專利名稱：一種用于制備微陣列細胞芯片的細胞芯片片基及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細胞芯片技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于制備微陣列細胞芯片的細胞芯片片基及制備方法。
背景技術(shù)：
生物芯片技術(shù)，也稱生物微陣列技術(shù)，是指先將大量分子(基因、蛋白、組織、細胞等分子)以陣列方式固定于支持物上，然后與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度進而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息，以實現(xiàn)對細胞、蛋白質(zhì)、基因及其他生物組分的準確、快速、大信息量的檢測。具有其它傳統(tǒng)方法無法比擬的優(yōu)越性，已被廣泛應用于生命科學研究和醫(yī)學診斷中，主要包括基因芯片、蛋白芯片(包括抗體芯片、抗原芯片)、組織芯片和細胞芯片等等。其中細胞芯片是一種以細胞作為研究對象的一種生物芯片技術(shù)，是對基因芯片和蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的重要補充，是適應后基因組時代人類對生命科學探索的要求而產(chǎn)生的。細胞芯片技術(shù)既保持傳統(tǒng)的細胞研究方法的優(yōu)點如原位檢測等，又滿足了高通量獲取活細胞信息等方面的要求。可以預見，細胞芯片技術(shù)作為一種新興的高通量細胞水平的研究手段和傳統(tǒng)的研究方法相結(jié)合，已經(jīng)在基因檢測、基因表達、多態(tài)性分析、藥物篩選和疾病診斷等諸多領(lǐng)域顯示出重要的作用。按照細胞芯片的功能和制作方式主要分為以下四類(I)整合的微流體細胞芯片(an integrated microf luidic system)這是一種高度平行化、自動化的集成微型芯片裝置，對細胞樣品具有預處理和分析的能力，又稱微全分析系統(tǒng)(integrated micro total analysis system, μ TAS)。通過在芯片上構(gòu)建各種微流路通道體系，并運用不同的方法在流體通道體系中準確控制細胞的傳輸、平衡與定位，進而實現(xiàn)對細胞樣品進行藥物刺激等實驗過程的原位監(jiān)測和細胞組分的分析等研究。在此基礎(chǔ)上，通過改變流路和分離、排列、定位細胞所需空間的微孔或溝槽等結(jié)構(gòu)而又衍生出不同亞型，用于細胞的多參數(shù)檢測篩選。整合的微流體細胞芯片制作方法多樣，內(nèi)容涉及細胞的固定培養(yǎng)、鑒定篩選、分化刺激、原位檢測、藥物開發(fā)篩選和組分分析等各個方面。類型不一、發(fā)展較快、應用廣泛，(2)微量電穿孔細胞芯片(microelectroporation cell chip)微量電穿孔細胞芯片是將電穿孔技術(shù)與生物芯片技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，是細胞操作調(diào)控微型化的一種手段。該技術(shù)采用一種微型裝置，將細胞與芯片上的電子集成電路相結(jié)合，利用細胞膜微孔的滲透性，通過控制電子集成電路使細胞面臨一定的電壓，電壓使細胞膜微孔張開，從而在不影響周圍細胞的情況下可將外源DNA、RNA、蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸和藥物試劑等生物大分子或制劑等順利的導入或從靶細胞中提取出來。