一種高特異高敏感檢測(cè)沙門(mén)氏菌的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種高特異高敏感檢測(cè)沙門(mén)氏菌的方法，包括以下步驟：步驟1）制備反應(yīng)液；步驟2）將上述反應(yīng)液放入63℃烘箱進(jìn)行反應(yīng)30-60min，渾濁為陽(yáng)性;步驟3）使用臨床分離沙門(mén)氏菌，臨床分離金黃色葡萄球菌以及若干臨床分離頭皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草綠色鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯菌的核酸，進(jìn)行反應(yīng)，觀察它們的陰陽(yáng)性。本發(fā)明通過(guò)配制反應(yīng)液，設(shè)計(jì)引物序列，能快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)沙門(mén)氏菌，并及時(shí)采取相應(yīng)的措施，減少了疾病的發(fā)生率。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種高特異高敏感檢測(cè)沙門(mén)氏菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及疾病檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說(shuō)，是一種高特異高敏感檢測(cè)沙門(mén)氏菌的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]沙門(mén)氏菌病是公共衛(wèi)生學(xué)上具有重要意義的人畜共患病之一，其病原沙門(mén)氏菌屬腸道細(xì)菌科，包括那些引起食物中毒，導(dǎo)致胃腸炎、傷寒和副傷寒的細(xì)菌。它們除可感染人外，還可感染很多動(dòng)物包括哺乳類(lèi)、鳥(niǎo)、爬行類(lèi)、魚(yú)、兩棲類(lèi)及昆蟲(chóng)。人畜感染后可呈無(wú)癥狀帶菌狀態(tài)，也可表現(xiàn)為有臨床癥狀的致死疾病，它可能加重病態(tài)或死亡率，或者降低動(dòng)物的繁殖生產(chǎn)力。據(jù)統(tǒng)計(jì)在世界各國(guó)的種類(lèi)細(xì)菌性食物中毒中，沙門(mén)氏菌引起的食物中毒常列榜首。中國(guó)內(nèi)陸地區(qū)也以沙門(mén)氏菌為首位。急需特異性和敏感度高的快速診斷試劑。
[0003]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是由日本榮研(EIKEN)株式會(huì)社開(kāi)發(fā)的高特異性敏感度的核酸檢測(cè)系統(tǒng)，無(wú)須昂貴的設(shè)備，已經(jīng)成為核酸快速檢測(cè)法的良好手段，本發(fā)明結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，設(shè)計(jì)針對(duì)沙門(mén)氏菌特異性基因序列的一對(duì)外引物(SAL-F3和SAL-B3)和一對(duì)內(nèi)引物(SAL-FIP和SAL-BIP)進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明公開(kāi)了一種高特異高敏感檢測(cè)沙門(mén)氏菌的方法，提高了沙門(mén)氏菌的檢測(cè)和診斷效率。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
一種高特異高敏感檢測(cè)沙門(mén)氏菌的方法，包括以下步驟:
步驟I)制備反應(yīng)液 反應(yīng)液組成及含量為
8u/ul Bst核酸聚合酶8u
10X耐熱聚合酶反應(yīng)緩沖液lX，MgS04 2mM
4M甜菜堿IM
10mM d-NTP 混合液400 μ M
內(nèi)引物
SAL-FIP40umol
SAL-BIP40umol
外引物
SAL-F35umol
SAL-B35umol
標(biāo)本核酸20ng
添加焦碳酸二乙酯處理水至總量達(dá)到25ul ；
步驟2)將上述反應(yīng)液放入63°C烘箱進(jìn)行反應(yīng)30-60min，渾濁為陽(yáng)性；步驟3)使用臨床分離沙門(mén)氏菌，臨床分離金黃色葡萄球菌以及若干臨床分離頭皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草綠色鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯菌的核酸，進(jìn)行反應(yīng)，觀察它們的陰陽(yáng)性。
[0006]進(jìn)一步的，所述外引物SalF3的序列為GCTTGTGATTACTGCGAC。
[0007]進(jìn)一步的，所述外引物SalB3的序列為ACGATTGAACGGAGCAAC。
進(jìn)一步的，所述內(nèi)引物SalFIP的序列為 CCTGACTTATAGAGTGTAAGCGGAT-AGGTGCAATAAAGATAACCCGo
[0008]進(jìn)一步的，所述內(nèi)引物SalBIP 的序列為 GATGGGGATGTTTGGCCAAGT-TGAATGCCAATTTGTCGG。
[0009]進(jìn)一步的，所述反應(yīng)液中加入熒光顯示物質(zhì)溴化乙錠、鈣黃綠素進(jìn)行實(shí)時(shí)檢查。
[0010]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明通過(guò)配制反應(yīng)液，設(shè)計(jì)引物序列，能快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)沙門(mén)氏菌，并及時(shí)采取相應(yīng)的措施，減少了疾病的發(fā)生率。
