專利名稱：一種人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞huvec的分離培養(yǎng)及傳代方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為ー種人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的分離、培養(yǎng)與傳代方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
ニ背景技術(shù)：
血管內(nèi)皮細(xì)胞具有多種生理功能，能產(chǎn)生和分泌許多生物活性物質(zhì)，在維持血管舒縮，抗凝血等方面起重要作用。體外血管內(nèi)皮細(xì)胞的成功培養(yǎng)是研究內(nèi)皮細(xì)胞功能及其在各種疾病發(fā)生發(fā)展中所起作用的基礎(chǔ)。從健康產(chǎn)婦正常娩出的胎盤端游離臍帶分離得到的人體臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)是廣泛用于實驗研究的血管內(nèi)皮細(xì)胞。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外生長能力較差，原代培養(yǎng)不易成功。以往主要是采用機械 分離法和組織塊移植法。將臍靜脈剪開，用手術(shù)刀背等刮取內(nèi)皮細(xì)胞或使用帶有尼龍篩的分離管，但這一方法很難掌握力度，用カ太輕，取得的細(xì)胞數(shù)量很少；用力太重，易混雜其他血管壁細(xì)胞如成纖維細(xì)胞等，而且此方法易損傷內(nèi)皮細(xì)胞。近幾年來人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分離已逐漸被酶消化法取代，此法獲得的細(xì)胞較純，且能較好地保持其生物活性。從保持細(xì)胞活性和結(jié)構(gòu)完整性來看，膠原酶被認(rèn)為是最理想的血管內(nèi)皮細(xì)胞分離酶，對細(xì)胞間質(zhì)有較強的消化作用，能使上皮細(xì)胞與膠原組織成功分離，且不損傷內(nèi)皮細(xì)胞，分離出的血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量多，雜細(xì)胞污染少，且細(xì)胞貼壁能力強。人體其它部位的血管內(nèi)皮細(xì)胞來源困難，本發(fā)明采用新鮮的健康產(chǎn)婦新生兒臍帶，采用膠原酶I型用消化分離得到臍靜脈內(nèi)皮原代細(xì)胞，經(jīng)濟實用，簡便易行，有利于獲得所需的體外實驗?zāi)Ｐ图?xì)胞，為進(jìn)一歩研究血管內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)特性及其與各種疾病的關(guān)系提供幫助。此外血管內(nèi)皮生長因子有助于培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞。小牛血清和谷氨酰胺，在維持內(nèi)皮細(xì)胞正常生長和形態(tài)結(jié)構(gòu)的前提下盡可能減少完全培養(yǎng)液的組分，能獲取足夠數(shù)量高純度可傳代的內(nèi)皮細(xì)胞，對內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)特性和心腦血管相關(guān)疾病的研究有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明主要是提供ー種人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的分離、培養(yǎng)與傳代方法。技術(shù)方案本發(fā)明主要是提供一種本發(fā)明為ー種人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的分離、培養(yǎng)與傳代方法，包括了以下步驟DHUVEC的分離取當(dāng)天新生兒15-20cm長的新鮮臍帶，放入無菌含雙抗的PBS溶液中4°C儲存；用一個鈍頭的針頭扎入臍帶靜脈管中，用無菌含雙抗的PBS溶液沖洗至流出液體中無可見血液；夾住臍帶下端，加入15ml的膠原酶I型(lmg/ml) 37°C水浴消化10-15分鐘；消化完后，將下端手術(shù)鉗松開，消化液流入ー個50ml無菌離心管中，用無菌含雙抗的PBS溶液沖洗臍帶2-3次；將收集液離心(2000轉(zhuǎn)/分)5分鐘；倒去上清，加入IOml M199培養(yǎng)基(含酚紅、20%新生小牛血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素、100 μ g/ml血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子-肝素)，用彎管吹散細(xì)胞，將所有液體轉(zhuǎn)入ー個用明膠包被好的培養(yǎng)瓶中，于CO2培養(yǎng)箱在37°C培養(yǎng)。