專利名稱：水稻植酸相關(guān)基因zju-lpa1及培育低植酸水稻的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體的說，本發(fā)明涉及一種利用圖位克隆技術(shù)克隆的水稻植酸相關(guān)基因ZJU-LPAl以及利用該基因培育低植酸水稻的方法。
背景技術(shù)：
植酸是作物種子中最豐富的磷的貯存形式，占種子中全磷量的65 85%。植酸可與Zn2+、Fe3+、Ca2+等金屬陽離子螯合成植酸鹽，難以被人和非反芻動物(豬、雞、魚等)消化利用，降低了磷元素以及與之結(jié)合的微量元素、蛋白和淀粉的生物有效性，被認(rèn)為是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子；此外，植酸還對生態(tài)環(huán)境具有負(fù)面效應(yīng)，可引起湖泊等水系的富營養(yǎng)化。因此，降低植酸的含量成為育種學(xué)家、營養(yǎng)學(xué)家和環(huán)境學(xué)家關(guān)注的焦點之一。運用理化誘變和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，獲得種子中植酸含量下降的低植酸(LPA)作物，可從源頭上解決上述問題。
迄今，國內(nèi)外已在水稻、大豆、玉米、大麥、小麥等作物中獲得了一批LPA突變體，這些突變體不僅為LPA作物品種的選育及應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)，也為進(jìn)行LPA突變基因的定位、克隆研究提供了理想材料。利用正向(圖位克隆)或反向遺傳學(xué)(RNAi，T-DNA插入突變)技術(shù)，已克隆了若干LPA基因，揭示了 LPA突變發(fā)生的分子機(jī)制。植物體內(nèi)的植酸代謝較為復(fù)雜，迄今還未明確。其合成代謝的大致途徑如下葡萄糖-6-磷酸在肌醇-3-磷酸合成酶(MIPS)的催化下生成肌醇-3-磷酸[Ins (3) P1],接著在肌醇單磷酸酶的作用下生成肌醇和無機(jī)磷；后期為肌醇磷酸化/焦磷酸肌醇-磷酸化階段，即肌醇和磷通過脂依賴和/或非脂依賴途徑生成三磷酸肌醇，三磷酸肌醇經(jīng)連續(xù)的磷酸化最終生成植酸。因此，植酸代謝或運輸途徑中任一基因突變或沉默均會導(dǎo)致降低植酸含量。如大豆和水稻中MIPS基因的沉默；水稻和玉米中肌醇激酶(MIK)的突變；玉米、擬南芥和大豆中肌醇單磷酸激酶(IPK)的突變；玉米、大豆和水稻中植酸運輸相關(guān)基因(MPR)基因的突變；水稻中與擬南芥中2-膦酸甘油酸激酶(2-PGK)同源基因的突變。我國是稻米生產(chǎn)和消費的大國，也是鐵缺乏和缺鐵性貧血發(fā)生較嚴(yán)重的國家之一，培育具有營養(yǎng)與環(huán)保雙重功能的LPA水稻在我國尤為重要。而獲得具有自主知識產(chǎn)權(quán)的LPA相關(guān)新基因，則為通過傳統(tǒng)育種手段或現(xiàn)代反向遺傳學(xué)技術(shù)培育LPA水稻新品種提供了必要的前提，也為闡明植酸合成代謝途徑奠定基礎(chǔ)，具有重要的理論與實踐意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種水稻植酸相關(guān)基因ZJU-LPA1，通過人工突變該基因或RNAi抑制該基因表達(dá)，可以有效降低水稻種子中的植酸含量。一種水稻植酸相關(guān)基因ZJU-LPAl，其堿基序列如SEQ ID NO. I所示。一種所述水稻植酸相關(guān)基因ZJU-LPAl編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ IDNO. 2所示。本發(fā)明還提供了一種培育低植酸水稻的方法，包括利用射線對水稻種子進(jìn)行射線誘變處理，種植若干代后，篩選水稻ZJU-LPAl基因表達(dá)框被破壞的純合型突變體；所述水稻ZJU-LPAl基因的堿基序列如SEQ ID NO. I所示。所述水稻種子的品種為三系晚秈恢復(fù)系“明恢86”和三系秈稻恢復(fù)系“中9B”。所述射線為137Cs-Y射線。所述射線誘變劑量為300Gy。本發(fā)明提供了另一種培育低植酸水稻的方法，包括(I)構(gòu)建ZJU-LPAl基因RNAi的發(fā)夾結(jié)構(gòu)單元；(2)將所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)單元連入中間載體，構(gòu)建植物表達(dá)載體；(3)將所述植物表達(dá)載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織；(4)將水稻愈傷組織轉(zhuǎn)移到選擇性培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，待分化成苗，移栽大田，篩選獲得低植酸水稻植株。所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)單元包括中間的內(nèi)含子及兩端的目的基因片段和目的基因片段的反向互補(bǔ)片段，所述目的基因片段為ZJU-LPAl基因CDS序列的部分序列，ZJU-LPAl基因CDS堿基序列如SEQ ID No.3所示，內(nèi)含子在本發(fā)明中沒有特異性的要求，它可以是來自pSSK-IN載體，堿基序列如SEQ ID NO. 24所示。