專利名稱：一種微藻培養(yǎng)及采收耦合快速積累藻油的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微藻生物能源技術(shù)領(lǐng)域，涉及ー種產(chǎn)油微藻脅迫培養(yǎng)快速積累大量藻油和微藻采收耦合的方法。
(ニ)
背景技術(shù)：
隨著工業(yè)和經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，能源短缺和環(huán)境污染問題日益嚴(yán)重，尋求可以替代石油的可再生清潔能源成為世界能源エ業(yè)的發(fā)展方·向。藻類具有光合作用效率高、生長周期短，環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、藻油含量豐富的特點(diǎn)，是富有前景的生產(chǎn)生物能源的原料之一。目前，微藻生物能源的關(guān)鍵問題在于培養(yǎng)成本高、微藻采收困難。培養(yǎng)成本高的原因主要有兩個(gè)方面，其一是未能找到協(xié)調(diào)好微藻高生物產(chǎn)量和高藻油含量矛盾的微藻自養(yǎng)培養(yǎng)方法；其ニ是未能找到協(xié)調(diào)好培養(yǎng)鹽的重復(fù)利用和采收成本之間矛盾的微藻采收方法。為了提高微藻的生物量和藻油含量，目前常用的培養(yǎng)方式是異養(yǎng)培養(yǎng)，即在培養(yǎng)過程中加入大量的葡萄糖等有機(jī)物質(zhì)促使微藻的生長和藻油積累。由于加入了大量的有機(jī)物，異養(yǎng)培養(yǎng)的成本高。微藻的自養(yǎng)是在自然光照下，利用大氣中的CO2及培養(yǎng)液中的N、P等無機(jī)鹽培養(yǎng)微藻，相對(duì)于異養(yǎng)，自養(yǎng)的培養(yǎng)成本較低，但藻的脂質(zhì)含量也較低。在自養(yǎng)培養(yǎng)微藻產(chǎn)油的過程中，常通過培養(yǎng)液營養(yǎng)成分特別是一些必須營養(yǎng)鹽的缺陷，來誘導(dǎo)微藻產(chǎn)生藻油，但是在營養(yǎng)鹽缺乏的情況下，大部分微藻不能實(shí)現(xiàn)高密度生長，因此，盡管提高了脂質(zhì)含量，但藻油的產(chǎn)量不高。微藻的采收一般采用離心或絮凝的方法。離心采收的設(shè)備投資大和采收能耗高。絮凝采收常采用在藻液中加入絮凝劑促使藻細(xì)胞絮凝沉降的方法，由于加入了絮凝齊U，微藻采收后的上清液不能循環(huán)用于微藻的培養(yǎng)，造成培養(yǎng)鹽和水的浪費(fèi)，増加了培養(yǎng)成本，同時(shí)，絮凝后的上清液中富含有絮凝劑、營養(yǎng)鹽以及藻細(xì)胞，直接排放會(huì)污染環(huán)境，浄化處理又増加了成本。在此背景下，本發(fā)明提出了ー種通過調(diào)節(jié)pH值促進(jìn)微藻大量積累藻油的同時(shí)采收微藻的耦合方法在微藻生長的前期，通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)液中氮、磷的濃度及比例提高微藻的生物質(zhì)產(chǎn)量；在微藻生長的后期，通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的PH值，形成強(qiáng)堿或強(qiáng)酸的環(huán)境，脅迫微藻快速積累大量藻油，同時(shí)使微藻絮凝脫水，采收微藻。采收微藻后的培養(yǎng)液調(diào)節(jié)PH后循環(huán)用于微藻的培養(yǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種增產(chǎn)、促油培養(yǎng)微藻和采收微藻的方法。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種微藻培養(yǎng)及采收耦合快速積累藻油的方法，所述方法為(I)將新鮮微藻細(xì)胞以體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接種在相應(yīng)的微藻培養(yǎng)液(所述微藻培養(yǎng)液為本領(lǐng)域公知技術(shù)，不同的微藻種類對(duì)應(yīng)不同的微藻培養(yǎng)液，海水微藻可以采用基礎(chǔ)F/2培養(yǎng)液或調(diào)整氮磷比后的改良F/2培養(yǎng)液，淡水微藻可以采用CHU培養(yǎng)液)中，通入空氣，在自然光照下，5 