電場作用下用微孔陣列固液相捕獲單分子模板dna的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種電場作用下用微孔陣列固液相捕獲單分子模板的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟：（1）構(gòu)建具有微孔陣列的DNA電化學(xué)傳感器，所述微孔陣列的微孔側(cè)壁上的SiO2絕緣層通過羧基偶聯(lián)固定P1接頭DNA片段；（2）在模板DNA的單鏈末端連接有與P1接頭DNA片段互補配對的P1接頭互補DNA片段，對模板DNA進行PCR擴增；（3）通過電場作用使PCR擴增后的模板DNA進入微孔中與固定在微孔陣列的側(cè)壁上P1接頭DNA片段進行互補配對連接，完成單分子模板DNA的捕獲。該方法省去了注水到油形成微囊反應(yīng)器的步驟，并減少了微珠的應(yīng)用及富集步驟，節(jié)省了實驗所用的試劑及實驗成本，使微孔的有效利用率達到80%左右。
【專利說明】電場作用下用微孔陣列固液相捕獲單分子模板DNA的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因測序【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種電場作用下用微孔陣列固液相捕獲單分子模板DNA的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]高通量測序技術(shù)是最近發(fā)展起來的DNA測序技術(shù)。相對于傳統(tǒng)測序的96道毛細(xì)管測序，高通量測序一次實驗可以讀取幾十萬至幾千萬條序列。讀取長度根據(jù)平臺不同從25bp到500bp。不同的測序平臺在一次實驗中，可以讀取IG到30G不等的堿基數(shù)據(jù)，這樣龐大的測序能力是傳統(tǒng)測序儀所不能比擬的。而實現(xiàn)高通量測序的核心是如何在一個系統(tǒng)內(nèi)高效的捕獲單分子模板，使之形成一個個獨立分隔的微型反應(yīng)器。
[0003]目前的捕獲技術(shù)主要有兩種:液相-微珠或磁珠-乳液PCR( In-solution captureemulsion PCR)技術(shù)和生物芯片雜交(Chip-hybridization capture)技術(shù)，其具體方法包括:
[0004](I)基于芯片的雜交捕獲方法，該方法中基因組DNA首先被打斷，然后與定制的序列捕獲芯片雜交，沒有雜交上的被洗掉。富集的目標(biāo)群體隨后被洗脫并擴增，然后用高通量測序儀測序。這種方法的幾大優(yōu)勢:1、定向捕獲基因組目標(biāo)區(qū)(目前一塊芯片最長可捕獲5MB的指定基因組區(qū)域；2、數(shù)據(jù)可靠；3、只要你選擇出想要捕獲的區(qū)域就會設(shè)計并合成一塊定制的序列捕獲芯片，使用方便省力。但是此方法隨機性很強，不能保證被捕獲的不同DNA片段比例與原始溶液中一致，基因組DNA的需要量比較多，對于稀有的珍貴基因組不適用，其特異性不及in-solution方法。
[0005](2)基于in-solution的雜交捕獲方法的基本流程為基因組DNA打斷，然后精選大小合適的文庫與RNA誘餌共孵育24小時形成RNA-DNA雜合體，再洗脫磁珠后進行PCR擴增，最后進行測序。這種方法的幾大優(yōu)勢:1)極佳的特異性:高達90%的讀出序列來源于RNA"誘餌"捕獲，其中和靶向序列完全重合的超過50% ;2)優(yōu)秀的均一性:對基因組大片段序列，至少和捕獲序列重合一半以上的RNA “誘餌”超過80%，即使對小片段的外顯子序列，這一數(shù)字也超過60% ;3)卓越的重現(xiàn)性:2組技術(shù)重復(fù)試驗間的差異率不到10-5 ；4)可以精確地檢測SNP。綜上所述，實驗結(jié)果完美驗證了基于液相序列捕獲的高通量平行靶向測序技術(shù)的特異性、準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性和廣泛的應(yīng)用前景。但是因為所用的誘餌是RNA，所以需要很高的操作要求，試劑或者器具都需要用無RNA酶的。而且操作步驟比較繁雜。