擴(kuò)增所述目的基因片段的引物為RiF :5’ -CAGTTGGTAGGACATTTGCTTCA-3’ ；RiR : 5 ’ -TGCCTTTGATGTTCCCTTGA-3，。優(yōu)選的，所述原始載體為pCAMBIA 1301-35SN。優(yōu)選的，將所述低植酸水稻植株種植若干代，獲得性狀穩(wěn)定的株系。本發(fā)明利用水稻低植酸突變體，通過圖位克隆方法在水稻中克隆到了水稻ZJU-LPAl基因，并通過互補(bǔ)實驗對基因功能進(jìn)行了驗證。該基因編碼含有SulfateTransporter和STAS兩個結(jié)構(gòu)域的表達(dá)蛋白，利用RNAi技術(shù)降低該基因的表達(dá),可以獲得水稻低植酸材料。該基因的克隆不僅豐富了植酸代謝的網(wǎng)絡(luò)途徑，也為利用該基因進(jìn)行水稻LPA育種和分子設(shè)計育種提供新的基因資源和理論指導(dǎo)。


圖I是水稻低植酸突變體、野生型及功能互補(bǔ)實驗T1代轉(zhuǎn)基因種子的無機(jī)磷比色。I :由上至下依次為5個標(biāo)準(zhǔn)P對照，含量依次為0.00 μ g、0. 15yg,0. 46yg,0. 93 μ g,
I.39 μ g ；2 :野生型明恢86 ；3 lpal ；4 :功能互補(bǔ)實驗T1種子；5 =RNAi T2代純合LPA植株種子圖2是ZJU-LPAl基因在水稻第4號染色體上的初步定位圖；圖3是ZJU-LPAl候選基因的克?。粓D4是轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體圖譜，A pCAMBIAl 301+Z JU-LPAl互補(bǔ)載體；B :pCAMBIA1301-35SN+RNAi 表達(dá)載體。
具體實施例方式實施例I、ZJU-LPAl基因的分離和克隆I、水稻低植酸突變體zju-lpal的獲得
水稻(Oryza sativa L.)低植酸突變體z ju_lpal,由三系晚秈恢復(fù)系明恢86 (MH86)通過300Gy的137Cs- Y射線誘變獲得。選育途徑如下2002年夏，輻照MH86水稻干種子，杭州種植混收M1:2種子；2003年夏，單株種植收獲M2:3種子，檢測無機(jī)磷(Pi)含量，篩選含高無機(jī)磷(HIP)籽粒植株7個；2004年冬海南陵水南繁基地加代獲得4個純合HIP株系，2個純合HIP植株，另I個材料仍在分離；2005年杭州夏繼續(xù)種植獲得2份純合HIP株系，I份純合HIP植株；上述材料擴(kuò)大種植形成7個HIP株系，依次命名為zju-lpal-Ι zju-lpal-7。等位性測驗表明zju-lpal-Ι zju_lpal_7之間相互等位,但與本實驗室獲得的另外3個低植酸材料互不等位，為I個新低植酸突變材料，該基因命名ZJU-LPA1。其等位突變體Z9_lpa為秈稻品種“中9B”通過300Gy137Cs-Y射線采用上述相似方法誘變篩選獲得。相比野生型，zju-lpal-Ι突變體植酸含量下降44%，無機(jī)磷含量升高3. 4倍，總磷含量基本不變(圖I)。Z9-lpa突變體植酸含量下降40%，無機(jī)磷含量升高 I. 5 倍，總磷含量基本不變(Liu, Q. L.，Xu, X. H.，Ren, X. L.，F(xiàn)u, H. ff.，Wu, D. X.，andShu, Q. Y. 2007.Generation and characterization of low phytic acid germplasm in rice (Oryza sativa L.). Theoretical and Applied Genetics 114(5) :803-814)。2、遺傳分析和定位群體構(gòu)建純合的zju-lpal-1突變體分別和正常表型粳稻品種日本晴和DHl進(jìn)行雜交，F(xiàn)1代自交，得到F2群體，在分蘗盛期每個單株標(biāo)記并取I克左右的嫩葉，然后單株收獲F2:3種子，鑰酸銨比色法檢測水稻種子的無機(jī)磷含量,每株檢測8粒。從中選出一共1181株LPA突變表型的個體為定位群體，找出對應(yīng)的編號葉片，用來提取總DNA。3、ZJU-LPAl 基因的定位采用水稻微量DNA提取法從水稻葉片中提取用于基因定位的基因組DNA。具體如下取約0. 2克水稻葉片放入I. 5ml離心管中并使用組織磨樣器將樣品磨碎，CTAB法提取總DNA，溶解在200 μ I滅菌超純水中作為DNA樣品，每個PCR反應(yīng)使用I. 5 μ I樣品。ZJU-LPAl基因的初步定位通過鑰酸銨無機(jī)磷比色法檢測上述定位群體的F2:3種子，首先選取197個隱性樣本，組成小群體，結(jié)合基因池法，進(jìn)行SSR多態(tài)性分析。根據(jù)公布的粳稻和秈稻創(chuàng)建的分子遺傳圖譜，選取平均分布在各染色體上的SSR引物，根據(jù)已知的反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系包括10 X PCR緩沖液2. O μ I (含Mg2+)，上、下游引物(濃度分別為 10 μ Μ)各 0. 