40°C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后，再在同樣條件下培養(yǎng)f 33d，獲得藻液；(2)在步驟(I)獲得的藻液中加入堿性水溶液調(diào)節(jié)pH值為1(Γ13，或在步驟(I)獲得的藻液中加入酸性水溶液調(diào)節(jié)pH值為f 5，室溫靜置f5d使藻液分層，獲得上層清液和下層沉淀，將下層沉淀過濾，取濾餅即獲得藻泥，將藻泥采用有機(jī)溶劑A浸提、索氏抽提或酸法提取處理，獲得所述藻油；所述有機(jī)溶劑A為下列之一こ醇、こ醚、こ酸こ酯或石油醚；(3)將步驟(2)的上層清液調(diào)節(jié)pH至7 8，獲得調(diào)節(jié)pH值后的上層清液并檢測上層清液組成，將調(diào)節(jié)PH值后的上層清液各個(gè)組成補(bǔ)足至相應(yīng)微藻培養(yǎng)液組分，獲得再生微藻培養(yǎng)液，循環(huán)用于微藻培養(yǎng)。進(jìn)ー步，步驟(I)所述微藻優(yōu)選為淡水微藻或海洋微藻。更進(jìn)一歩，步驟(I)所述微藻優(yōu)選為下列之一眼擬點(diǎn)微綠球藻、杜氏鹽藻、葡萄藻或小球藻，所述眼擬點(diǎn)微綠球藻、杜氏鹽藻為海洋微藻，葡萄藻或小球藻為淡水微藻。 進(jìn)ー步，所述ー種微藻培養(yǎng)及采收耦合快速積累藻油的方法推薦按如下步驟進(jìn)行(I)將新鮮微藻細(xì)胞以體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接種在相應(yīng)微藻培養(yǎng)液中，通入空氣，在自然光照下，5 40°C (優(yōu)選2(T25°C)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后，再在同樣條件下培養(yǎng)fl5d (優(yōu)選15d),獲得藻液；所述微藻為海洋微藻；所述相應(yīng)微藻培養(yǎng)液為改良F/2培養(yǎng)液,終濃度組成為NaN0325 1350mg/L、NaH2PO4 ·2Η20 5 270mg/L、Na2SiO3 · 9H2020mg/L、Na2EDTA 4. 36mg/L、FeCl3 · 6H20 3. 16mg/L、CuSO4 · 5H200. 01mg/L、ZnSO4 · 7H20 0. 023mg/L、CoCl2 · 6H200. 012mg/L、MnCl2 · 4H200. 18mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 07mg/L、VB1O. I μ g/L、VB2O. 5 μ g/L、生物素0. 5 μ g/L，溶劑為水，pH值為；(2)在步驟(I)獲得的藻液中加入堿性水溶液調(diào)節(jié)PH值為1(Γ13，或在步驟(I)獲得的藻液中加入酸性水溶液調(diào)節(jié)pH值為f 5，室溫靜置f 5d(即pH脅迫f5d，同時(shí)使微藻絮凝采收)使藻液分層，獲得上層清液和下層沉淀，將下層沉淀過濾，取濾餅即獲得藻泥，將藻泥采用有機(jī)溶劑B浸提、索氏抽提或酸法提取處理，獲得所述藻油；所述有機(jī)溶劑B為下列之一こ醇、こ醚、こ酸こ酯或石油醚；(3)將步驟(2)的上層清液調(diào)節(jié)PH至7 8(上層清液的pH在1(Γ13時(shí)，用磷酸調(diào)節(jié)pH至7 8 ;上層清液的pH在3飛時(shí)，用氫氧化鉀或氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至7 8)，獲得調(diào)節(jié)pH值后的上層清液，在調(diào)節(jié)PH值后的上層清液中加入硝酸鈉(NaNO3)和磷酸ニ氫鈉(NaH2PO4 · 2H20),使NaNO3的終濃度為25 1350mg/L，NaH2PO4 · 2H20的終濃度為5 270mg/L，獲得再生后的改良F/2培養(yǎng)液，循環(huán)用于微藻培養(yǎng)。進(jìn)ー步，步驟(I)所述微藻更優(yōu)選為眼擬點(diǎn)微綠球藻。進(jìn)ー步，步驟(I)所述培養(yǎng)溫度優(yōu)選為25 30°C。進(jìn)ー步，步驟(I)所述改良F/2培養(yǎng)液中NaNO3的終濃度優(yōu)選為225 1350mg/L，相應(yīng)氮磷質(zhì)量比為4:1，最優(yōu)選NaNO3的終濃度225mg/L，NaH2PO4 ·2Η20的終濃度優(yōu)選為45mg/L,相應(yīng)氮磷質(zhì)量比為4:1。