專利名稱：一種小肽螯合銅復(fù)合物的制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種小肽螯合銅復(fù)合物的制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
動物為了保證每一個細(xì)胞，組織，器官，腺體及系統(tǒng)的正常功能需要特定的微量元素，微量元素是動物不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)，日糧中添加一定高質(zhì)量、高利用率的微量元素對動物健康和最大限度發(fā)揮其生產(chǎn)潛力具有十分重要的作用(NRC，1998 ；Richards,2008)。銅是動物體必需的微量元素之一，是動物體內(nèi)許多酶(如酪氨酸酶、胺氧化酶、抗壞血酸氧化酶、亞鐵氧化酶、超氧化物歧化酶和細(xì)胞色素氧化酶)組成成分，參與機(jī)體代謝。當(dāng)機(jī)體缺銅時，多種酶的活性降低。導(dǎo)致貧血、心臟肥大、骨變形、主動脈瘤、肌肉間出血、毛發(fā)褪色、脊髓的脫鞘髓。大量的研究已經(jīng)證實(shí)，銅對動物機(jī)體的免疫系統(tǒng)有著重要影 響，適當(dāng)水平的銅元素含量對維持免疫功能的正常至關(guān)重要。由于無機(jī)微量元素之間存在相互拮抗作用，比如銅、鋅之間，鐵、鋅之間，導(dǎo)致吸收利用率降低。人們多超量添加希望解決缺乏問題，但不僅效果有限，還產(chǎn)生了對環(huán)境的污染(Cao, 1997)。微量元素的缺乏能夠?qū)е略S多動物代謝甚至臨床疾病的發(fā)生。在家畜和禽類生產(chǎn)過程中，微量元素的缺乏直接導(dǎo)致生長緩慢和飼料轉(zhuǎn)化效率下降(NRC，1998)?，F(xiàn)在有機(jī)微量元素已成為國內(nèi)外飼料及養(yǎng)殖行業(yè)研究的熱點(diǎn)。目前，市場上常見的有機(jī)微量元素主要為有機(jī)酸類微量元素和氨基酸螯合微量元素。從上世紀(jì)80年代開始出現(xiàn)以富馬酸鐵，葡萄糖酸鋅等為代表的有機(jī)酸類微量元素。第二代的簡單有機(jī)鹽，雖然穩(wěn)定性好，但與部分營養(yǎng)物質(zhì)仍會發(fā)生拮抗作用。在消化吸收過程中受影響的因素也較多，生物學(xué)利用率仍較低。金屬離子與氨基酸分子通過配位鍵結(jié)合后，使其分子內(nèi)電荷趨于中性，形成了較穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)(黃雪等，2008;)。但在瘤胃或單胃內(nèi)酸環(huán)境下的穩(wěn)定性問題一致沒有很好地解決(梁建光等，2008)。因此，研發(fā)一類生物學(xué)利用率高，在瘤胃或單胃內(nèi)酸環(huán)境下的穩(wěn)定性好的有機(jī)銅元素具有十分重要的市場意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種小肽螯合銅復(fù)合物的制備方法。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是
一種小肽螯合銅復(fù)合物的制備方法，包括如下步驟
1)將蛋白原料、碳源和水配制成培養(yǎng)液，滅菌；
2)將芽孢菌接種到滅菌后的培養(yǎng)液中，30 37°C下振蕩培養(yǎng)18 30h后，加入蛋白酶，35 50°C，pH6. O 7. 5，繼續(xù)酶解6 12h，得到小肽發(fā)酵液；或者是往培養(yǎng)液中加入蛋白酶，35 50°C，pH6. O 7. 5，酶解6 12h后，接種芽孢菌，30 37°C下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)18 30h，得到小肽發(fā)酵液；
3)測定小肽發(fā)酵液中小肽的含量，滅酶后，繼續(xù)加入水溶性銅鹽，混合均勻，控制反應(yīng)溫度在55 65 °C，pH為5 6，進(jìn)行螯合反應(yīng)；
