專利名稱：一種禽流感病毒、滅活疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種H9N2亞型禽流感滅活疫苗的制備方法及產(chǎn)品，屬于生物工程領(lǐng)域。背景研究
禽流感病毒(Avian Influenza Virus，縮寫(xiě)為AIV)隸屬于正粘病毒科A型流感病毒屬，因?yàn)樵摬《臼茿IV負(fù)鏈、分節(jié)段的RNA病毒，所以很容易發(fā)生變異并不斷的突破其感染宿主的種屬障礙，引起新的流感流行。自1966年首次在北美的火雞體內(nèi)分離到H9N2亞型AIV以來(lái)，該亞型的病毒不斷傳播，目前已在全世界范圍的禽群中廣泛存在。我國(guó)也于1992年首次報(bào)道了雞群中H9N2亞型AIV的感染，H9N2亞型是目前我國(guó)雞群中存在的AIV主要亞型，占禽流感總發(fā)病率的90%以上。H9N2亞型禽流感發(fā)病后雖然致死率不高(一般不超過(guò)30%)，但常導(dǎo)致呼吸道癥狀，蛋雞的產(chǎn)蛋下降，并使雞群易繼發(fā)嚴(yán)重的呼吸道疾病，影響家禽生產(chǎn)性能。AIV不僅對(duì)我國(guó)的養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的損失，而且對(duì)人類健康也構(gòu)成了威 脅。應(yīng)用相應(yīng)血清型的疫苗進(jìn)行免疫接種是對(duì)低致病性禽流感所采取的切實(shí)可行的方法。但是，現(xiàn)有技術(shù)中，H9N2亞型禽流感疫苗毒株不能滿足免疫原性強(qiáng)、交叉保護(hù)性好的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的在于提供一種免疫原性強(qiáng)、交叉保護(hù)性好的H9N2亞型禽流感病毒HN03株。本發(fā)明的另一目的是提供一種H9N2亞型禽流感滅活疫苗，該疫苗接種后，抗體效價(jià)高，對(duì)同源病毒攻毒和2011年以來(lái)新流行的H9N2亞型禽流感病毒SHOl、H9N2亞型禽流感病毒JX02攻毒保護(hù)率達(dá)到100%。安全性高、效力穩(wěn)定，注射后預(yù)防效果顯著，能很好地控制H9亞型禽流感疾病的發(fā)生與流行。本發(fā)明的再一目的是提供所述H9N2亞型禽流感滅活疫苗的制備方法，該方法簡(jiǎn)單、安全、成本低。本發(fā)明的再一目的是提供所述H9N2亞型禽流感病毒HN03株在制備預(yù)防和治療禽流感藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)
一種禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/ (H9N2)株，縮寫(xiě)為H9N2亞型禽流感病毒HN03株，其保藏登記號(hào)為CGMCC NO :6258。一種H9N2亞型禽流感滅活疫苗，該H9N2亞型禽流感滅活疫苗含有采用3 -丙內(nèi)酯滅活的H9N2亞型禽流感病毒HN03株。一種所述H9N2亞型禽流感滅活疫苗的制備方法，包括如下步驟
(1)制備H9N2亞型禽流感病毒HN03株毒液用H9N2亞型禽流感病毒HN03株接種SPF雞胚，收獲雞胚液作為H9N2亞型禽流感病毒HN03株毒液；
(2)滅活H9N2亞型禽流感病毒HN03株毒液在H9N2亞型禽流感病毒HN03株毒液中加入3 —丙內(nèi)酉旨；(3)油相溶液制備將注射用白油和司本一80按照體積比94 6混合混勻后作為油相溶液備用；
(4)水相溶液制備將滅活的H9N2亞型禽流感病毒HN03株毒液和吐溫-80按照體積比96 4混合均勻,作為水相溶液備用；