[0006]目前在新一代測序技術(shù)中，如第二代Roche的焦磷酸測序系統(tǒng)及ABI的SOLiD測序系統(tǒng)和第三代的1n Torrent,所使用的是in_Solution雜交捕獲單分子,然后進行浮液PCR(emulsion PCR)進行克隆擴增。Illumina的Solexa測序系統(tǒng)所使用的是芯片雜交捕獲。
[0007]Roche的焦磷酸測序系統(tǒng)和Life Technologies的1n Torrent測序系統(tǒng)包括:I)先將基因組進行超聲破碎打斷成短的約50-500bp片段，然后將片段的兩端連接通用接頭Pl和P2。2)選擇合適大小的微球共價結(jié)合上百萬個引物Pl在其表面，in-solution用微球捕獲一個模板DNA到一個小球，利用emulsion PCR擴增單一模板，將同一模板在一個微球上擴增成上百萬個模板克隆。3)對攜帶有模板的微球進行富集。4)將攜帶有模板的微球加入到儀器的微孔陣列。這樣微孔的利用率為50%左右，因為攜帶有模板的微球有兩種一種是攜帶單一模板的微球；一種是非單一模板的微球，只有單一模板的微球符合測序要求。
[0008]ABI的SOLiD測序系統(tǒng)包括:1)首先進行基因組DNA的物理破碎，形成短的約50-200bp的DNA片段。2)將短的DNA片段兩端連接通用接頭A和B。3) In-solution用接有接頭互補DNA的微球捕獲，盡量做到一個微球捕獲到一個單一模板DNA片段。4)將連有通用接頭的模板在乳液體系里進行擴增(emulsion PCR),使同一模板在一個微球上擴增成上百萬個模板克隆。5)微珠上的DNA分子模板的3’端進行修飾后，把微球通過3’端共價聯(lián)結(jié)到玻片表面進行測序反應(yīng)。
[0009]Illumi na的Solexa測序系統(tǒng)則是首先將基因組DNA進行片段化處理，回收片段DNA (100-200bp)進行通用接頭連接。再將其處理成為單鏈狀態(tài)，然后通過與芯片表面的單鏈引物堿基互補而被固定于芯片上，另一端隨機的與附近的另一個引物進行互補，形成橋式結(jié)構(gòu)進行橋式擴增(bridge amplification),利用這種方式,進行30個左右循環(huán)的擴增后，每個分子會放大1000倍以上，也變成單克隆DNA簇。在后續(xù)的測序反應(yīng)中四種熒光標(biāo)記的染料邊合成邊測序，每個循環(huán)中，熒光標(biāo)記的dNTP是可逆終止子，只允許摻入單個堿基，主要就是因為3’羥基末端有可被識別的切割位置。在合成的過程中每個堿基的引入都會并行釋放出焦磷酸鹽，而且能夠作為能量提供給生物的發(fā)光蛋白而發(fā)光。
[0010]上述測序方法成功的關(guān)鍵步驟就是捕獲到單一的模板分子后，在水-油形成的浮液中進行PCR(emulsion PCR)達到單分子克隆擴增，使一個模板分子變成近百萬個同等分子的分子簇。形成PCR的一個微小反應(yīng)器目前采取的方法是使模板DNA稀釋到一定濃度后增加一個微球捕獲一個DNA單分子的比例，但這種方法最高只有30%的左右的微珠是含有單一模板克隆的微珠，有70%的微珠或者是沒有模板結(jié)合或者是非單一的模板克隆。這一操作碰到的最大問題是如何保證一個微球或一個芯片上的位點只捕獲到一個單一分子，和在溶液中如何保證每個微球之間都能分隔開形成一個個獨立的微反應(yīng)器。而現(xiàn)有的方法是隨機操作，實驗的成功帶有一定的盲目性和與實驗者的操作技能關(guān)系很大。而且乳液PCR本身的步驟就很繁瑣，需要很高的操作要求。本發(fā)明因此而來。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明目的在于提供一種電場作用下用微孔陣列固液相捕獲單分子模板的方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中單分子模板難以捕獲，并形成PCR的一個微小反應(yīng)器的難題。