進(jìn)ー步，步驟(2)所述堿性水溶液優(yōu)選為氫氧化鈉水溶液或氫氧化鉀水溶液，更優(yōu)選質(zhì)量濃度5 10%的氫氧化鈉水溶液或質(zhì)量濃度5 10%的氫氧化鉀水溶液，所述酸性水溶液優(yōu)選為硫酸水溶液或鹽酸水溶液，更優(yōu)選體積濃度5 10%的硫酸水溶液或體積濃度I (Tl 5%的鹽酸水溶液。進(jìn)ー步，優(yōu)選步驟(2)所述在步驟(I)獲得的藻液中加入堿性水溶液調(diào)節(jié)pH值為11，室溫靜置3d (pH脅迫3d)使藻液分層，獲得上層清液和下層沉淀。進(jìn)ー步，所述微藻培養(yǎng)及采收耦合快速積累藻油的方法中所述微藻藻油的提取方法為本領(lǐng)域公知方法，通常步驟(2)藻泥按下列方法之一進(jìn)行處理提取藻油①有機(jī)溶劑浸提將步驟(2)獲得的藻泥在70°C下干燥12小時(shí)，獲得干藻粉a，在干藻粉a中以質(zhì)量比2:1加入石英砂a，碾磨30min，再加入有機(jī)溶劑C，在室溫下浸提12小吋，過濾，獲得濾液和濾餅，將濾餅用相同有機(jī)溶劑C在同樣條件下浸提3次，合并所有濾液，將濾液減壓濃縮脫除溶劑，得到藻油；所述有機(jī)溶劑C為下列之一こ醇、こ醚、こ酸こ酷或石油醚；所述有機(jī)溶劑C的體積用量以干藻粉a質(zhì)量計(jì)為5ml/g 索氏抽提將步驟
(2)獲得的藻泥在70°C下干燥12小吋，獲得干藻粉b，在干藻粉b中以質(zhì)量比2:1加入石英砂b，碾磨30min，加入有機(jī)溶劑D，在索氏抽提器中(在有機(jī)溶劑D的沸點(diǎn)下)抽提10小時(shí)，將抽提液減壓濃縮脫除溶劑，即得藻油；所述有機(jī)溶劑D為下列之一こ醇、こ醚、こ酸こ酯或石油醚；所述有機(jī)溶劑D的體積用量以干藻粉b質(zhì)量計(jì)為5ml/g 酸性溶液提取將步驟(2)獲得的藻泥在70°C下干燥12小時(shí)，獲得干藻粉C，在干藻粉c中加入蒸餾水和濃鹽酸(質(zhì)量濃度36 38%)，在70°C水浴中放置20min，再加入無水こ醇，冷卻，加入こ醚a(bǔ)，振蕩lmin,4000rpm離心2min,獲得上層こ醚相和下層沉淀,在下層沉淀中加入こ醚b,振蕩lmin,4000rpm離心2min,合并所有上層こ醚相,減壓濃縮脫除溶劑,獲得藻油；所述蒸懼·水、濃鹽酸、無水こ醇、こ醚a(bǔ)和こ醚b的體積用量均以干藻粉c質(zhì)量計(jì)分別為4ml/g、5ml/g、5ml/g、10ml/g和 5ml/g。本發(fā)明獲得的藻油以中性脂為主，甘油三酯的含量約90%。組成甘油三酯的脂肪酸主要是棕櫚酸C16:0,約30 35%，十六碳烯酸C16:1，約25 30%，油酸C18:1，約10 15%，二十碳五烯酸(EPA) C20:5，約15 28%。本發(fā)明所述生物量是指每升培養(yǎng)液中獲得的干藻粉質(zhì)量，通過生物量及生長曲線可以判斷微藻生長狀況，還可以通過微藻培養(yǎng)前及培養(yǎng)后藻液中細(xì)胞個(gè)數(shù)來判斷生長情況。本發(fā)明所述微藻采收率根據(jù)公式(I)計(jì)算η =⑧650-,原—棚^聰凝社清液uX100%公式(丄)
^^6S0 m '原藻液公式(I)中OD65toliius液是指新鮮微藻細(xì)胞接種在改良F/2培養(yǎng)液中，通入空氣，在自然光照下，5 40°C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后，再在同樣條件下培養(yǎng)fl5d，獲得的藻液(即為原藻液)在650nm處的吸光度，0D65(lnm,pH|s!Wg±i#a是指將原藻液調(diào)整pH值靜置分層后上層清液在650nm處的吸光度。所述采收率還可以通過微藻pH絮凝采收前及絮凝采收后藻液中細(xì)胞個(gè)數(shù)來判斷，計(jì)算方法為原藻液中細(xì)胞密度減去pH脅迫后上層清液中細(xì)胞密度后除以原藻液中細(xì)胞密度的百分比。微藻的含油率是指Ig干藻粉中含有的藻油質(zhì)量(g)，本發(fā)明所述微藻的含油率根據(jù)公式(2)計(jì)算
Ig干藻粉提取得到的藻油質(zhì)量(g)ハη = —-1 了袖機(jī)-—X 100%公式(2 )