(5)乳化將油相溶液和水相溶液按照體積比2.2 4:1混和均勻，即獲得所述H9N2亞型禽流感滅活疫苗。步驟(2)中￠-丙內(nèi)酯與H9N2亞型禽流感病毒HN03株毒液的體積比為1:1899 1:2099。所述H9N2亞型禽流感病毒HN03株毒液中H9N2亞型禽流感病毒HN03株的含量為 IO8 ci 108_5EID5(i/0. Imlo一種H9N2亞型禽流感病毒HN03株在制備預(yù)防和治療H9N2禽流感藥物中的應(yīng)用。有益效果
(I)H9N2亞型禽流感病毒HN03株免疫原性強(qiáng)、交叉保護(hù)性好的。(2)H9N2亞型禽流感滅活疫苗接種后，抗體效價(jià)高，對(duì)同源病毒攻毒和2011年以來(lái)最新流行H9N2亞型禽流感病毒SH01、H9N2亞型禽流感病毒JX02攻毒保護(hù)率達(dá)到100%。該疫苗安全性高、效力穩(wěn)定，注射后預(yù)防效果顯著，保護(hù)率高，能很好地控制H9亞型禽流感疾病的發(fā)生與流行，顯著提高養(yǎng)禽生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益。(3)本發(fā)明制備H9N2亞型禽流感滅活疫苗的方法，簡(jiǎn)單、安全、成本低。保藏信息如下
保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。單位地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院中科院微生物研究所。分類命名禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/ (H9N2)株。保藏號(hào)CGMCCNO :6258。保藏日期2012年7月2日。為了方便描述，將禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/(H9N2)株縮寫(xiě)為H9N2亞型禽流感病毒HN03株。
具體實(shí)施例方式 實(shí)例I H9N2亞型禽流感病毒HN03株的分離與鑒定 I.病料
病料為無(wú)菌采集死亡病雞的心血、肝、腦、肺組織。2.組織觸片
將病料作心血涂片及各臟器的病毒組織觸片，并進(jìn)行染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)病毒組織觸片染色鏡檢結(jié)果為陰性。3.細(xì)菌培養(yǎng)
將上述病料，分別用馬丁肉湯和綿羊血培養(yǎng)基培養(yǎng)(按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄方法配制)，結(jié)果顯示無(wú)菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明所述病料中不含有細(xì)菌。4.病料處理
將上述病料在無(wú)菌容器中剪碎、磨碎，用含青鏈霉素的滅菌生理鹽水(每毫升生理鹽水含2000單位的青霉素和2000單位的鏈霉素)作I : 5倍稀釋，反復(fù)凍融三次后，3000r/min離心20分鐘，取上清液保存于_20°C備用。5.病毒分離、接種及收獲
將本實(shí)施例標(biāo)題4中獲得的上清液，尿囊腔途徑接種10日齡SPF雞胚，每胚接種量0. 2ml，接種后置37°C條件孵化。接種24小時(shí)以內(nèi)死亡胚棄去，收獲24小時(shí)以后死亡雞胚尿囊液，測(cè)定尿囊液紅細(xì)胞凝集價(jià)，將紅細(xì)胞凝集價(jià)不低于I : 64的尿囊液置-20°C保存，為雞胚擴(kuò)繁的第一代種毒，簡(jiǎn)稱El代種毒。將El代種毒繼續(xù)傳3代，即為E4代種毒，用于病毒生物學(xué)特性鑒定。紅細(xì)胞凝集價(jià)采用紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)(微量法)進(jìn)行檢測(cè)，具體方法如下在96孔(角度為110° )微量板上，從第I孔至12孔，每孔加入生理鹽水30 yl，用加液器吸取含毒尿囊液30 yl，從每排第I孔起，依次作倍比稀釋，至11孔，棄去加液器內(nèi)30 Ul液體，最后I個(gè)孔不加作為空白對(duì)照。