[0012]為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的這些問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是:
[0013]一種電場作用下用微孔陣列固液相捕獲單分子模板DNA的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟:
[0014](I)構(gòu)建具有微孔陣列的DNA電化學(xué)傳感器，所述微孔陣列的微孔側(cè)壁上的SiO2絕緣層通過羧基偶聯(lián)固定Pl接頭DNA片段；
[0015](2)在模板DNA的單鏈末端連接有與Pl接頭DNA片段互補配對的Pl接頭互補DNA片段，對模板DNA進行PCR擴增；[0016](3)通過電場作用使PCR擴增后的模板DNA進入微孔中與固定在微孔陣列的側(cè)壁上Pl接頭DNA片段進行互補配對連接，完成單分子模板DNA的捕獲。
[0017]優(yōu)選的，所述方法步驟(I)中Pl接頭DNA片段具有SEQ No: 3的連續(xù)核苷酸序列；P1接頭互補DNA片段具有SEQ No:4飛的連續(xù)核苷酸序列。
[0018]優(yōu)選的，所述方法中模板DNA的單鏈另一末端還連接有用于PCR擴增模板DNA的P2接頭DNA片段；所述P2接頭DNA片段具有SEQ No:7~9的連續(xù)核苷酸序列。
[0019]優(yōu)選的，所述方法中模板DNA的PCR擴增是在加入到DNA電化學(xué)傳感器的微孔陣列流室內(nèi)前進行；或者將模板DNA和PCR反應(yīng)體系一同加入到具有Pl接頭互補DNA片段的模板DNA先加入到DNA電化學(xué)傳感器的微孔陣列流室內(nèi)DNA電化學(xué)傳感器的微孔陣列流室內(nèi)進行PCR擴增。
[0020]優(yōu)選的，所述方法步驟(3)中PCR反應(yīng)體系包括PCR緩沖液、dNTPs、TaqDNA聚合酶、模板DNA和作為PCR擴增引物的P2接頭DNA片段，所述PCR反應(yīng)體系終濃度組成為:
[0021]PCR緩沖液終濃度I~IOX ；
[0022]dNTPs 0.01 ~1.5mM ；
[0023]引物序列終濃度為0.01~2 μ M ;
[0024]模板DNA 0.01 ~IOng/ μ L ；
[0025]TaqDNA 聚合酶 0.01 ~1.0U/ μ L。
[0026]優(yōu)選的，所述方法步驟(2)模板DNA的制備方法包括以下步驟:
[0027]I)將用于制作模板DNA的目的基因組隨機打斷后采用第一引物進行第一次PCR擴增；所述第一引物一端連接有末端標(biāo)記生物素的Pl接頭互補DNA片段，并與目的基因區(qū)域序列互補結(jié)合的寡核苷酸單鏈序列；
[0028]2)使用捕獲組分對進行第一次單向PCR擴增后的目的基因區(qū)域序列進行捕獲；所述捕獲組分包括親和素和與親和素結(jié)合的固相載體，所述親和素與所述第一次單向PCR擴增后的目的基因區(qū)域序列上的生物素相結(jié)合；
[0029]3)使用第二引物對親和素結(jié)合后的目的基因區(qū)域序列進行第二次單向PCR擴增；所述第二引物一端連接有Ρ2接頭DNA片段，并與所述目的基因區(qū)域序列互補結(jié)合，且與第一引物進行PCR擴增的擴增方向相反；
[0030]4)將第二次單向PCR擴增后的目的基因區(qū)域序列除去親和素生物素復(fù)合物，得到帶有Pl接頭互補DNA片段和Ρ2接頭DNA片段的單鏈DNA文庫作為模板DNA或形成雙鏈的模板DNA。