這種技術(shù)為研究細胞間遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)導、變異、表達以及控制細胞內(nèi)化學反應提供了可能。Shin等(ShinYS, Anal Chem, 2004, 76(23) :7045-7052.)運用聚二甲基硅氧烷等材料構(gòu)建了電穿孔細胞芯片，通過指數(shù)衰變式脈沖發(fā)生器對通道內(nèi)的細胞進行電穿孔實驗，原位觀察了碘化丙啶被SK0V3細胞株吸收的全過程，并成功將綠色熒光標志的蛋白基因轉(zhuǎn)染了 SK0V3細胞，監(jiān)測活細胞內(nèi)DNA逆?zhèn)鞯囊?guī)律。此外，還有學者采用納米針和納米管等顯微操作在芯片上構(gòu)建納米通道，完成單細胞注射或樣品提取。(3)細胞免疫芯片(cell immunochip)細胞免疫芯片是目前應用范廣、經(jīng)濟實用的生物芯片技術(shù)，是在蛋白質(zhì)芯片的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。嚴格的講應屬于蛋白芯片，是采用抗體芯片進行目的細胞捕獲的微陣列芯片。
細胞免疫芯片的制備主要以玻片為片基，通過將相應的抗原或抗體固相化于經(jīng) 過二維或三維修飾的玻片等載體上制成抗原或抗體芯片，將待檢測細胞懸液(熒光標記或非標記)與芯片孵育，利用免疫反應原理，特異性捕獲靶細胞，而后通過免疫學、化學方法、酶學等檢測方法(如熒光標記、酶標記及放射標記等)完成對捕獲細胞進行功能和表型研究。例如 Zhang 等(Zhang CX, Electrophoresis, 2003, 24(18) : 3279-83)將抗體固定在瓊脂糖修飾的玻片上捕獲目的細胞。Belov等(Belov L, Cancer Res, 2001，61 (11) :4483-9)運和Revzin等(RevzinA，Lab Chip, 2005,5(1) :30-37)分別利用抗體芯片進行白血病免疫分型實驗。顯示了細胞免疫芯片應用在白血病免疫診斷及預后判定方面的誘人前景。同樣，細胞免疫芯片在新藥物的開發(fā)篩選等方面亦將提供強有力的技術(shù)支持，不僅可以提高藥物開發(fā)的效率，而且實現(xiàn)了藥物篩選的敏感性、高通量和自動化的集成。(4)微陣列細胞芯片微陣列細胞芯片是直接將細胞以陣列方式固化于支持物上形成的細胞芯片。目前主要通過以下兩種方法制備方法一先將細胞包埋于特殊的載體內(nèi)，進行細胞處理，再制備細胞蠟塊，最后利用病理切片制備的細胞芯片。例如，中國專利局申請?zhí)枮?00410073348. X的發(fā)明專利先將細胞樣本通過瓊脂糖包埋于陣列管空腔內(nèi)進行脫水、透明、浸蠟等處理，再將細胞瓊脂包埋塊包埋入具有陣列孔的石臘塊中，制成細胞芯片石蠟包埋塊，最后經(jīng)過切片、染色即可完成細胞芯片的制備。中國專利局申請?zhí)枮?00410022819. 4的專利公開了一種細胞芯片，其制作方法為將經(jīng)固定、脫水、透明處理后的細胞浸蠟制成條狀石蠟細胞芯條，然后直接將其按序放置于受體石蠟塊中，利用膠帶轉(zhuǎn)移輔助系統(tǒng)進行切片，制成不同密度的細胞芯片。中國專利局申請?zhí)枮?01010207379. 5的專利公開了一種三維細胞芯片的制備方法。該方法先制備細胞-溶膠的懸浮液，細胞以三維培養(yǎng)的方式生長，再制備微孔陣列，最后打印細胞到微孔陣列中制成細胞芯片。方法二 先制作腔室狀細胞培養(yǎng)小池，待細胞培養(yǎng)完成后，拆開腔室狀裝置，制成細胞微陣列，再進行細胞學檢測。例如，中國專利局申請?zhí)枮?00810114115. 8的發(fā)明專利公開了一種用于芯片封裝的培養(yǎng)池，培養(yǎng)池為經(jīng)整體注塑成型的不可分割的整體，包括大小兩個腔體和與之相匹配的蓋，小腔體位于所述大腔體之內(nèi)，小腔體為一無底的通腔，大腔體有底，且與小腔體的