每孔加入1%雞紅細(xì)胞懸液30 yl，立即在微量振蕩器上搖勻，置20°C室溫，20分鐘后觀察結(jié)果，使紅細(xì)胞完全凝集的最高稀釋度，作為判定終點(diǎn)。結(jié)果表 明El代種毒的紅細(xì)胞凝集價(jià)為I : 256，E4代種毒的紅細(xì)胞凝集價(jià)為I : 1024。6.血凝抑制試驗(yàn)
將E4代種毒用滅菌生理鹽水作I : 256稀釋，即為4個(gè)血凝單位抗原。分別用購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所的雞新城疫、雞產(chǎn)蛋下降綜合征、禽流感(H9)、禽流感(H5)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)(參照現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》中方法)，結(jié)果顯示被檢E4代種毒只可被禽流感(H9)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清抑制，其它三種血清均不能抑制，初步說(shuō)明本株病毒為H9亞型禽流感病毒。7.病毒含量測(cè)定
將E4代種毒10倍倍比稀釋，取10_7、10_8、10_9三個(gè)稀釋度，分別通過(guò)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚5枚，每胚0. 1ml，置37°C孵育120小時(shí)。120小時(shí)后，逐胚測(cè)定紅細(xì)胞凝集價(jià)(方法同前)，以紅細(xì)胞凝集價(jià)不低于I : 16判為感染，按Reed-Muench方法計(jì)算病毒含量。結(jié)果表明E4代種毒的病毒含量為108 5EID5(i/0. Iml08.靜脈致病指數(shù)(IVPI)測(cè)定
參照二 000年版《中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》(以下簡(jiǎn)稱《規(guī)程》)附錄448頁(yè)方法進(jìn)行。結(jié)果表明E4代種毒的靜脈致病指數(shù)為0，表明該毒株為低致病禽流感H9亞型病毒。9.雞胚最小致死量的平均死亡時(shí)間(MDT/MLD)測(cè)定
按《規(guī)程》附錄447頁(yè)方法進(jìn)行。結(jié)果表明E4代種毒的雞胚最小致死量的平均死亡時(shí)間為81. 5小時(shí)/10_9。10.免疫原性測(cè)定
將E4代種毒按常規(guī)方法制成含量為108_°EID5(i/0. 3ml的滅活疫苗。按0. 2ml/羽份免疫I月齡SPF雞10只，另取5只不免疫，作為空白對(duì)照。免疫21天后，所有試驗(yàn)雞采血，分離血清，參照現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》中方法進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)。同時(shí)對(duì)免疫組和對(duì)照組進(jìn)行攻毒，靜脈注射E4代種毒IO5 tlEID5tl/只，免疫后第5天逐只用棉拭子采集雞喉頭分泌物，過(guò)濾除菌，接種9 10日齡SPF雞胚，每個(gè)樣品尿囊腔接種5枚雞胚，0. 2ml/胚。37°C孵育120小時(shí)，測(cè)定尿囊液紅細(xì)胞凝集價(jià)。5枚雞胚中只要有I枚雞胚的雞胚液的紅細(xì)胞凝集價(jià)不低于I : 16 (微量法)則判為感染。對(duì)病毒感染為陰性的雞胚，應(yīng)盲傳一次。結(jié)果表明，該疫苗按照0. 2ml/羽份劑量免疫后21天，免疫組血清中E4代種毒血凝抑制抗體水平不低于I 128 (微量法)，空白對(duì)照組均不高于I : 4 (微量法)，免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明，免疫組10/10病毒分離為陰性，對(duì)照組5/5病毒分離為陽(yáng)性。11.血凝素HA基因及神經(jīng)氨酸酶NA基因鑒定
由哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，鑒定結(jié)果為E4代種毒的HA基因(如SEQ ID NO: I所示)屬于A型流感病毒H9亞型，NA基因(如SEQ ID NO: 2所示)屬于A型流感病毒N2亞型。因此，將該毒株命名為禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/(H9N2)株，縮寫(xiě)為H9N2亞型禽流感病毒HN03株。將E4代種毒進(jìn)行保藏。12.對(duì)流行毒株的交叉攻毒保護(hù)性研究 A/Chinken/Shanghai/01/2011/ (H9N2)(簡(jiǎn)稱 H9N2 亞型禽流感病毒 SHOl )，由上海獸·醫(yī)研究所2011年于上海分離。A/Chinken/Jiaxing/02/2011/ (H9N2)(簡(jiǎn)稱H9N2亞型禽流感病毒JX02)由南京天邦公司生物技術(shù)研究所2011年于浙江嘉興分離。將H9N2亞型禽流感病毒HN03株按常規(guī)方法制成病毒含量為108_°EID5(i/0. 3ml的滅活疫苗，免疫I月齡SPF雞30只；另取15只I月齡SPF雞，分為3組，5只/組，不免疫作為空白對(duì)照組。免疫后21天，將免疫組隨機(jī)分成三組，其中一組靜脈注射H9N2亞型禽流感病毒HN03株尿囊液攻毒，另一組靜脈注射H9N2亞型禽流感病毒SHOl尿囊液攻毒，剩余的一組靜脈注射H9N2亞型禽流感病毒JX02尿囊液攻毒；3個(gè)空白對(duì)照組的攻毒方法同免疫組。攻毒后第5天，逐只用棉拭子采集雞喉頭分泌物，過(guò)濾除菌，接種擴(kuò)10日齡SPF雞胚，每個(gè)樣品尿囊腔接種5枚雞胚，0. 2ml/胚。37°C孵育120小時(shí)，測(cè)定尿囊液紅細(xì)胞凝集價(jià)。5枚雞胚中只要有I枚雞胚的雞胚液的紅細(xì)胞凝集價(jià)不低于I : 16 (微量法)則判為感染。對(duì)病毒分離陰性的樣品，肓傳一代。結(jié)果表明H9N2亞型禽流感病毒HN03株對(duì)同源毒及非同源毒保護(hù)率均為100%，表明該毒株不但可以針對(duì)同源毒提供良好保護(hù)，對(duì)2011新分離的流行毒株也同樣具有良好的保護(hù)性。H9N2亞型禽流感病毒HN03株生物學(xué)特性研究結(jié)果表明，該毒株可在雞胚中高滴度增殖，血凝效價(jià)較高，為I : 1024(微量法)，免疫原性好，能完全抵抗同源病毒攻擊，異源攻毒保護(hù)率也高達(dá)100%。因此可作為H9N2亞型禽流感疫苗候選毒株，用于制備滅活疫苗。實(shí)例2本發(fā)明H9N2亞型禽流感滅活疫苗安全性試驗(yàn) 制備本發(fā)明H9N2亞型禽流感滅活疫苗，具體方法如下