[0031]優(yōu)選的，所述方法中親和素選自卵白親合素、鏈親合素、卵黃親合素及類親合素。
[0032]優(yōu)選的，所述方法中固相載體為磁性微球。
[0033]優(yōu)選的，所述方法步驟(I)中所述DNA電化學(xué)傳感器包括CMOS襯底，所述CMOS襯底上沉積有氮化硅層，所述氮化硅層上覆蓋二氧化硅絕緣層；所述二氧化硅絕緣層為具有微孔結(jié)構(gòu)的微孔陣列，所述微孔側(cè)壁上SiO2`絕緣層通過羧基偶聯(lián)固定Pl接頭DNA片段。
[0034]優(yōu)選的，所述方法SiO2絕緣層的微孔側(cè)壁采用羧基化方法進行羧基化處理，然后使將氨基化的Pl接頭DNA片段與SiO2絕緣層表面的羧基進行鍵合偶聯(lián)固定；羧基化方法采用的試劑為丁二酸，羧基化方法的溫度控制在75V ;偶聯(lián)反應(yīng)以1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)為羧基的活化試劑。[0035]Pl接頭和P2接頭
[0036]模板DNA中的Pl接頭互補DNA片段是和微孔中的Pl接頭DNA片段是互補配對的，習(xí)慣上統(tǒng)稱為Pl接頭，將Pl接頭拆成兩條單鏈后，一條固定在微孔內(nèi)，一條與模板DNA結(jié)合，這樣可以進行互補配對，從而實現(xiàn)了單分子模板DNA的捕獲。作為例子，可以是以下的一種配對方式:
[0037]5’ -NH2-GAGGATCCAGAATTCTCGAGTT-3’ 為微孔中的 Pl 接頭 DNA 片段(經(jīng)氨基化處理后的Pl接頭DNA片段)的連續(xù)核苷酸序列；而模板DNA的一條單鏈的連續(xù)核苷酸序列
為:3’ CTCCTAGGTCTTAAGAGCTCAA............GACTCGCCCGACCGTTCCG-5’(第一單鏈);另一條單
鏈的核苷酸序列為:
[0038]5，GAGGATCCAGAATTCTCGAGTT.............GCCTTGCCAGCCCGCTCAG-3 ’(第二單
鏈)。可以確定的是第一單鏈的Pl接頭互補DNA片段(3’ -CTCCTAGGTCTTAAGAGCTCAA)與微孔中的Pl接頭DNA片段互補。在模板DNA鏈中有一個單鏈?zhǔn)桥c微孔內(nèi)種的接頭DNA片段是互補的，因此要求模板DNA處理過程中需要制備特異的模板DNA的第一單鏈?zhǔn)蛊淠軌蚺c微孔中的接頭Pl接頭DNA片段配對。
[0039]優(yōu)選的，Pl接頭DNA片段為選自以下的連續(xù)核苷酸序列:
[0040]
【權(quán)利要求】
1.一種電場作用下用微孔陣列固液相捕獲單分子模板DNA的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟: (O構(gòu)建具有微孔陣列的DNA電化學(xué)傳感器，所述微孔陣列的微孔側(cè)壁上的SiO2絕緣層通過羧基偶聯(lián)固定Pl接頭DNA片段； (2)在模板DNA的單鏈末端連接有與Pl接頭DNA片段互補配對的Pl接頭互補DNA片段，對模板DNA進行PCR擴增； (3)通過電場作用使PCR擴增后的模板DNA進入微孔中與固定在微孔陣列的側(cè)壁上Pl接頭DNA片段進行互補配對連接，完成單分子模板DNA的捕獲。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法步驟(I)中Pl接頭DNA片段具有SEQ No:1~3的連續(xù)核苷酸序列；P1接頭互補DNA片段具有SEQ No:4飛的連續(xù)核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中模板DNA的單鏈另一末端還連接有用于PCR擴增模板DNA的P2接頭DNA片段；所述P2接頭DNA片段具有SEQ No:7~9的連續(xù)核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述方法中模板DNA的PCR擴增是在加入到DNA電化學(xué)傳感器的微孔陣列流室內(nèi)前進行；或者將模板DNA和PCR反應(yīng)體系一同加入至丨J具有Pl接頭互補DNA片段的模板DNA先加入到DNA電化學(xué)傳感器的微孔陣列流室內(nèi)DNA電化學(xué)傳感器的微孔陣列流室內(nèi)進行PCR擴增。