Ig十操粉本發(fā)明所述有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑D均為有機(jī)溶剤，為便于區(qū)分不同步驟所用有機(jī)溶劑不同而命名；所述干藻粉a、干藻粉b和干藻粉c均為干藻粉，為便于區(qū)分不同步驟所得的干藻粉量不同而命名；所述こ醚a(bǔ)和こ醚b均為こ醚，為便于區(qū)分不同步驟加入こ醚量不同而命名，所述石英砂a和石英砂b均為石英砂，為便于區(qū)分不同步驟所用石英砂不同而命名，字母本身均無含義。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)勢(shì)I)在微藻生長前期，通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)液中氮、磷終濃度，提高微藻生物量，以眼擬點(diǎn)微綠球藻為例，與基礎(chǔ)F/2培養(yǎng)液比較，培養(yǎng)液中NaNO3終濃度調(diào)整到O. 225g/L，N/P質(zhì)量比調(diào)整到4:1 (對(duì)應(yīng)NaH2PO4 ·2Η20的終濃度為45mg/L)，眼擬點(diǎn)微綠球藻的生物量從O. 42g/L増加到2. 53g/L，生物量提高了 6倍；
2)微藻生長后期，通過調(diào)節(jié)藻液的pH值，脅迫微藻快速積累藻油，以眼擬點(diǎn)微綠球藻為例，與正常培養(yǎng)相比，藻液的PH調(diào)節(jié)至11脅迫三天，微藻的藻油含量從6. 89%提高到48. 2% ;藻液的pH調(diào)節(jié)至3脅迫三天，微藻的藻油含量從6. 89%提高到35. 0% ；3)微藻生長至對(duì)數(shù)期，通過調(diào)節(jié)藻液的pH值，在脅迫微藻快速積累藻油的同吋，藻細(xì)胞發(fā)生絮凝沉降，藻細(xì)胞與培養(yǎng)液分離，從而實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)與采收耦合，簡化操作過程，縮短生產(chǎn)時(shí)間；4)調(diào)節(jié)pH絮凝采收微藻后的上層清液，根據(jù)上層清液的酸堿性，用磷酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH值至7. (Γ8. 0，補(bǔ)加相應(yīng)培養(yǎng)液組分，可以循環(huán)用于微藻的培養(yǎng)，培養(yǎng)液的循環(huán)利用既節(jié)省了培養(yǎng)成本，又避免了培養(yǎng)液排放對(duì)環(huán)境造成的污染。


圖I本發(fā)明的エ藝流程圖；圖2微藻在新鮮改良F/2培養(yǎng)液及再生的改良F/2培養(yǎng)液中的生長曲線；圖3不同NaNO3濃度對(duì)微藻生長曲線的影響，圖中不同的標(biāo)記表示曲線表是不同濃度氮(NaNO3)下培養(yǎng)情況實(shí)心三角形(+:)表示NaNO3濃度為25mg/L,實(shí)心正方形(-*■-)表示NaNO3濃度為75mg/L，空心三角形(★)表示NaNO3濃度為225mg/L，空心正方形(-^)表示NaNO3濃度為450mg/L，空心菱形(+)表示NaNO3濃度為900mg/L，空心圓形(十)表示NaNO3濃度為1350mg/L，實(shí)心圓形(+)為對(duì)照組的基礎(chǔ)F/2培養(yǎng)液，表示NaNO3濃度為i5mg/L。圖4改良F/2培養(yǎng)液中不同氮磷質(zhì)量比對(duì)微藻生長曲線的影響，圖中的N:P的含義是改良F/2培養(yǎng)液中氮磷質(zhì)量比，實(shí)心三角形()表示氮磷質(zhì)量比為1: 1，實(shí)心正方形(~■-)表示氮磷質(zhì)量比為4:1,實(shí)心無邊形(+ )表示氮磷質(zhì)量比為16:1,實(shí)心凌形(+)表示氮磷質(zhì)量比為32:1,空心正方形(+ )表示對(duì)照組中基礎(chǔ)F/2培養(yǎng)液中氮磷質(zhì)量比12:1。圖5不同pH值及脅迫時(shí)間對(duì)微藻含油率的影響。圖6實(shí)施例4所獲得藻油GC-MS分析結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此基礎(chǔ)F/2 培養(yǎng)液終濃度組成為NaN0375mg/L、NaH2PO4 · 2H205mg/L、Na2SiO3 · 9H2020mg/L、Na2EDTA 4. 36mg/L、FeCl3 · 6H20 3. 16mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 01mg/L、ZnSO4 · 7H200. 023mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 012mg/L、MnCl2 · 4H20 0. 18mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 07mg/L、VB1O. I μ g/L、VB2O. 5 μ g/L、生物素 O. 5 μ g/L,溶劑為水，pH 值為 7 8。所述改良F/2培養(yǎng)液終濃度組成為NaN0325 1350mg/L、NaH2PO4 · 2H20 5 270mg/L、Na2SiO3 · 9H20 20mg/L、Na2EDTA 4. 36mg/L、FeCl3 · 6H20 3. 16mg/L、CuSO4 · 5H20 0. Olmg/L、ZnSO4 · 7H20 0. 023mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 012mg/L、MnCl2 · 4H20 0. 18mg/L、Na2MoO4 · 2H200. 07mg/L、VB1O. I μ g/L、VB2O. 5 μ g/L、生物素 0. 5 μ g/L,溶劑為水，pH 值為 7 8。實(shí)施例I改良F/2培養(yǎng)液中氮的濃度及氮磷比的優(yōu)化在基礎(chǔ)F/2培養(yǎng)液中添加NaNO3和調(diào)整氮磷質(zhì)量比來獲得改良F/2培養(yǎng)液，將實(shí)驗(yàn)分成11個(gè)組組I為對(duì)照組，培養(yǎng)液為基礎(chǔ)F/2培養(yǎng)液，即NaNO3終濃度為75mg/L，NaH2PO4 ·2H20 終濃度為5mg/L，對(duì)應(yīng)的氮磷質(zhì)量比為12:1 ；組2 組11為實(shí)驗(yàn)組，其中組2 組7培養(yǎng)液為改良F/2培養(yǎng)液，NaNO3終濃度分別為 25、75、225、450、900、135011^/1、對(duì)應(yīng)的 NaH2PO4 · 2H20 終濃度分別為 5、15、45、90、180、270mg/L,以保證氮磷質(zhì)量比為4:1。組8 組11培養(yǎng)液為改良F/2培養(yǎng)液，NaNO3終濃度均為225mg/L，NaH2PO4 · 2H20終濃度分別為180、45、1L 25,5. 63mg/L，對(duì)應(yīng)的氮磷質(zhì)量比分別為 1:1、4:1、16:1、32:1。將上述各組培養(yǎng)液中分別以體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接種新鮮的眼擬點(diǎn)微綠球藻細(xì)胞(購自海洋生物種質(zhì)庫)，在室溫(25 30°C)、自然光照、連續(xù)充空氣培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后，再在同樣條件下培養(yǎng)15天，獲得藻液f藻液11。培養(yǎng)過程中，每隔24小時(shí)取200μ I藻液，用O. I μ I魯戈氏液(所述魯戈氏液通常的制法為稱取6gKI溶于l(T20ml水中，完全溶解后加入4gKI充分搖勻，完全溶解后,加水定容至IOOml,搖勻即可)染色固定后,在顯微鏡下計(jì)數(shù)，得到藻液中藻細(xì)胞密度，獲得眼擬點(diǎn)微綠球藻的生長曲線，組2 組7見圖3所示，組8 組11見圖4所示；將上述獲得的藻液f藻液11分別調(diào)節(jié)pH值為11，室溫靜置3d使藻液分層，分別獲得上層清液廣11和下層沉淀廣11，將下層沉淀分別過濾，取濾餅即獲得藻泥廣11。將上述藻泥f 11在70°C下干燥12小時(shí)，獲得干藻粉f 11，根據(jù)微藻培養(yǎng)的生物量來判斷微藻生長狀況，所述微藻培養(yǎng)的生物量是指每升培養(yǎng)液中獲得的干藻粉質(zhì)量。組廣組11不同氮濃度和氮磷比下微藻的生物量見表I所示。圖3、圖4及表I結(jié)果顯示，改良F/2培養(yǎng)液中較適宜的氮(NaNO3)終濃度為225g"l350mg/L,較適宜的氮磷質(zhì)量比為4:1，在此氮和磷的濃度范圍內(nèi)，微綠球藻的生物量約是對(duì)照組(基礎(chǔ)F/2培養(yǎng)液，75mg/LNaN03, 5mg/L NaH2PO4 · 2H20,氮磷質(zhì)量比為12:1)的6倍。表INaNO3濃度和氮磷比對(duì)微藻生物量的影響
N/p2575225 450 900 1350 對(duì)照組
1:11.76 g/1
4:10.63 g/1 1.29 g/1 2.53 g/1 2.67 g/1 2.48 g/1 2.48 g/l 0.42 g/1
