GPRC6A基因第二外顯子上包含單苷酸多態(tài)性位點rs2274911的檢測前列腺癌易感性的核苷酸序列。所述引物的核苷酸序列分別為序列表SEQ ID No. 2和序列表SEQ ID No. 3所示。一種前列腺癌易感性基因的檢測方法，包括如下步驟(I)抽提樣品的基因組DNA，擴增GPRC6A基因第二外顯子包含單苷酸多態(tài)性位點rs2274911的核苷酸片段；(2)檢測步驟(I)產(chǎn)物中單苷酸多態(tài)性位點rs2274911的基因型，基因型為TT時，前列腺癌易感性最高；基因型為TC或CC時，前列腺癌易感性較低。所述步驟(I)中的核苷酸片段為序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，rs2274911位點位于該核苷酸序列的+501位。所述擴增GPRC6A基因第二外顯子的包含單苷酸多態(tài)性位點rs2274911的核苷酸片段，使用的一組引物的核苷酸序列分別為序列表SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示。本發(fā)明提供了一種檢測前列腺癌易感性的診斷試劑盒，其中含有本發(fā)明特異性擴增GPRC6A基因外顯子rs2274911位點的引物對和用于PCR擴增檢測的試劑盒的常規(guī)組件、試劑、緩沖液等，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知這些常規(guī)組件和檢測方法。本發(fā)明試劑盒中的全部組分、含量、來源和使用方法如下一種預(yù)測PCa的試劑盒，供10人份檢測應(yīng)用，由以下試劑組成IOu L 10XPCR 緩沖液(購自 Pharmacia)，2 U L IOmM dNTP 混合液(購自 Pharmacia),2 u L Taq DNA 聚合酶(2unit/U L)(購自 Takara),IuL Fl引物，為SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，濃度為lOpmol/ii L ；IuL Rl引物，為SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列，濃度為lOpmol/ii L ；8u L lOXL C-green PLUS飽和熒光染料；(購自美國Idaho公司)2 u L寡核苷酸內(nèi)參引物各0. 5 u L，濃度為lOpmol/ii L，其中低溫內(nèi)參引物F為SEQID NO. 4所示的核苷酸序列，低溫內(nèi)參引物R為SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列，高溫內(nèi)參引物F為SEQ ID NO. 6所示的序列，高溫內(nèi)參引物R為SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列；64 ii L 純水。使用方法I) PCR擴增通過PCR擴增GPRC6A基因的外顯子部分片段，制備混合液=IOXPCR反應(yīng)緩沖液 Iu L，10mmol/L dNTP 0. 2 u L, Taq DNA 聚合酶 0. 2 y L，10pmol/L 上游引物0. 11^，10 11101/1下游引物0.1uLjIOXLC Green PLUS飽和熒光染料0. 8 y L，寡核苷酸內(nèi)參0. 2 ii L (高、低溫寡核苷酸內(nèi)參上、下游引物各0. 05 ii L)(序列見表1)，基因組DNAl ii L，加去離子水至10 u L0 PCR反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min，95°C變性lmin，54°C退火30s，72°C延伸6s，總共45個循環(huán)，72°C總延伸7min。在進行高分辨熔解曲線分析之前，進行變性和復(fù)性處理95°C 30s, 25 °C 2min，94°C 30s，24°C 4min。PCR 時于每一體系中加入 20 yl 的石蠟油，以防止液體揮發(fā)。2)基因型判定將PCR產(chǎn)物移入HRM專用96孔板內(nèi)，在Light scanner TMHR-196上進行HRM分析，用Light Scanner Call IT軟件對采集后的曲線進行分析，根據(jù)熔解曲線的差異判定基因型。GPRC6A基因第二外顯子單苷酸多態(tài)性位點rs2274911在制備診斷或治療前列腺癌的試劑或藥物中的用途。本發(fā)明的測定方法測定了來源于人的基因組DNA，樣品沒有限制，如體液(血液、腹水及尿液等)、組織細胞(如肝組織)等。通過提取和純化這些樣品可制備基因組DNA。調(diào)整基因組DNA的濃度，使其盡可能的一致。以基因組DNA為模板，可擴增出含GPRC6A外顯子突變位點rs2274911的核酸片段，以獲取測定的大量樣本。這種通過擴增含GPRC6A外顯子突變點的DNA片段獲得的樣品，特別適于用作測定材料。在進行基因輔助診斷時，本發(fā)明優(yōu)先適用于測定根據(jù)GPRC6A外顯子突變位點rs2274911突變類型存在的輔助診斷試劑，輔助診斷試劑包括作為必要成分的特定試劑，其對應(yīng)于用于測定rs2274911基因突變類型的方法。