4)將反應(yīng)產(chǎn)物干燥，得到小肽螯合銅復(fù)合物。所述蛋白原料為 柏、大米蛋白粉、小麥蛋白粉、玉米蛋白粉、棉柏蛋白、花生柏、馬鈴薯蛋白、菜柏、大豆?jié)饪s蛋白中的至少一種。所述碳源為葡萄糖、蔗糖、淀粉中的至少一種。以上原料均可在原料市場購得。每IOOml培養(yǎng)液中，含有蛋白原料20 30g、碳源O. I lg。所述芽孢菌為地衣芽孢桿菌iBaciIlus Iicheniformis)或/和枯草芽孢桿菌{BeilIus subtilis、或 I 和納豆芽抱桿菌Cfeci77w5· natto、。

所述芽孢菌的接種濃度為5 X IO7 IOX 107cfu/ml培養(yǎng)液。所述蛋白酶為中性蛋白酶，加入量為400 700U/g蛋白原料。步驟3)中，小肽與水溶性銅鹽的摩爾比為I 3 :1。所述水溶性銅鹽為堿式氯化銅、硫酸銅和氯化銅中的至少一種。上述方法制備得到的小肽螯合銅復(fù)合物作為飼料添加劑的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果在于
本發(fā)明小肽螯合銅制備方法的螯合率高，達(dá)到94%以上，所得到的小肽螯合銅復(fù)合物在動物胃內(nèi)的穩(wěn)定性好，營養(yǎng)更加全面，可用作飼用添加劑，補(bǔ)充日糧的微量元素，提高動物體的免疫機(jī)能。


圖I是標(biāo)準(zhǔn)蛋白的分子量和出峰時間曲線圖 圖2是小肽發(fā)酵液凝膠G-15洗脫圖譜。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不僅限于此。以下實(shí)施例中所用到的菌液按以下方法制備
從斜面試管培養(yǎng)基中刮取一環(huán)地衣芽孢桿菌Iicheniformis)或枯草芽孢桿菌iBcillus或納豆芽孢桿菌{Bacillus菌種加入到液體培養(yǎng)基中,搖
瓶培養(yǎng)。搖瓶種子培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件為葡萄糖1%、酵母膏O. 5%、蛋白胨O. 5%、牛肉膏O. 5%、食鹽O. 05%、磷酸二氫鉀O. 1%。pH=7. 0-7. 2、121°C滅菌18分鐘。于32°C恒溫?fù)u床中，200r/min振蕩培養(yǎng)24h，得到菌種液。以上三個菌種購自廣東省微生物菌種保藏中心，地衣芽孢桿菌(McilliisIi cheni formi s )和枯草芽抱桿菌 C5ci77w5· subtil is、的編號分別為 GIM1. 8=AS1. 518,GIM1. 19=AS1. 210。以下實(shí)施例中所用到的中性蛋白酶購自肇東市日成酶制劑有限公司，商品型號為AS. 1398，酶活力為 50000U/g。以下實(shí)施例中所用到的檢測方法和計算公式如下所示
一、檢測小肽發(fā)酵液中小肽的含量及小肽轉(zhuǎn)化率
I、原理小肽發(fā)酵液中的大分子蛋白質(zhì)和肽鏈較長的多肽用三氯醋酸溶液進(jìn)行沉淀，并將其中的短鏈小肽用酸溶解出來，其中包括小肽和部分α-氨基酸。然后經(jīng)離心、過濾、消化、蒸懼，測定其蛋白質(zhì)含量即酸溶蛋白。本方法參照大豆肽粉(Soy peptides powder)中華人民共和國輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(QB/ T 2653 -2004)修訂而成。2、試劑及儀器
IOOml燒杯；10ml，25ml移液管；半微量粗蛋白質(zhì)測定試劑和裝置；15%三氯醋酸溶液(TCA溶液)；4500轉(zhuǎn)/分鐘的離心機(jī)。3、方法
取樣將小肽發(fā)酵液攪拌均勻后，取IOml樣品，80°C烘干，準(zhǔn)確稱重，用于測定小肽含量，重復(fù)三次。具體步驟如下
樣品用水溶解，用玻璃棒攪拌均勻，無損的移入IOOml容量瓶中，定容至刻度(100 ml總樣本液)靜止10分鐘。搖動容量瓶取15ml渾濁液用離心機(jī)4500轉(zhuǎn)離心10分鐘，取IOml上清液注入試管管中，再加入15%三氯醋酸10ml，靜止沉降15分鐘后，用定性濾紙過濾。取濾液IOml (相當(dāng)于用于消化的樣本液為5ml)注入干燥的消化管中，加入硫酸銅O. 2g，硫酸鈉3g，再加濃硫酸10ml，消化方法及蒸餾方法與凱氏定氮法相同。樣品中肽含量的計算公式
權(quán)利要求