16:1 1.82 g/1 32:11.33 g/l
實(shí)施例2微綠球藻pH脅迫產(chǎn)油與pH絮凝采收耦合過程條件優(yōu)化調(diào)節(jié)基礎(chǔ)F/2培養(yǎng)液中NaNO3的終濃度為225mg/L，氮磷質(zhì)量比為4:1 (對(duì)應(yīng)的NaH2PO4 · 2H20終濃度為45mg/L)，得到改良F/2培養(yǎng)液。(I)將新鮮的眼擬點(diǎn)微綠球藻細(xì)胞以體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接種至上述改良F/2培養(yǎng)液中，培養(yǎng)溫度25 30°C，自然光照，連續(xù)充空氣培養(yǎng)3天至對(duì)數(shù)期后，再在同樣的條件下培養(yǎng)15天，獲得藻液。取IOOOmL藻液，將藻液調(diào)節(jié)pH至11，室溫(25 30°C)靜置3d使藻液分層，獲得上層清液和下層沉淀，將下層沉淀過濾后取濾餅(即藻泥)在70°C下干燥12h，制成干藻粉，每升培養(yǎng)液獲得2. 53g干藻粉。(2)取17份步驟(I)方法獲得的藻液，并從中各取I. 5mL藻液用分光光度計(jì)測定0D65tol。將17份藻液分成4組，對(duì)照組(I份藻液)，組I (7份藻液)，組2 (7份藻液)，組3(2份藻液)，將各組按下述方式進(jìn)行實(shí)驗(yàn)a、對(duì)照組將藻液直接通過離心(轉(zhuǎn)速3000rpm)得到藻泥(即離心獲得的沉淀);將·藻泥在70°C下干燥12h得到干藻粉；取Ig干藻粉加入4ml蒸餾水和5ml濃鹽酸(質(zhì)量濃度36 38%)，在70°C水浴中放置20min，加入5ml無水こ醇，冷卻，加入IOmlこ醚，振蕩lmin,4000rpm離心2min,獲得上層こ醚相和下層沉淀，取下層沉淀加入5mlこ醚,振蕩lmin,4000rpm離心2min，合并所有上層こ醚相，減壓濃縮脫除溶劑，即獲得藻油，根據(jù)公式(2)計(jì)算微藻的含油率，結(jié)果見圖5所示。b、組I (pH脅迫一天產(chǎn)油):7份藻液分別用lmol/L鹽酸水溶液調(diào)節(jié)pH值至1、3、5，用lmol/L氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH值至10、11、12、13。將7份調(diào)節(jié)pH值后的藻液在室溫(25 30°C)下靜置I天使微藻分層，獲得上層清液和下層沉淀。分別傾倒去上層清液，將下層沉淀分別過濾，分別取濾餅即獲得7份藻泥。將上述7份上層清液各取1.5mL用分光光度計(jì)測定OD65tlnm,記為pH絮凝后的OD65tol,根據(jù)公式(I)計(jì)算微藻采收率，結(jié)果見表2所示；7份藻泥在70°C下干燥12小時(shí)，得到7份干藻粉。7份干藻粉各取Ig加入4ml蒸餾水和5ml濃鹽酸(質(zhì)量濃度36 38%)，在70°C水浴中放置20min，加入5ml無水こ醇，冷卻，カロ入IOmlこ醚,振蕩lmin,4000rpm離心2min,獲得上層こ醚相和下層沉淀,將下層沉淀中加入5mlこ醚,振蕩lmin,4000rpm離心2min,合并所有上層こ醚相,減壓濃縮脫除溶劑，即獲得藻油井稱重，根據(jù)公式(2)計(jì)算微藻的含油率，結(jié)果見圖5所示。C、組2 (pH脅迫三天產(chǎn)油)7份藻液分別用lmol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1、3、5，用lmol/L氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH值至10、11、12、13。將7份調(diào)節(jié)pH值后的藻液在室溫(25 30°C)靜置3天，其它操作同組1，根據(jù)公式(2)計(jì)算微藻的含油率，結(jié)果見圖5所示。d、組3 (pH脅迫五天產(chǎn)油):將ー份藻液用體積濃度為5%的鹽酸水溶液調(diào)節(jié)pH值至5，將另ー份藻液用質(zhì)量濃度為5%的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH值至11。將2份調(diào)節(jié)pH值后的藻液在室溫(25 30°C)靜置5天，其它操作同組1，根據(jù)公式(2)計(jì)算微藻的含油率，結(jié)果見圖5所示。根據(jù)公式(I)計(jì)算微藻采收率η = ODe50·廁'0D^,ms mm χ j00%公式(丄)