壁完全相連。目前，已上市的具有腔室狀細胞培養(yǎng)小池結(jié)構(gòu)，并可作為微陣列細胞芯片的主要有Lab-Tek 腔室載玻片系統(tǒng)(Thermo Scientific Nunc公司)和Falcon細胞培養(yǎng)載玻片(BD公司)。 Lab-Tek 腔室載玻片系統(tǒng)由載玻片、一個獨特的可拆卸多腔室結(jié)構(gòu)和腔室蓋玻片組成，采用醫(yī)用級硅膠密封墊圈將載玻片腔室結(jié)構(gòu)連接成培養(yǎng)小室，利于貼壁細胞直接在顯微鏡載玻片上生長，等細胞生長后拆卸掉腔室結(jié)構(gòu)，在同一塊載玻片上進行染色和顯微鏡觀察。與此類似，BD公司的Falcon細胞培養(yǎng)載玻片，也是由經(jīng)預處理的細胞培養(yǎng)載玻片、塑料槽構(gòu)成，培養(yǎng)時可盛放培養(yǎng)液，細胞直接在玻片上生長，培養(yǎng)后移除塑料槽，進行基因、蛋白的研究。顯然，采用現(xiàn)有制備微陣列細·胞芯片的技術(shù)方法均較為繁瑣，使用不便。例如，方法一需要先將培養(yǎng)的細胞逐一包埋入特殊的載體內(nèi)進行處理后，制備細胞蠟塊，再利用病理切片技術(shù)制備細胞芯片。而方法二中用于細胞培養(yǎng)的腔室狀培養(yǎng)小池結(jié)構(gòu)復雜，由不同材質(zhì)的多個部件構(gòu)成，還需密封連接，制作工序復雜。而且，細胞培養(yǎng)完成后，還需拆開腔室狀裝置，方能獲得制成細胞微陣列，再進行細胞學檢測?？梢姡捎媚壳艾F(xiàn)有的技術(shù)制備微陣列細胞芯片仍存在上述所指出的缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于提供一種用于制備微陣列細胞芯片的細胞芯片片基及制備方法，該細胞芯片片基結(jié)構(gòu)簡單，使用制備方便，克服了利用現(xiàn)有技術(shù)制備高密度細胞芯片時的局限性的缺陷。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種用于制備微陣列細胞芯片的細胞芯片片基，包括基板和封固蓋，基板上設(shè)有以陣列方式分布的陣列孔，陣列孔的底部透明且位于同一水平面；封固蓋上設(shè)有與基板的陣列孔相匹配的空心的陣列柱，陣列柱可伸入相應的陣列孔內(nèi)，陣列柱的底部透明且位于同一水平面。所述的封固蓋上還設(shè)有完全覆蓋封固蓋的保護蓋。所述的陣列孔為柱體形，其底部為圓形、橢圓形、三角形、長方形、菱形或正多邊形。所述的陣列孔的底部厚度為O. 15 I. 5mm,陣列孔內(nèi)徑為I 20mm,陣列孔深度為I. O 10. Omm ;陣列柱的厚度為O. 15mm I. 5mm。所述的陣列孔的底部厚度為O. 17 I. 2mm,陣列孔內(nèi)徑為I. O 6. 4mm,陣列孔深度為2. Omm 10. Omm ;陣列柱的厚度為O. 17 I. 2mm。所述的陣列柱的外徑小于陣列孔的內(nèi)徑且相差不超過I. Omm,陣列柱伸入陣列孔后陣列柱的底部與陣列孔的底部間隙小于I. 0mm。所述的基板和封固蓋為一次成型技術(shù)制作的基板和封固蓋。所述的基板和封固蓋采用耐有機溶劑腐蝕的透明材質(zhì)制成?