按采用的測定方法來選擇適當?shù)奶囟ㄔ噭?，如DNA片段和/或用于PCR擴增步驟的引物。本發(fā)明的優(yōu)點是本發(fā)明首次闡明了 GPRC6A外顯子rs2274911多態(tài)性位點與PCa的相關(guān)性，提供了一種預(yù)測PCa易感性的方法和檢測試劑盒，該方法可用于PCa的預(yù)防、輔助診斷，還可以用于新藥研發(fā)。下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步敘述，以便公眾對發(fā)明內(nèi)容有更深入的了解，并非對本發(fā)明的限制，凡依照本發(fā)明公開內(nèi)容所做的任何本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。


圖1為GPRC6A基因結(jié)構(gòu)及外顯子多態(tài)性變異位點的示意2為GPRC6A基因外顯子r s2274911位點經(jīng)HRM分型溶解曲線3為GPRC6A基因外顯子rs2274911位點的測序圖
具體實施例方式用于下列實施例中表示試劑的英文縮寫如下10XPCR 緩沖液10mM Tris-HCI (pH=8. 3)，500mM 氯化鉀(KCI )，IOmM 氯化鎂(MgCI2),0. 01%(W/V)白明膠dNTP :脫氧核苷三磷酸EDTA 乙二胺四乙酸二鈉TE IOmM Tris-HCI (pH=7. 5)，ImM EDTA (pH=8. 0)實施例1 :血液樣本收集和基因組DNA的提取(I)PCa患者均經(jīng)組織病理學診斷，共選取來自北京和天津地區(qū)無血緣關(guān)系的PCa患者273例(年齡46 - 93歲，平均72. 3歲)，同地區(qū)的年齡匹配的對照606例(年齡58 - 94歲，平均70.4歲)，均為男性，無PCa家族史、DRE陰性并且PSA〈4ng/mL。所有受檢者均為漢族且簽署書面知情同意書，這項研究得到衛(wèi)生部北京醫(yī)院，衛(wèi)生部老年醫(yī)學研究所倫理審核委員會的認可，符合世界醫(yī)學會赫爾辛基宣言人體醫(yī)學研究的倫理原則。(2)根據(jù)下列方法，制備人基因組DNA。①首先在已標號的1.5mLEP管中加1000 y L紅細胞裂解液，后加入400 u LEDTA抗凝血(抗凝血加入前顛倒混勻3_5次)，顛倒混勻，室溫靜置10分鐘；②13000rpm離心30秒后，除去上清液；③在所得沉淀中加480 U I核酸裂解液，彈擊管壁，充分混勻后加入20ii L蛋白酶K (用裂核液稀釋20倍稀釋蛋白酶K)，顛倒混勻，65°C孵箱10分鐘，(期間不時上下混勻，確保無凝塊)；④取出后降至室溫，加300y L蛋白沉淀液，充分顛倒混勻，靜置10分鐘，13000rpm離心2分鐘；⑤將上清液移至新EP管中，加入670 u L預(yù)冷的異丙醇，充分顛倒混勻(10次以上)，可見線狀DNA逐漸形成小團塊，13000rpm離心2分鐘；⑥棄上清液并確保沉淀留在EP中，加入670 u L 70%乙醇，上下顛倒混勻，13000rpm離心2分鐘；⑦棄上清，使管內(nèi)乙醇揮發(fā)干凈；⑧加入TE溶解液(400 u L)，充分溶解，然后對提取的基因組DNA進行濃度和純度的分析，吸取部分DNA溶液作為工作液，濃度校正至20ng/ ii L，放置于4°C備用，剩余基因組DNA置-20°C冰箱保存。實施例2 SNP的識別鑒定本發(fā)明采用PCR-高分辨率溶解曲線(HRM)分析法和PCR測序技術(shù)同時對GPRC6A的外顯子基因區(qū)的rs2274911位點(其等位位點為T/C)的基因型進行檢測。I) PCR-HRM弓丨物的確定從Genebank中查取rs2274911附近的DNA堿基序列(SEQ ID NO.1),引物設(shè)計在Oligo 6. 0和primer5. 0軟件下完成。目的片段定位在GPRC6A基因外顯子區(qū),全長72bp,確定了正義鏈Fl (+450bp—+467bp)與反義鏈Rl (+504bp—+521bp)，特異性引物序列如下Fl :5’ -ACTCTTGCCATGATACAC-3’ (SEQ ID NO. 2)Rl :5’ -ATACCCCAGTTTGACTCC-3’ (SEQ ID NO. 3)2 ) PCR-HRM反應(yīng)體系及條件通過PCR擴增GPRC6A的外顯子基因區(qū)的rs2274911位點所在片段，PCR反應(yīng)體系為10XPCR 反應(yīng)緩沖液 I ii L，10mmol/L dNTP 0. 2 u L, Taq DNA 聚合酶 0. 2 y L，10pmol/L上游引物0. 11^，10 11101/1下游引物0.1uLjIOXLC Green PLUS飽和熒光染料0. 8 y L，寡核苷酸內(nèi)參0. 2 L (高、低溫寡核苷酸內(nèi)參上、下游引物各0. 05 L，3’端C3封閉，阻止延伸，見表I),基因組DNA I ii L，加去離子水至IOii L。PCR時于每一體系中加入20 ii I的石蠟油，防止液體揮發(fā)。PCR反應(yīng)條件`為95°C預(yù)變性5min，95°C變性lmin，54°C退火30s，72°C延伸6s，總共45個循環(huán)，72°C總延伸7min。在進行高分辨熔解曲線分析之前，進行變性和復(fù)性處理95°C 30s, 25°C 2min,94°C 30s,24°C 4min。表I高、低溫寡核苷酸內(nèi)參引物序列、退火溫度及產(chǎn)物片段長度