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述方法步驟(3)中PCR反應(yīng)體系包括PCR緩沖液、dNTPs、TaqDNA聚合酶、模板DNA和作為PCR擴增引物的P2接頭DNA片段，所述PCR反應(yīng)體系終濃度組成為: PCR緩沖液終濃度I~IOX ;
dNTPs 0.01 ~1.5mM ; 引物序列終濃度為0.01~2 μ M ; 模板 DNA 0.01 ~IOng/μ L ；
TaqDNA 聚合酶 0.01 ~1.0U/ μ L。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述方法步驟(2)模板DNA的制備方法包括以下步驟: 1)將用于制作模板DNA的目的基因組隨機打斷后采用第一引物進行第一次PCR擴增；所述第一引物一端連接有末端標(biāo)記生物素的Pl接頭互補DNA片段，并與目的基因區(qū)域序列互補結(jié)合的寡核苷酸單鏈序列； 2)使用捕獲組分對進行第一次單向PCR擴增后的目的`基因區(qū)域序列進行捕獲；所述捕獲組分包括親和素和與親和素結(jié)合的固相載體，所述親和素與所述第一次單向PCR擴增后的目的基因區(qū)域序列上的生物素相結(jié)合； 3)使用第二引物對親和素結(jié)合后的目的基因區(qū)域序列進行第二次單向PCR擴增；所述第二引物一端連接有Ρ2接頭DNA片段，并與所述目的基因區(qū)域序列互補結(jié)合，且與第一引物進行PCR擴增的擴增方向相反； 4)將第二次單向PCR擴增后的目的基因區(qū)域序列除去親和素生物素復(fù)合物，得到帶有Pl接頭互補DNA片段和Ρ2接頭DNA片段的單鏈DNA文庫作為模板DNA或形成雙鏈的模板DNA。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述方法中親和素選自卵白親合素、鏈親合素、卵黃親合素及類親合素。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述方法中固相載體為磁性微球。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法步驟(I)中所述DNA電化學(xué)傳感器包括CMOS襯底，所述CMOS襯底上沉積有氮化硅層，所述氮化硅層上覆蓋二氧化硅絕緣層；所述二氧化硅絕緣層為具有微孔結(jié)構(gòu)的微孔陣列，所述微孔側(cè)壁上SiO2絕緣層通過羧基偶聯(lián)固定Pl接頭DNA片段。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述方法SiO2絕緣層的微孔側(cè)壁采用羧基化方法進行羧基化處理，然后使將氨基化的Pl接頭DNA片段與SiO2絕緣層表面的羧基進行鍵合偶聯(lián)固定；羧基化方法采用的試劑為丁二酸，羧基化方法的溫度控制在75°C;偶聯(lián)反應(yīng)以1-乙基-3-(3- 二甲基氨`丙基)-碳化二亞胺(EDC)為羧基的活化試劑。
【文檔編號】C12Q1/68GK103451265SQ201210175408
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年5月31日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月31日
【發(fā)明者】楊楠, 艾洪新, 臧伯瑋, 何越 申請人:凱晶生物科技(蘇州)有限公司