；谒黾毎酒募毎酒苽浞椒ǎㄒ韵虏襟EI)將基板和封固蓋滅菌后，在陣列孔內(nèi)加入培養(yǎng)基后接種細胞或者接種經(jīng)預富集和細胞密度測定的胸腹水細胞懸液進行細胞培養(yǎng)，使細胞粘附于陣列孔的底部；2)細胞粘附于陣列孔的底部后，棄上清，加入固定劑進行細胞固定，然后進行細胞學實驗；或者棄上清后直接進行細胞學研究，操作過程中使用保護蓋防止污染；3)實驗結(jié)束后，在陣列孔內(nèi)細胞上滴加水溶性或脂溶性封片試劑，然后蓋上封固蓋，使陣列柱伸入相應的陣列孔內(nèi)進行封固；4)封固后得到微陣列細胞芯片。所述的細胞學實驗包括HE染色、巴氏染色、免疫熒光染色、細胞免疫化學，原位雜交或原位PCR ；封固后的微陣列細胞芯片還可采用正置顯微鏡、倒置顯微鏡或數(shù)字掃描顯微鏡進行攝取圖像和分析。 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果本發(fā)明提供的用于制備微陣列細胞芯片的細胞芯片片基，裝置構(gòu)造簡單，使用方便，非常適合于在醫(yī)學診斷、藥物開發(fā)、細胞生物學等領(lǐng)域推廣使用。使用該細胞芯片片基即可用于細胞芯片的制備，也可直接用于細胞培養(yǎng)和細胞病理學檢查。它可同時將多種細胞同時培養(yǎng)并固化于同一片基上的不同陣列孔內(nèi)制備微陣列細胞芯片，或?qū)⒓毎麘乙悍N植并固化于陣列孔的底部。這樣，在一張片基上即可包含多種(個)以規(guī)則的陣列方式排列的細胞，因此，可一次性同時對多種(個)細胞進行相同或不同的檢測指標的實驗研究。使用本發(fā)明的細胞芯片片基操作步驟簡單，可一次完成。使用該細胞芯片片基制備的細胞芯片可直接使用倒置顯微鏡或正置顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡或數(shù)字化顯微鏡或掃描儀進行圖像攝取和觀察、分析。采用一次成型技術(shù)可順利制備出所需的細胞芯片片基，制備簡單，成本低廉，無需將載玻片、密封圈、塑料腔室框等等不同材質(zhì)的部件聯(lián)合成一個整體的繁瑣工序。而且，由于制作細胞芯片片基的部件(基板、封固蓋、保護蓋)均采用耐有機溶劑腐蝕的透明材質(zhì)(如玻璃、聚丙烯等)，所以，后續(xù)的細胞培養(yǎng)、涂片、實驗、封片等均可在片基內(nèi)進行，免除了移除塑料槽等輔助操作步驟。采取本發(fā)明提供的技術(shù)方案，可簡單、方便地將細胞以規(guī)則的陣列方式固化于細胞芯片片基上，可一次性同時對多種細胞(體液)樣本進行實驗研究或細胞學檢查，不僅可直接進行活細胞的培養(yǎng)、實驗干預等，也可直接進行細胞內(nèi)靶分子的檢測和分析，明顯減少單個組織樣本操作處理的人為誤差(如處理時間、溫度不等，加樣不準確等因素)，顯著節(jié)約實驗時間、人力、物力和試劑。


圖I是細胞芯片片基組合前的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是細胞芯片片基的縱首I]面的不意圖；圖3是細胞芯片片基組合后的縱首I]面的不意圖；其中，I-基板2-封固蓋3-保護蓋4-陣列孔5-陣列柱6_陣列孔底部7_陣列柱底部8-底部間隙。圖4是采用細胞芯片片基制備的細胞芯片。圖5是采用細胞芯片片基制備的細胞芯片細胞學圖片。
具體實施方式
