專利名稱：天山凍土中產(chǎn)低溫中性蛋白酶菌株篩選及培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種從新疆天山凍土中篩選得到的產(chǎn)低溫中性蛋白酶菌株P(guān)seudomonas sp.(假單胞菌屬)N_8 ;本發(fā)明還涉及該菌株的特性及發(fā)酵條件的優(yōu)化。
背景技術(shù)：
天山凍土屬于我國高海抜高山常年凍土，凍土環(huán)境中微生物產(chǎn)生一系列適應(yīng)低溫、寡營養(yǎng)、強(qiáng)輻射、凍融等極端因子的分子機(jī)制，為低溫微生物生理多祥性提供了可能。低溫酶由于在低溫環(huán)境下具有較高的酶活性，有助于在保證催化效率的前提下降低反應(yīng)溫度和縮短反應(yīng)時間，從而大幅度節(jié)約能源，因而在食品加工、日化產(chǎn)品、皮革加工等需要低溫催化的行業(yè)如中具有較高的開發(fā)利用價值。目前發(fā)現(xiàn)產(chǎn)低溫蛋白酶的菌有假單胞 菌屬(Psedomonas)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、氣單抱菌屬(Aeromonas)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、弧菌屬(Vibrio)。這些低溫菌在永久性低溫環(huán)境下經(jīng)過長期的進(jìn)化適應(yīng)，已有著適應(yīng)低溫環(huán)境的特殊結(jié)構(gòu)與生理生化機(jī)制。它們所產(chǎn)生的低溫蛋白酶也有著獨(dú)特的生理生化特征與結(jié)構(gòu)特征。有關(guān)低溫微生物的資源勘探與代謝活性產(chǎn)物研究，已成為國際微生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，我國的ー些研究機(jī)構(gòu)也積極開展低溫蛋白酶生產(chǎn)菌株的篩選エ作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的從新疆天山凍土中篩選得到的產(chǎn)低溫中性蛋白酶菌株，經(jīng)鑒定為假單胞菌N-8 (Pseudomonas sp. N-8)，2012年6月26日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(中國.武漢.武漢大學(xué))，保藏編號為CCTCC NO M 2012251。通過單因素試驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。I、菌株篩選方法，包括以下步驟(I)初篩吸取富集后的培養(yǎng)液用倍比稀釋法制不同的稀釋度移入初篩平板中，涂勻，15°C培養(yǎng)。待菌落長好后，挑選透明圈較大菌株，斜面保存。(2)復(fù)篩以40°C為上限生長溫度，即在該溫度不生長的菌株為耐冷菌。將初篩得到的產(chǎn)蛋白酶菌株在初篩平板上點(diǎn)樣，在40°C不生長的菌株，為試驗(yàn)菌株。以酪蛋白為底物，采用福林(Folin)試劑顯色法測定酶活，進(jìn)ー步篩選出產(chǎn)酶能力強(qiáng)的菌株。2、菌株生長特性、形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)(I)生長特征該菌株生長范圍為0_40°C，最適生長溫度為20°C，最適生長pH為7. O ；(2)菌體特征革蘭氏陰性菌，菌體呈桿狀，細(xì)胞單個，大小為(O. 5-0. 8) X (2. 0-3. 2) μ m，有莢膜，有鞭毛；(3)菌落特征在酪蛋白平板上，菌落呈圓形，乳白色，不透明，表面光滑，邊緣整齊，易挑取，產(chǎn)生明顯的透明圈；(4)生理生化特征該菌株接觸酶、精氨酸雙水解酶、硝酸鹽(還原)反應(yīng)為陽性，能水解明膠，硫化氫試驗(yàn)、伏一普ニ氏試驗(yàn)(VP)、甲基紅試驗(yàn)(MR)為陰性，不能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、纖維ニ糖、鼠李糖、棉子糖。3、發(fā)酵條件優(yōu)化(I)通過單因素試驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。表I培養(yǎng)基組成的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果
權(quán)利要求
1.天山凍土中產(chǎn)低溫中性蛋白酶菌株篩選方法，包括以下步驟 (1)初篩吸取富集后的培養(yǎng)液用倍比稀釋法制不同的稀釋度移入初篩平板中，涂勻，15°C培養(yǎng)。待菌落長好后，挑選透明圈較大菌株，斜面保存。
(2)復(fù)篩以40°C為上限生長溫度，即在該溫度不生長的菌株為耐冷菌。將初篩得到的產(chǎn)蛋白酶菌株在初篩平板上點(diǎn)樣，在40°C不生長的菌株，為試驗(yàn)菌株。以酪蛋白為底物，采用福林(Folin)試劑顯色法測定酶活，進(jìn)ー步篩選出產(chǎn)酶能力強(qiáng)的菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種Pseudomonassp. N_8,具有以下特征 (1)生長特征該菌株最適生長溫度為20°C;最適生長pH為7. O ; (2)菌體特征革蘭氏陰性菌，菌體呈桿狀，細(xì)胞單個，大小為(O.5-0. 8) X (2. 0-3. 2)μ m，有莢膜，有鞭毛； (3)菌落特征在酪蛋白平板上，菌落呈圓形，乳白色，不透明，表面光滑，邊緣整齊，易挑取，產(chǎn)生明顯的透明圈； (4)生理生化特征該菌株接觸酶、精氨酸雙水解酶、硝酸鹽(還原)反應(yīng)為陽性，能水解明膠，硫化氫試驗(yàn)、伏一普ニ氏試驗(yàn)(VP)、甲基紅試驗(yàn)(MR)為陰性，不能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、纖維ニ糖、鼠李糖、棉子糖。
3.ー種利用Pseudomonas sp. N_8產(chǎn)低溫中性蛋白酶發(fā)酵條件的優(yōu)化 (1)通過單因素試驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對其發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，最佳培養(yǎng)基配方為(g/L)葡萄糖10，酵母粉8，酪蛋白20, K+O. 4 ； (2)通過單因素試驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對其培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最佳培養(yǎng)條件為種齡24h，起始PH7，接種量4%，裝液量50mL/250mL。
全文摘要
本發(fā)明是從新疆天山凍土中篩選得到的產(chǎn)低溫中性蛋白酶菌株P(guān)seudomonas sp.(假單胞菌屬)N-8。該菌株為革蘭氏陰性菌，菌體呈桿狀，細(xì)胞單個，大小為(0.5-0.8)×(2.0-3.2)μm，有莢膜，有鞭毛；在酪蛋白平板上，菌落呈圓形，乳白色，不透明，表面光滑，邊緣整齊，易挑取，產(chǎn)生明顯的透明圈。該菌株最適生長溫度為20℃；最適生長pH為7.0。通過單因素試驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(g/L)葡萄糖10，酵母粉8，酪蛋白20，K+0.4，pH7.0；最佳培養(yǎng)條件為種齡24h，起始pH7，接種量4％，裝液量50mL/250mL。
文檔編號C12N1/02GK102864099SQ20121022873
公開日2013年1月9日 申請日期2012年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月4日
發(fā)明者楊瑞金, 祁丹丹, 趙偉 申請人:江南大學(xué)