(I)制備H9N2亞型禽流感病毒HN03株毒液用H9N2亞型禽流感病毒HN03株接種SPF雞胚，收獲雞胚液，取紅細(xì)胞凝集價(jià)為I : 256 1024的雞胚液作為H9N2亞型禽流感病毒HN03株毒液。該毒液中H9N2亞型禽流感病毒HN03株的含量為108 5EID5(l/0. 1ml。將H9N2亞型禽流感病毒HN03株毒種用滅菌生理鹽水作I : 5000稀釋，尿囊腔內(nèi)接種9 11日齡SPF雞胚，每胚0. 1ml，接種后密封針孔，置36 37°C繼續(xù)孵育，不必翻蛋。雞胚接種后,24小時(shí)內(nèi)照蛋I次，棄去死胚。此后，每4 8小時(shí)照蛋I次，直至96小時(shí)，死亡的雞胚隨時(shí)取出，氣室向上，置2 8°C冷卻4 24小時(shí)。將冷卻的雞胚取出，用碘酊消毒氣室部位，然后以無(wú)菌手術(shù)剝除氣室部卵殼，揭去卵殼膜，剪破絨毛尿囊膜及羊膜(勿使卵黃破裂)，吸取雞胚的雞胚液，取紅細(xì)胞凝集價(jià)為I : 256 I : 1024雞胚液作為H9N2亞型禽流感病毒HN03株毒液。在H9N2亞型禽流感病毒HN03株毒液中加入抗生素(每毫升抗原中青霉素終濃度800單位，鏈霉素終濃度800單位)，同時(shí)按現(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)。注意在吸取雞胚液前對(duì)每個(gè)雞胚均應(yīng)注意檢查，凡胎兒腐敗、胚液渾濁及有任何污染可疑者，棄去不用。死胚和活胚分別收獲。(2)滅活H9N2亞型禽流感病毒HN03株毒液按照P -丙內(nèi)酯與H9N2亞型禽流感病毒HN03株毒液體積比為1:1999，在119吧亞型禽流感病毒11腸3株毒液中加入￠-丙內(nèi)酯。具體方法如下將H9N2亞型禽流感病毒HN03株毒液置于無(wú)菌滅活罐內(nèi)，加入3 -丙內(nèi)酯，隨加隨攪拌，使其充分混合。之后用無(wú)菌壓縮空氣將其壓入另一無(wú)菌滅活罐內(nèi)，置4°C下滅活24小時(shí)。期間每隔4小時(shí)攪拌I次。停止滅活后，從罐內(nèi)取樣進(jìn)行滅活檢驗(yàn)。
乳化
(3)油相溶液制備將注射用白油和司本一 80按照體積比94 6混合均勻后作為油相溶液備用。(4)水相溶液制備將滅活的H9N2亞型禽流感病毒HN03株毒液和吐溫_80按照體積比96 4混合均勻，作為水相溶液備用。(5)乳化將油相溶液和水相溶液按照體積比3 1混和均勻，即獲得本發(fā)明H9N2亞型禽流感滅活疫苗。具體方法如下將3份油相放入乳化罐內(nèi)，啟動(dòng)乳化罐攪拌機(jī)攪拌，同時(shí)徐徐加入水相一份，加完后繼續(xù)攪拌l(Tl5min，打開(kāi)均質(zhì)機(jī)進(jìn)出口開(kāi)關(guān)，啟動(dòng)均質(zhì)機(jī)，使乳化液經(jīng)均質(zhì)機(jī)進(jìn)入另一罐，如此反復(fù)乳化數(shù)次(一般61次)。乳化后取IOml疫苗，以3000r/min離心15分鐘,應(yīng)不出現(xiàn)分層現(xiàn)象。注疫苗的配制過(guò)程需無(wú)菌操作。為了檢驗(yàn)H9N2亞型禽流感病毒HN03株的安全性，按照上述方法制備5批次滅活疫苗。對(duì)7日齡SPF雞、7日齡三黃肉雞頸背部皮下注射該禽流感(H9亞型)滅活疫苗(HN03株)0. 6ml/只(雙倍劑量)，通過(guò)觀察接種后14天內(nèi)是否出現(xiàn)由疫苗引起的任何局部和全身反應(yīng)以及接種后14天、28天疫苗吸收情況，對(duì)疫苗安全性進(jìn)行研究。試驗(yàn)設(shè)計(jì)用7日齡SPF雞(購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)、7日齡三黃肉雞(購(gòu)自南京石佛寺養(yǎng)雞場(chǎng))。各批雞購(gòu)回后，適應(yīng)數(shù)天，核實(shí)雞的全身狀況和臨床疾病情況，剔除弱雞，選擇健康雞進(jìn)入試驗(yàn)。對(duì)SPF雞分別雙倍劑量(0. 6ml/只)量頸背部皮下注射五批本發(fā)明H9N2亞型禽流感滅活疫苗，每次設(shè)I組不接種，作為對(duì)照；對(duì)三黃肉雞分別雙倍劑量頸背部皮下注射三批本發(fā)明H9N2亞型禽流感滅活疫苗，每次設(shè)I組不接種，作為對(duì)照。