下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。參見圖I 圖3,—種用于制備微陣列細胞芯片的細胞芯片片基,包括基板I和封固蓋2，基板I上設(shè)有以陣列方式分布的陣列孔4，陣列孔4的底部透明且位于同一水平面；封固蓋2上設(shè)有與基板I的陣列孔4相匹配的空心的陣列柱5，陣列柱5可伸入相應的陣列孔4內(nèi)，陣列柱5的底部透明且位于同一水平面。陣列孔的深度均相同，陣列柱的高度也均相同?；錓的陣列孔4主要用來培養(yǎng)細胞，細胞在培養(yǎng)后粘附在陣列孔的底部，封固蓋可以用于實驗操作后在陣列孔4內(nèi)細胞表面滴加封片試劑后封固細胞，用于細胞芯片的顯微鏡檢查和保存。 封固蓋2上還設(shè)有完全覆蓋封固蓋2的保護蓋3，大小與基板I、封固蓋2板相匹配。保護蓋3可完整覆蓋于基板和封固蓋上，或可將封固蓋、保護蓋依次同時加蓋在基板上。在進行實驗操作和檢測過程中以及基板保存中蓋在基板和封固蓋上保護陣列孔內(nèi)的細胞不被污染。所述的陣列方式排列以規(guī)則的陣列方式排布，其橫向、縱向可根據(jù)具體的要求來設(shè)計。而陣列孔為柱體形，其底部為圓形、橢圓形、三角形、長方形、菱形或正多邊形，陣列柱的形狀與之相匹配。所述的陣列孔4的底部厚度為O. 15 I. 5mm,陣列孔4的內(nèi)徑為I 20mm,陣列孔4的深度為I. O 10. Omm ;陣列柱5的厚度為O. 15mm I. 5mm。并且優(yōu)選為陣列孔4的底部厚度為O. 17 I. 2mm,陣列孔4內(nèi)徑為I. O 6. 4mm,陣列孔4的深度為2. Omm 10. Omm ;陣列柱5的厚度為O. 17 I. 2_。陣列柱5的外徑小于陣列孔4的內(nèi)徑且相差不超過I. Omm,陣列柱5伸入陣列孔4后陣列柱底部7與陣列孔底部6之間的底部間隙8小于I. 0mm。該微陣列細胞芯片片基采用耐有機溶劑腐蝕的玻璃或聚丙烯材質(zhì)，按照上述設(shè)計要求，采用吹塑或注塑等一次成型技術(shù)分別制備；細胞芯片片基在制作時可以根據(jù)需要放大和縮小。所提供的細胞芯片片基可用于細胞芯片的制備和細胞培養(yǎng)及體液樣本的細胞學檢查。使用上述細胞芯片片基，采用如下方法就能十分方便快速的制備出高質(zhì)量細胞芯片。具體方法如下I)在滅菌后的用于制備細胞芯片的片基的基板I的陣列孔4內(nèi)按照常規(guī)方法種植適量密度的細胞懸液進行細胞培養(yǎng)，靜止培養(yǎng)，使細胞粘附于細胞芯片片基的陣列孔底部。2)倒掉上清后，進行固定，再進行細胞學實驗，如HE染色、巴氏染色、特殊染色、免疫熒光染色、細胞免疫化學，原位雜交、原位PCR等細胞學染色方法和細胞學研究方法，也可不經(jīng)過細胞固定而直接進行實驗。實驗過程中使用保護蓋3防止污染。3)實驗結(jié)束后，在陣列孔4內(nèi)細胞上滴加適量的水溶性或脂溶性封片試劑，加蓋與之匹配的封固蓋2，將封固蓋2上的空心陣列柱5插入相對應的基板陣列孔4中，對細胞芯片進行封固；
4)封固后得到微陣列細胞芯片，所制備的微陣列細胞芯片如圖4所示；即可采用相應圖像采集儀器(如正置顯微鏡或倒置顯微鏡或數(shù)字掃描顯微鏡等)攝取圖像，進行診斷和分析。所觀察到的細胞學圖片如圖5所示。因此，采取本發(fā)明所提供的技術(shù)方案，可簡單、方便地制備出所需的細胞芯片片基，且制備簡單，成本低廉。而且制作細胞芯片片基可用于細胞芯片的制備、細胞培養(yǎng)研究和胸腹水等體液的細胞學檢查等等。利用制備好的細胞芯片不僅可直接進行活細胞的培養(yǎng)、實驗干預等，也可直接進行細胞內(nèi)靶分子的檢測和分析。因此，可一次性同時對多種細 胞(體液)樣本進行原位雜交，免疫組化分析核酸和蛋白在細胞內(nèi)的定位和表達等實驗研究或細胞學檢查，使用本裝置及方法能夠迅速大量的一次成型制備出所需要的細胞芯片，明顯減少單個組織樣本操作處理的人為誤差，顯著節(jié)約實驗時間、人力、物力和試劑。
權(quán)利要求
1.一種用于制備微陣列細胞芯片的細胞芯片片基，其特征在于，包括基板和封固蓋，基板上設(shè)有以陣列方式分布的陣列孔，陣列孔的底部透明且位于同一水平面； 封固蓋上設(shè)有與基板的陣列孔相匹配的空心的陣列柱，陣列柱可伸入相應的陣列孔內(nèi)，陣列柱的底部透明且位于同一水平面。