4 μ 1，IOmM 的 dNTP 0. 4 μ 1，DNA 模板 I. 5 μ I ;0· 2 μ I 的 5U/TagDNA聚合酶，補(bǔ)滅菌水至20 μ I。PCR程序為94°C預(yù)變性5min ;然后94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，35個循環(huán)；最后72°C延伸7min。經(jīng)8 %的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色，檢測PCR產(chǎn)物的多態(tài)性，將ZJU-LPAl基因初步定位在水稻第4號染色體長臂上的RM5478和RM17567分子標(biāo)記之間(圖2)。ZJU-LPAl基因的精細(xì)定位從上述定位群體中，擴(kuò)大定位單株至1181株，在初步定位的基礎(chǔ)上繼續(xù)設(shè)計SSR、InDeUCAPS標(biāo)記，最終將ZJU-LPAl基因精確定位于BAC號為AL606690區(qū)段上112kb的范圍之內(nèi)，兩邊的分子標(biāo)記分別為CAPS3和ID26,并且與分子標(biāo)記CAPS2和ID19共分離(圖3)。表I、基因定位主要引物及其序列
權(quán)利要求
1.一種水稻植酸相關(guān)基因Zju-LPAl，其特征在于，堿基序列如SEQ ID NO. I所示。
2.一種如權(quán)利要求I所述水稻植酸相關(guān)基因ZJU-LPAl編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一種培育低植酸水稻的方法，包括 利用射線對水稻種子進(jìn)行射線誘變處理，種植若干代后，篩選水稻ZJU-LPAl基因表達(dá)框被破壞的純合型突變體； 所述水稻ZJU-LPAl基因的喊基序列如SEQ ID NO. I所不。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述水稻種子的品種為三系晚秈恢復(fù)系“明恢86”和三系秈稻恢復(fù)系“中9B”。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述射線為137Cs-Y射線。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述射線誘變劑量為300Gy。
7.一種培育低植酸水稻的方法，包括 (1)構(gòu)建ZJU-LPAl基因RNAi的發(fā)夾結(jié)構(gòu)單元； (2)將所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)單元連入原始載體，構(gòu)建植物表達(dá)載體； (3)將所述植物表達(dá)載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織； (4)將水稻愈傷組織轉(zhuǎn)移到選擇性培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，待分化成苗，移栽大田，篩選獲得低植酸水稻植株。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述原始載體為pCAMBIA1301-35SN。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，將所述低植酸水稻植株種植若干代，獲得性狀穩(wěn)定的株系。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種水稻植酸相關(guān)基因ZJU-LPA1及培育低植酸水稻的方法，該基因的堿基序列如SEQ ID NO.1所示；本發(fā)明還公開了培育低植酸水稻的方法，包括構(gòu)建包含水稻ZJU-LPA1基因的發(fā)夾結(jié)構(gòu)單元；將所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)單元連入原始載體，構(gòu)建植物表達(dá)載體；將所述植物表達(dá)載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織；將水稻愈傷組織轉(zhuǎn)移到選擇性培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，待分化成苗，移栽大田，篩選獲得低植酸水稻植株。該基因編碼含有Sulfate Transporter和STAS兩個結(jié)構(gòu)域的表達(dá)蛋白，不僅豐富了植酸代謝的網(wǎng)絡(luò)途徑，也為利用該基因進(jìn)行水稻LPA育種和分子設(shè)計育種提供新的基因資源和理論指導(dǎo)。
文檔編號C12N15/84GK102864156SQ20121036457
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月26日
發(fā)明者趙海軍, 舒慶堯, 劉慶龍, 崔海瑞, 李珊 申請人:浙江大學(xué)