權(quán)利要求
1.一種檢測前列腺癌易感性的核苷酸序列，其特征在于為序列表SEQ ID No.1所示核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測前列腺癌易感性的核苷酸序列，其特征在于所述核苷酸序列為GPRC6A基因第二外顯子上包含單苷酸多態(tài)性位點rs2274911的核苷酸片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測前列腺癌易感性的核苷酸序列，其特征在于所述單苷酸多態(tài)性位點rs2274911的基因型為TT時，前列腺癌易感性最高；基因型為TC或CC時，前列腺癌易感性較低。
4.一組檢測前列腺癌易感性的引物，其特征在于能擴增得到權(quán)利要求1所述的檢測前列腺癌易感性的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一組檢測前列腺癌易感性的引物，其特征在于所述引物的核苷酸序列分別為序列表SEQ ID No. 2和序列表SEQ ID No. 3所示。
6.一種前列腺癌易感性基因的檢測方法，其特征在于包括如下步驟 (1)抽提樣品的基因組DNA，擴增GPRC6A基因第二外顯子包含單苷酸多態(tài)性位點rs2274911的核苷酸片段； (2)檢測步驟(I)產(chǎn)物中單苷酸多態(tài)性位點rs2274911的基因型，基因型為TT時，前列腺癌易感性最高；基因型為TC或CC時，前列腺癌易感性較低。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的前列腺癌易感性基因的檢測方法，其特征在于所述步驟(I)中的核苷酸片段為序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，rs2274911位點位于該核苷酸序列的+501位。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的前列腺癌易感性基因的檢測方法，其特征在于所述擴增GPRC6A基因第二外顯子的包含單苷酸多態(tài)性位點rs2274911的核苷酸片段，使用的一組引物的核苷酸序列分別為序列表SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示。
9.一種檢測前列腺癌易感基因的試劑盒，其特征在于由以下試劑組成 IOu L 10 X PCR 緩沖液； 2u L IOmM dNTP 混合液；2u L Taq DNA 聚合酶，2unit/ U L ； IuL Fl引物，為SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列，濃度為lOpmol/y L ; IuL Rl引物，為SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，濃度為lOpmol/u L ； 8u L lOXLC-green PLUS 飽和熒光染料； 2 u L寡核苷酸內(nèi)參引物各0. 5 ii L，濃度為lOpmol/ u L，其中低溫內(nèi)參引物F為SEQ IDNO. 4所示的核苷酸序列，低溫內(nèi)參引物R為SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列，高溫內(nèi)參引物F為SEQ ID NO. 6所示的序列，高溫內(nèi)參引物R為SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列；64 ii L純水。
10.GPRC6A基因第二外顯子單苷酸多態(tài)性位點rs2274911在制備診斷或治療前列腺癌的試劑或藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種預(yù)測前列腺癌易感性的檢測試劑和方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過提取宿主細胞的基因組DNA，測定受試者的GPRC6A基因第二外顯子上rs2274911位點的基因型，預(yù)測受試者對前列腺癌的易感性；GPRC6A基因外顯子上rs2274911的基因型為TT時，受試者的易感性最高；rs2274911的基因型為TC或CC時，受試者的易感性較低。本發(fā)明的優(yōu)點是首次闡述了rs2274911基因多態(tài)性位點與前列腺癌的相關(guān)性，提供了一種預(yù)測前列腺癌易感性的方法，該方法可用于前列腺癌的早期預(yù)防診斷、輔助診斷，還可以用于新藥研發(fā)。
文檔編號C12N15/12GK103060329SQ20121039866
公開日2013年4月24日 申請日期2012年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月19日
發(fā)明者楊澤, 趙承孝, 劉銘, 王建業(yè), 史曉紅, 魏東, 朱小泉, 楊帆, 張耀光, 梁思穎, 王飛, 唐雷, 孫亮 申請人:衛(wèi)生部北京醫(yī)院