2)HUVEC的培養(yǎng)=HUVEC細(xì)胞在37°C培養(yǎng)24小時后，倒掉培養(yǎng)基，并用無菌含雙抗的PBS溶液清洗2-3次，洗掉紅細(xì)胞和死細(xì)胞，加入IOml新鮮的M199培養(yǎng)基；以后每2天換一次培養(yǎng)基，一般培養(yǎng)5-7天，細(xì)胞可長滿至80-90%單層，正常的內(nèi)皮細(xì)胞長滿后如同卵石狀，這時可以傳代。3) HUVEC的傳代倒掉培養(yǎng)基，用無菌的PBS溶液清洗2_3次，加入2_3ml消化液(O. 25%胰酶+0. I % EDTA)消化細(xì)胞，在顯微鏡下觀察，一旦細(xì)胞變圓，即加入2_3倍的有血清的DMEM培養(yǎng)基終止反應(yīng)；用彎管將細(xì)胞吹打下來，并將所消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到ー個50ml無菌離心管中，2000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘；倒掉上清，加入20ml新鮮培養(yǎng)基，一般一瓶細(xì)胞可傳代2-3瓶。選擇傳代2-3代的HUVEC(培養(yǎng)了 20天左右)用于實驗。
有益效果本發(fā)明g在建立一種簡單、高效分離培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的方法。本方法選用臍帶作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的來源，不僅取材及操作方便，獲得細(xì)胞數(shù)多，且臍靜脈在很多方面具有與動脈生物學(xué)特性相似的優(yōu)點。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)ー步說明實施例I取當(dāng)天新生兒20cm長的新鮮臍帶，放入含雙抗的無菌PBS溶液中，4°C儲存；用一個鈍頭的針頭扎入臍帶靜脈管中，用PBS溶液沖洗至流出液體中無可見血液；夾住臍帶下端，加入15ml的膠原酶I型(lmg/ml) 37°C水浴消化15分鐘；消化完后，將下端手術(shù)鉗松開，消化液流入ー個50ml無菌離心管中，用PBS溶液沖洗臍帶3次；將收集液2000r/min離心5分鐘；倒去上清，加入IOml M199培養(yǎng)基(含酚紅、20%新生小牛血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素、100 μ g/ml血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子-肝素)，用彎管吹散細(xì)胞，將所有液體轉(zhuǎn)入ー個用明膠包被好的培養(yǎng)瓶中，于CO2培養(yǎng)箱在37°C培養(yǎng)。24小時后，倒掉培養(yǎng)基，并用PBS溶液清洗3次，加入IOml新鮮的M199培養(yǎng)基；以后每2天換ー次培養(yǎng)基，培養(yǎng)6天，倒掉培養(yǎng)基，用無菌的PBS溶液清洗3次，加入2ml消化液(0. 25%胰酶+0. 1%EDTA)消化細(xì)胞，在顯微鏡下觀察，一旦細(xì)胞變圓，即加入3倍的有血清的DMEM培養(yǎng)基終止反應(yīng)；用彎管將細(xì)胞吹打下來，并將所消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到ー個50ml無菌離心管中2000r/min離心5分鐘；倒掉上清，加入20ml新鮮培養(yǎng)基。傳代3代的HUVEC用于實驗。
權(quán)利要求
1.一種人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的分離方法，包括了以下步驟 1)取當(dāng)天新生兒15-20cm長的新鮮臍帶，放入無菌含雙抗的PBS溶液中4°C儲存。
2)用一個鈍頭的針頭扎入臍帶靜脈管中，用無菌含雙抗的PBS溶液沖洗至流出液體中無可見血液。
3)夾住臍帶下端，加入15ml的膠原酶I型(lmg/ml)37°C水浴消化10-15分鐘。
4)消化完后，將下端手術(shù)鉗松開，消化液流入一個50ml無菌離心管中，用無菌含雙抗PBS溶液沖洗臍帶2-3次。
5)將收集液離心(2000轉(zhuǎn)/分)5分鐘。
6)倒去上清，加入IOmlM199培養(yǎng)基(含酚紅、20%新生小牛血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素、100 μ g/ml血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子-肝素)，用彎管吹散細(xì)胞，將所有液體轉(zhuǎn)入一個用明膠包被好的培養(yǎng)瓶中，于CO2培養(yǎng)箱在37°C培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的分離方法，其特征在于所用臍帶為當(dāng)天新生兒15-20cm長的新鮮臍帶，用無菌含雙抗的PBS溶液4°C儲存。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的分離方法，其特征在于加入15ml的膠原酶I型(lmg/ml)于37°C水浴消化10-15分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的分離方法，其特征在于所用培養(yǎng)基為IOml M199培養(yǎng)基(含酚紅、20%新生小牛血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素、100 μ g/ml血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子-肝素)，轉(zhuǎn)入一個用明膠包被好的培養(yǎng)瓶中，于CO2培養(yǎng)箱在37°C培養(yǎng)。