1.一種小肽螯合銅復(fù)合物的制備方法，包括如下步驟 1)將蛋白原料、碳源和水配制成培養(yǎng)液，滅菌； 2)將芽孢菌接種到滅菌后的培養(yǎng)液中，30 37°C下振蕩培養(yǎng)18 30h后，加入蛋白酶，35 50°C，pH6. O 7. 5，繼續(xù)酶解6 12h，得到小肽發(fā)酵液；或者是往培養(yǎng)液中加入蛋白酶，35 50°C，pH6. O 7. 5，酶解6 12h后，接種芽孢菌，30 37°C下繼續(xù)振蕩培養(yǎng)18 30h，得到小肽發(fā)酵液； 3)測定小肽發(fā)酵液中小肽的含量，滅酶后，繼續(xù)加入水溶性銅鹽，混合均勻，控制反應(yīng)溫度在55 65 °C，pH為5 6，進(jìn)行螯合反應(yīng)； 4)將反應(yīng)產(chǎn)物干燥，得到小肽螯合銅復(fù)合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的小肽螯合銅復(fù)合物的制備方法，其特征在于所述蛋白原料為豆柏、大米蛋白粉、小麥蛋白粉、玉米蛋白粉、棉柏蛋白、花生柏、馬鈴薯蛋白、菜柏、大豆?jié)饪s蛋白中的至少一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的小肽螯合銅復(fù)合物的制備方法，其特征在于所述碳源為葡萄糖、蔗糖、淀粉中的至少一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的小肽螯合銅復(fù)合物的制備方法，其特征在于每IOOml培養(yǎng)液中，含有蛋白原料20 30g、碳源O. I lg。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的小肽螯合銅復(fù)合物的制備方法，其特征在于所述芽孢菌為地衣芽抱桿菌{Bacillus licheniformi s')或/和枯草芽抱桿菌iBcillus subtil is)或/和納豆芽抱桿菌natto)。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的小肽螯合銅復(fù)合物的制備方法，其特征在于所述芽孢菌的接種濃度為5 X IO7 IOX 107cfu/ml培養(yǎng)液。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的小肽螯合銅復(fù)合物的制備方法，其特征在于所述蛋白酶為中性蛋白酶，加入量為400 700U/g蛋白原料。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的小肽螯合銅復(fù)合物的制備方法，其特征在于步驟3)中，小肽與水溶性銅鹽的摩爾比為I 3 :1。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的小肽螯合銅復(fù)合物的制備方法，其特征在于所述水溶性銅鹽為堿式氯化銅、硫酸銅和氯化銅中的至少一種。
10.權(quán)利要求I 9任一項(xiàng)的方法制備得到的小肽螯合銅復(fù)合物作為飼料添加劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種小肽螯合銅復(fù)合物的制備方法與應(yīng)用。制備方法包括如下步驟將蛋白原料、碳源和水配制成培養(yǎng)液，滅菌；將芽孢菌和蛋白酶接到培養(yǎng)液中，發(fā)酵酶解或酶解發(fā)酵，得到小肽發(fā)酵液；繼續(xù)加入水溶性銅鹽，控制反應(yīng)溫度在55～65℃，pH為5～6，螯合反應(yīng)；將反應(yīng)物干燥，得到小肽螯合銅復(fù)合物。本發(fā)明小肽螯合銅制備方法的螯合率高，達(dá)到94%以上，所得到的小肽螯合銅復(fù)合物在動物胃內(nèi)的穩(wěn)定性好，并含有多種生物活性成分，營養(yǎng)更加全面，可用作飼用添加劑，補(bǔ)充日糧的微量元素，提高動物體的免疫機(jī)能。
文檔編號C12R1/125GK102827910SQ20121027295
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月2日
發(fā)明者潘軍, 張偉強(qiáng), 王瑞平, 蘇全, 馬春平 申請人:廣州市博善生物飼料有限公司