肌 K(5l液 公式(I)中0D65(lnmigsai指新鮮微藻細(xì)胞接種在改良F/2培養(yǎng)液中，經(jīng)步驟(I)培養(yǎng)后獲得的藻液(即為原藻液)在650nm處的吸光度,OD65tlnm,pHI5sugjjfa是指將原藻液調(diào)整pH值靜置分層后上層清液在650nm處的吸光度。根據(jù)公式(2)計(jì)算微藻的含油率
權(quán)利要求
1.一種微藻培養(yǎng)及采收耦合快速積累藻油的方法，其特征在于所述方法為 (1)將新鮮微藻細(xì)胞以體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接種在相應(yīng)的微藻培養(yǎng)液中，通入空氣，在自然光照下，5 40°C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后，再在同樣條件下培養(yǎng)f 33d，獲得藻液； (2 )在步驟(I)獲得的藻液中加入堿性水溶液調(diào)節(jié)pH值為I(Γ13，或在步驟(I)獲得的藻液中加入酸性水溶液調(diào)節(jié)PH值為f 5，室溫靜置f 5d使藻液分層，獲得上層清液和下層沉淀，將下層沉淀過濾，取濾餅即獲得藻泥，將藻泥采用有機(jī)溶劑A浸提、索氏抽提或酸法提取處理，獲得所述藻油；所述有機(jī)溶劑A為下列之一こ醇、こ醚、こ酸こ酯或石油醚； (3)將步驟(2)的上層清液調(diào)節(jié)pH至7 8，獲得調(diào)節(jié)pH值后的上層清液，并檢測上層清液組成，將調(diào)節(jié)PH值后的上層清液各個(gè)組成補(bǔ)足至相應(yīng)微藻培養(yǎng)液組成，獲得再生微藻培養(yǎng)液，循環(huán)用于微藻培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求I所述微藻培養(yǎng)及采收耦合快速積累藻油的方法，其特征在于步驟(I)所述微藻為淡水微藻或海洋微藻。
3.如權(quán)利要求I所述微藻培養(yǎng)及采收耦合快速積累藻油的方法，其特征在于步驟(I)所述微藻為下列之一眼擬點(diǎn)微綠球藻、杜氏鹽藻、葡萄藻或小球藻。
4.如權(quán)利要求I所述微藻培養(yǎng)及采收耦合快速積累藻油的方法，其特征在于所述方法為 (O將新鮮微藻細(xì)胞以體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接種在相應(yīng)的微藻培養(yǎng)液中，通入空氣，在自然光照下，5 40°C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后，再在同樣條件下培養(yǎng)fl5d，獲得藻液；所述微藻為海洋微藻；所述相應(yīng)的微藻培養(yǎng)液為改良F/2培養(yǎng)液，終濃度組成為NaN0325 1350mg/L、NaH2PO4 · 2H205 270mg/L、Na2SiO3 · 9H20 20mg/L、Na2EDTA 4. 36mg/L、FeCl3 ·6Η203· 16mg/L、CuSO4 · 5H20 0. 01mg/L、ZnSO4 · 7H20 0. 023mg/L、CoCl2 · 6H200. 012mg/L、MnCl2 · 4H20 0. 18mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 07mg/L、VB1O. I μ g/L、VB2O. 5 μ g/L、生物素0. 5 μ g/L,溶劑為水，pH值為7 8 ； (2)在步驟(I)獲得的藻液中加入堿性水溶液調(diào)節(jié)pH值為1(Γ13，或在步驟(I)獲得的藻液中加入酸性水溶液調(diào)節(jié)PH值為f 5，室溫靜置f5d使藻液分層，獲得上層清液和下層沉淀，將下層沉淀過濾，取濾餅即獲得藻泥，將藻泥采用有機(jī)溶劑B浸提、索氏抽提或酸法提取處理，獲得所述藻油；所述有機(jī)溶劑B為下列之一こ醇、こ醚、こ酸こ酯或石油醚； (3)將步驟(2)的上層清液調(diào)節(jié)pH至7 8，獲得調(diào)節(jié)pH值后的上層清液，在調(diào)節(jié)pH值后的上層清液中加入硝酸鈉和磷酸ニ氫鈉，使硝酸鈉的終濃度為25 1350mg/L、磷酸ニ氫鈉的終濃度為5 270mg/L，獲得再生后的改良F/2培養(yǎng)液，循環(huán)用于微藻培養(yǎng)。
5.如權(quán)利要求4所述微藻培養(yǎng)及采收耦合快速積累藻油的方法，其特征在于步驟(I)所述微藻為眼擬點(diǎn)微綠球藻。