2.如權(quán)利要求I所述的用于制備微陣列細胞芯片的細胞芯片片基，其特征在于，所述的封固蓋上還設(shè)有完全覆蓋封固蓋的保護蓋。
3.如權(quán)利要求I所述的用于制備微陣列細胞芯片的細胞芯片片基，其特征在于，所述的陣列孔為柱體形，其底部為圓形、橢圓形、三角形、長方形、菱形或正多邊形。
4.如權(quán)利要求I所述的用于制備微陣列細胞芯片的細胞芯片片基，其特征在于，所述的陣列孔的底部厚度為O. 15 I. 5mm,陣列孔內(nèi)徑為I 20mm，陣列孔深度為I. O 10. Omm ;陣列柱的厚度為O. 15mm I. 5mm。
5.如權(quán)利要求4所述的用于制備微陣列細胞芯片的細胞芯片片基，其特征在于，所述的陣列孔的底部厚度為O. 17 I. 2mm,陣列孔內(nèi)徑為I. O 6. 4mm,陣列孔深度為2. Omm 10. Omm ;陣列柱的厚度為O. 17 I. 2mm。
6.如權(quán)利要求I或4所述的用于制備微陣列細胞芯片的細胞芯片片基，其特征在于，所述的陣列柱的外徑小于陣列孔的內(nèi)徑且相差不超過I. Omm,陣列柱伸入陣列孔后陣列柱的底部與陣列孔的底部間隙小于I. 0mm。
7.如權(quán)利要求I所述的用于制備微陣列細胞芯片的細胞芯片片基，其特征在于，所述的基板和封固蓋為一次成型技術(shù)制作的基板和封固蓋。
8.如權(quán)利要求I所述的用于制備微陣列細胞芯片的細胞芯片片基，其特征在于，所述的基板和封固蓋采用耐有機溶劑腐蝕的透明材質(zhì)制成。
9.基于權(quán)利要求I所述細胞芯片片基的細胞芯片制備方法，其特征在于，包括以下步驟 1)將基板和封固蓋滅菌后，在陣列孔內(nèi)加入培養(yǎng)基后接種細胞或者接種經(jīng)預富集和細胞密度測定的胸腹水細胞懸液進行細胞培養(yǎng)，使細胞粘附于陣列孔的底部； 2)細胞粘附于陣列孔的底部后，棄上清，加入固定劑進行細胞固定，然后進行細胞學實驗；或者棄上清后直接進行細胞學觀察或研究，操作過程中使用保護蓋防止污染； 3)實驗結(jié)束后，在陣列孔內(nèi)細胞上滴加水溶性或脂溶性封片試劑，然后蓋上封固蓋，使陣列柱伸入相應的陣列孔內(nèi)進行封固； 4)封固后得到微陣列細胞芯片。
10.如權(quán)利要求9所述的細胞芯片制備方法，其特征在于，所述的細胞學實驗包括HE染色、巴氏染色、免疫熒光染色、細胞免疫化學，原位雜交或原位PCR ； 封固后的微陣列細胞芯片還可采用正置顯微鏡或倒置顯微鏡或數(shù)字掃描顯微鏡進行攝取圖像和分析。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于制備微陣列細胞芯片的細胞芯片片基，包括基板和封固蓋，基板上設(shè)有以陣列方式分布的陣列孔，陣列孔的底部透明且位于同一水平面；封固蓋上設(shè)有與基板的陣列孔相匹配的空心的陣列柱，陣列柱可伸入相應的陣列孔內(nèi)，陣列柱的底部透明且位于同一水平面。該細胞芯片片基結(jié)構(gòu)簡單、易于制備、使用方便，在一張片基上即可包含多種(個)以規(guī)則的陣列方式排列的細胞，因此，可一次性同時對多種(個)細胞進行相同或不同指標的檢測或?qū)嶒炑芯俊Ｊ褂帽景l(fā)明的細胞芯片片基操作步驟簡單，可一次完成。
文檔編號C12M1/00GK102719352SQ20121018472
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月6日
發(fā)明者劉妮, 康安靜, 張明娟, 李宗芳, 楊軍, 蘇寶山, 陳曉黎 申請人:西安交通大學