5.一種人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的培養(yǎng)與傳代方法，包括了以下步驟 1)HUVEC細(xì)胞在CO2培養(yǎng)箱37°C培養(yǎng)24小時后，倒掉培養(yǎng)基，并用無菌含雙抗的PBS溶液清洗2-3次，洗掉紅細(xì)胞和死細(xì)胞，加入IOml新鮮的M199培養(yǎng)基。
2)以后每2天換一次培養(yǎng)基，一般培養(yǎng)5-7天，細(xì)胞可長滿至80-90%單層，正常的內(nèi)皮細(xì)胞長滿后如同卵石狀，這時可以傳代。
3)倒掉培養(yǎng)基，用無菌的PBS溶液清洗2-3次，加入2-3ml消化液(0.25%胰酶+0. I %EDTA)消化細(xì)胞，在顯微鏡下觀察，一旦細(xì)胞變圓，即加入2-3倍的有血清的DMEM培養(yǎng)基終止反應(yīng)。
4)用彎管將細(xì)胞吹打下來，并將所消化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個50ml無菌離心管中，2000轉(zhuǎn)/分，尚心5分鐘 5)倒掉上清，加入20ml新鮮培基，一般一瓶細(xì)胞可傳代2-3瓶。選擇傳代2_3代的HUVEC (培養(yǎng)了 20天左右)用于實驗。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的培養(yǎng)與傳代方法,其特征在于=HUVEC細(xì)胞于CO2培養(yǎng)箱在37°C培養(yǎng)24小時后，用無菌雙抗PBS溶液清洗2_3次后加入IOml新鮮的M199培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的培養(yǎng)與傳代方法,其特征在于每2天換一次培養(yǎng)基，一般培養(yǎng)5-7天，至細(xì)胞長滿至80-90%單層，進(jìn)行傳代。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的培養(yǎng)與傳代方法,其特征在于用2-3ml消化液(0. 25%胰酶+0. 1% EDTA)消化細(xì)胞，在顯微鏡下觀察，一旦細(xì)胞變圓，即加入2-3倍的有血清的DMEM培養(yǎng)基終止反應(yīng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的培養(yǎng)與傳代方法,其特征在于消化的細(xì)胞2000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述一種人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的培養(yǎng)與傳代方法，其特征在于選擇傳代2-3代的HUVEC (培養(yǎng)了 20天左右)用于實驗。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的分離、培養(yǎng)與傳代方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。內(nèi)容包括1)HUVEC的分離。取新鮮臍帶，用含雙抗的無菌PBS溶液洗凈，加入膠原酶37℃水浴消化，消化液離心后，加入M199培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入明膠包被好的培養(yǎng)瓶中，于C02培養(yǎng)箱在37℃培養(yǎng)。2)HUVEC的培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞在37℃培養(yǎng)24小時后，倒掉培養(yǎng)基，并用PBS溶液清洗，加入新鮮的M199培養(yǎng)基；以后每2天換一次培養(yǎng)基，一般培養(yǎng)5-7天可傳代。3)HUVEC的傳代倒掉培養(yǎng)基，用PBS溶液清洗，加入消化液消化細(xì)胞，一旦細(xì)胞變圓，即加入含血清的DMEM培養(yǎng)基終止反應(yīng)，將所消化的細(xì)胞離心，加入新鮮培養(yǎng)基，傳代2-3代的HUVEC用于實驗。本發(fā)明分離得到的HUVEC，經(jīng)濟實用，簡便易行，有利于獲得所需的體外實驗?zāi)Ｐ图?xì)胞。
文檔編號C12N5/071GK102827805SQ20121035940
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月25日
發(fā)明者黃午陽, 李春陽, 閆征, 王興娜, 王帆, 王健 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院