6.如權(quán)利要求4所述微藻培養(yǎng)及采收耦合快速積累藻油的方法，其特征在于步驟(I)所述培養(yǎng)溫度為25 30°C。
7.如權(quán)利要求4所述微藻培養(yǎng)及采收耦合快速積累藻油的方法，其特征在于步驟(I)所述改良F/2培養(yǎng)液中NaNO3的終濃度為225 1350mg/L，相應(yīng)氮磷質(zhì)量比為4:1。
8.如權(quán)利要求4所述微藻培養(yǎng)及采收耦合快速積累藻油的方法，其特征在于步驟(2)所述堿性水溶液為氫氧化鈉水溶液或氫氧化鉀水溶液，所述酸性水溶液為硫酸水溶液或鹽酸水溶液。
9.如權(quán)利要求4所述微藻培養(yǎng)及采收耦合快速積累藻油的方法，其特征在于步驟(2)所述在步驟(I)獲得的藻液中加入堿性水溶液調(diào)節(jié)PH值為11，室溫靜置3d使藻液分層，獲得上層清液和下層沉淀。
10.如權(quán)利要求I或4所述微藻培養(yǎng)及采收耦合快速積累藻油的方法，其特征在于步驟(2)藻泥按下列方法之ー進(jìn)行處理，提取藻油①有機(jī)溶劑浸提將步驟(2)獲得的藻泥在70°C下干燥12小時(shí)，獲得干藻粉a，在干藻粉a中以質(zhì)量比2:1加入石英砂a，碾磨30min，再加入有機(jī)溶劑C，在室溫下浸提12小時(shí)，過濾，獲得濾液和濾餅，將濾餅用相同有機(jī)溶劑C在同樣條件下浸提3次，合并所有濾液，將濾液減壓濃縮脫除溶劑，得到藻油；所述有機(jī)溶劑C為下列之一こ醇、こ醚、こ酸こ酯或石油醚；所述有機(jī)溶劑C的體積用量以干藻粉a質(zhì)量計(jì)為5ml/g 索氏抽提將步驟(2)獲得的藻泥在70°C下干燥12小時(shí)，獲得干藻粉b，在干藻粉b中以質(zhì)量比2:1加入石英砂b，碾磨30min，加入有機(jī)溶劑D，在索氏抽提器中抽提10小時(shí)，將抽提液減壓濃縮脫除溶剤，即得藻油；所述有機(jī)溶劑D為下列之一こ醇、こ醚、こ酸こ酯或石油醚；所述有機(jī)溶劑D的體積用量以干藻粉b質(zhì)量計(jì)為5ml/g 酸性溶液提取將步驟(2)獲得的藻泥在70°C下干燥12小時(shí)，獲得干藻粉C，在干藻粉c中加入蒸餾水和濃鹽酸，在70°C水浴中放置20min，再加入無水こ醇，冷卻，加入こ醚a(bǔ)，振蕩lmin，4000rpm離心2min,獲得上層こ醚相和下層沉淀，在下層沉淀中加入こ醚b,振蕩lmin,4000rpm離心2min，合并所有上層こ醚相，減壓濃縮脫除溶劑，獲得藻油；所述蒸餾水、濃鹽酸、無水こ醇、こ醚a(bǔ)和こ醚b的體積用量均以干藻粉c質(zhì)量計(jì)分別為4ml/g、5ml/g、5ml/g、IOml/g和 5ml/g。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微藻培養(yǎng)及采收耦合快速積累藻油的方法將新鮮微藻細(xì)胞接種在相應(yīng)的微藻培養(yǎng)液中培養(yǎng)，獲得藻液，將藻液調(diào)節(jié)pH值靜置分層，上層清液回收循環(huán)用于微藻培養(yǎng)，下層沉淀采用有機(jī)溶劑浸提、索氏抽提或酸法提取藻油。本發(fā)明方法在微藻生長前期，通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)液中氮、磷濃度，提高微藻生物量；微藻生長后期，通過調(diào)節(jié)藻液的pH值，形成強(qiáng)堿或強(qiáng)酸環(huán)境，脅迫微藻快速積累藻油，同時(shí)使微藻絮凝脫水，采收微藻，從而實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)與采收耦合，簡化操作過程，縮短生產(chǎn)時(shí)間；培養(yǎng)液的循環(huán)利用既節(jié)省了培養(yǎng)成本，又避免了培養(yǎng)液排放對(duì)環(huán)境造成的污染。
文檔編號(hào)C12R1/89GK102839127SQ201210308939
公開日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2012年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月28日
發(fā)明者陸向紅, 計(jì)建炳, 竇曉, 盧美貞 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)