結(jié)果7日齡SPF雞及7日齡三黃肉雞接種本發(fā)明H9N2亞型禽流感滅活疫苗，14日內(nèi)未觀察到臨床異常，采食、飲水正常，健康情況良好，未發(fā)現(xiàn)由疫苗引起的任何局部和全身反應(yīng)(見(jiàn)表I)。接種后14天，剖檢注射部位90%以上肉眼可見(jiàn)少量粟粒樣大小顆粒未吸收完全，注射后28天剖檢，大部分接種對(duì)象已基本吸收，注射部位未見(jiàn)由疫苗接種引起的異常反應(yīng)，見(jiàn)表I。因此，本發(fā)明H9N2亞型禽流感滅活疫苗雙倍劑量接種是安全的。表I接種后14天和28天疫苗吸收檢驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種禽流感病毒A/chicken/He Nan/03/2009/(H9N2)株，縮寫(xiě)為H9N2亞型禽流感病毒HN03株，其保藏登記號(hào)為CGMCC NO :6258。
2.—種H9N2亞型禽流感滅活疫苗，其特征在于該H9N2亞型禽流感滅活疫苗含有采用β -丙內(nèi)酯滅活的Η9Ν2亞型禽流感病毒ΗΝ03株。
3.—種權(quán)利要求2所述Η9Ν2亞型禽流感滅活疫苗的制備方法，包括如下步驟 (1)制備Η9Ν2亞型禽流感病毒ΗΝ03株毒液用Η9Ν2亞型禽流感病毒ΗΝ03株接種SPF雞胚，收獲雞胚液作為Η9Ν2亞型禽流感病毒ΗΝ03株毒液； (2)滅活Η9Ν2亞型禽流感病毒ΗΝ03株毒液在Η9Ν2亞型禽流感病毒ΗΝ03株毒液中加入β_丙內(nèi)酉旨； (3)油相溶液制備將注射用白油和司本一80按照體積比94 6混合混勻后作為油相溶液備用； (4)水相溶液制備將滅活的Η9Ν2亞型禽流感病毒ΗΝ03株毒液和吐溫-80按照體積比96 4混合均勻,作為水相溶液備用； (5)乳化將油相溶液和水相溶液按照體積比2.2 4:1混和均勻，即獲得所述Η9Ν2亞型禽流感滅活疫苗。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述Η9Ν2亞型禽流感滅活疫苗的制備方法，其特征在于步驟(2)中丙內(nèi)酯與Η9Ν2亞型禽流感病毒ΗΝ03株毒液的體積比為1:1899 1:2099。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述H9N2亞型禽流感滅活疫苗的制備方法，其特征在于所述H9N2亞型禽流感病毒HN03株毒液中H9N2亞型禽流感病毒HN03株的含量為108_° 108· 5EID50/0. Imlo
6.一種H9N2亞型禽流感病毒HN03株在制備預(yù)防和治療H9N2禽流感藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種禽流感病毒、滅活疫苗及其制備方法，屬于生物工程領(lǐng)域。本發(fā)明禽流感病毒A/chicken/HeNan/03/2009/(H9N2)株CGMCCNO6258，縮寫(xiě)為H9N2亞型禽流感病毒HN03株。本發(fā)明H9N2亞型禽流感滅活疫苗含有采用β-丙內(nèi)酯滅活的H9N2亞型禽流感病毒HN03株。制備所述疫苗的方法，制備H9N2亞型禽流感病毒HN03株毒液，滅活，制備成油乳劑。H9N2亞型禽流感病毒HN03株免疫原性強(qiáng)、交叉保護(hù)性好的。H9N2亞型禽流感滅活疫苗接種后，抗體效價(jià)高。本發(fā)明制備H9N2亞型禽流感滅活疫苗的方法，簡(jiǎn)單、安全、成本低。
文檔編號(hào)C12R1/93GK102816740SQ20121032072
公開(kāi)日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月3日
發(fā)明者于漾, 揭鴻英, 朱亞露, 何家惠, 鄧碧華, 張小飛, 艾玉春, 劉志凌, 顧巍巍 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院