【具體實(shí)施方式】
[0011]下面將結(jié)合實(shí)施例，來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
[0012]一種高特異高敏感檢測(cè)沙門(mén)氏菌的方法，包括以下步驟:
步驟I)制備反應(yīng)液`
反應(yīng)液組成及含量為
8u/ul Bst核酸聚合酶8u
IOX耐熱聚合酶反應(yīng)緩沖液lX，MgS04 2mM
4M甜菜堿IM
IOmM d-NTP 混合液400 μ M
內(nèi)引物
SAL-FIP40umol
SAL-BIP40umol
外引物
SAL-F35umol
SAL-B35umol
標(biāo)本核酸20ng
添加焦碳酸二乙酯處理水至總量達(dá)到25ul。
[0013]選取沙門(mén)氏菌特異性基因基因(基因序列來(lái)源美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心-NCBI)，設(shè)計(jì)引物序列，所述外引物SalF3的序列為GCTTGTGATTACTGCGAC，所述外引物SalB3的序列為ACGATTGAACGGAGCAAC，所述內(nèi)引物SalFIP的序列為
CCTGACTTATAGAGTGTAAGCGGAT-AGGTGCAATAAAGATAACCCG,所述內(nèi)引物 SalBIP 的序列為GATGGGGATGTTTGGCCAAGT-TGAATGCCAATTTGTCGGo
[0014]進(jìn)一步的，所述反應(yīng)液中加入熒光顯示物質(zhì)溴化乙錠、鈣黃綠素進(jìn)行實(shí)時(shí)檢查。
[0015]步驟2)將上述反應(yīng)液放入63°C烘箱進(jìn)行反應(yīng)30-60min，渾濁為陽(yáng)性；
步驟3)使用臨床分離沙門(mén)氏菌3株核酸(由蘇州疾病控制中心和蘇州第五人民醫(yī)院提供)，臨床分離金黃色葡萄球菌以及若干臨床分離頭皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草綠色鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯菌的核酸，進(jìn)行反應(yīng)，觀察它們的陰陽(yáng)性。結(jié)果顯示:3株沙門(mén)氏菌核酸均為陽(yáng)性，其余菌種為陰性。
[0016]以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含`在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種高特異高敏感檢測(cè)沙門(mén)氏菌的方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟I)制備反應(yīng)液 反應(yīng)液組成及含量為 8u/ul Bst核酸聚合酶8u IOX耐熱聚合酶反應(yīng)緩沖液lX，MgS04 2mM4M甜菜堿IM IOmM d-NTP 混合液400 μ M 內(nèi)引物 SAL-FIP40umol SAL-BIP 40umol 外引物 SAL-F35umol SAL-B35umol標(biāo)本核酸20ng 添加焦碳酸二乙酯處理水至總量達(dá)到25ul ； 步驟2)將上述反應(yīng)液放入63°C烘箱進(jìn)行反應(yīng)30-60min，渾濁為陽(yáng)性； 步驟3)使用臨床分離沙門(mén)氏菌，臨床分離金黃色葡萄球菌以及若干臨床分離頭皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草綠色鏈球菌、大腸桿菌、克雷伯菌的核酸，進(jìn)行反應(yīng)，觀察它們的陰陽(yáng)性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高特異高敏感檢測(cè)沙門(mén)氏菌的方法，其特征在于:所述外引物 SalF3 的序列為 GCTTGTGATTACTGCGAC。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的高特異高敏感檢測(cè)沙門(mén)氏菌的方法，其特征在于:所述外引物 SalB3 的序列為 ACGATTGAACGGAGCAAC。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高特異高敏感檢測(cè)沙門(mén)氏菌的方法，其特征在于:所述內(nèi)引物SalFIP的序列為
CCTGACTTATAGAGTGTAAGCGGAT-AGGTGCAATAAAGATAACCCGo
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的高特異高敏感檢測(cè)沙門(mén)氏菌的方法，其特征在于:所述內(nèi)引物 SalBIP 的序列為 GATGGGGATGTTTGGCCAAGT-TGAATGCCAAITTGTCGG。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高特異高敏感檢測(cè)沙門(mén)氏菌的方法，其特征在于:所述反應(yīng)液中加入熒光顯示物質(zhì)溴化乙錠、鈣黃綠素進(jìn)行實(shí)時(shí)檢查。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103725755SQ201210380666
【公開(kāi)日】2014年4月16日 申請(qǐng)日期:2012年10月10日 優(yōu)先權(quán)日:2012年10月10日
【發(fā)明者】金京勛, 沈強(qiáng), 黃政新, 沈永林, 賈宇玲, 趙靜, 薛婧, 橫山英樹(shù), 大木裕信 申請(qǐng)人:蘇州四同醫(yī)藥科技有限公司