專利名稱：胰高血糖素樣肽-2(glp-2)類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胰高血糖素樣肽-2(GLP_2)類似物及其醫(yī)藥用途，例如在預(yù)防或治療胃和腸相關(guān)病癥以及減輕化學(xué)療法和放射療法的副作用中的用途。
背景技術(shù)：
GLP-2是胰高血糖素原在腸的腸內(nèi)分泌L細(xì)胞以及腦干特定區(qū)域中翻譯后加工所釋放的33個(gè)氨基酸的肽。它與胰高血糖素樣肽-I (GLP-I)、胃泌酸調(diào)節(jié)素和腸高血糖素(glicentin) 一起應(yīng)答于養(yǎng)分?jǐn)z食而共分泌。 GLP-2通過(guò)刺激隱窩中干細(xì)胞增殖和抑制絨毛凋亡來(lái)誘導(dǎo)小腸粘膜上皮的顯著生長(zhǎng)(Drucker 等 Proc Natl Acad Sci U S A. 1996，93 :7911_6)。GLP-2 還抑制胃排空和胃酸分泌(Wo jdemann 等 J Clin Endocrinol Metab. 1999,84 :2513_7)、增強(qiáng)腸屏障功能(Benjamin等.Gut. 2000,47 112-9)、通過(guò)上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白來(lái)刺激腸的己糖轉(zhuǎn)運(yùn)(Cheeseman, . Am J Physiol. 1997, R1965-71)以及提高腸的血流量(Guan等Gastroenterology. 2003,125,136-47)。GLP-2與屬于II類胰高血糖素分泌家族(I)的單G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合。GLP-2受體僅局限于小腸、結(jié)腸和胃中，這些部位是已知應(yīng)答于GLP-2的部位(Yusta等· Gastroenterology. 2000,119 :744_55)。然而，胃腸道中GLP-2受體刺激的靶細(xì)胞仍不清楚，并且對(duì)與GLP-2偶聯(lián)的下游胞內(nèi)中介體的了解甚少。GLP-2在小腸中已被證實(shí)的特異性并有益的效果已經(jīng)引起了人們?cè)谥委熌c疾病或損傷中使用 GLP-2 的極大興趣(Sinclair 和 Drucker, Physiology 2005:357-65)。而且，已顯示GLP-2在多種臨床前腸損傷模型中預(yù)防或降低粘膜上皮損傷，所述模型包括化學(xué)療法誘導(dǎo)的粘膜炎、缺血-再灌注損傷、硫酸葡聚糖誘導(dǎo)的結(jié)腸炎以及炎性腸病的遺傳模型(Sinclair and Drucker Physiology 2005 :357_65)。GLP-2以具有以下序列的33個(gè)氨基酸的肽的形式分泌=H-His-Ala-Asp-Gly-Ser-Phe-Ser-Asp-Glu-Met-Asn-Thr-Ile-Leu-Asp-Asn-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-Asn-Trp-Leu-Ile-Gln-Thr-Lys-Ile-Thr-Asp-OH。其迅速地被酶 DPP IV 在 NH2 端的 2 位丙氨酸(A)處切割，以形成失活的人GLP-2(3-33)。除了腎清除之外，GLP_2(1_33)的這種快速酶降解導(dǎo)致該肽的半衰期為約7分鐘(Tavares等，Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 278 E134-E139，2000)。US 5，994，500 (Drucker等)描述了 GLP-2拮抗劑及其對(duì)胃腸組織生長(zhǎng)的影響。其提出了將所述拮抗劑配制成藥物用于治療增生或誘導(dǎo)發(fā)育不全。美國(guó)5，994，500通過(guò)突變例如替換和缺失來(lái)改變哺乳動(dòng)物GLP-2的結(jié)構(gòu)。US 6，184，208、US 5，789，379 和 US 6，184，201 公開(kāi)了 GLP-2 類似物及其醫(yī)藥用途。所述類似物全是通過(guò)人GLP-2的替換和/或缺失得到的。DaCambra 等(Biochemistry 2000，39，8888-8894)描述了 GLP-2 活性的結(jié)構(gòu)決定簇。這樣的決定簇的實(shí)例是Phe6和Thr5，所述Phe6和Thr5稱為對(duì)GLP-2受體結(jié)合和活化
是至關(guān)重要的。W097/39031公開(kāi)了 GLP-2類似物[Gly2]GLP_2。其中2位的丙氨酸被甘氨酸取代，以使所述肽抵抗DPP IV切割。顯示丙氨酸的取代提高所述肽的穩(wěn)定性和效能(potency)。該專利申請(qǐng)描述了如何使用GLP-2類似物對(duì)抗腸上皮粘膜炎癥和破壞相關(guān)的疾病。它們包括大規(guī)模小腸切除、炎性腸病、化學(xué)療法誘發(fā)的粘膜炎以及缺血性損傷。W002/066511描述了體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)的GLP-2類似 物及其作為治療胃腸病癥如炎性腸疾病的藥物的用途。WO 01/41779描述了 h[Gly2]GLP_2用作抑制化學(xué)療法誘導(dǎo)的凋亡和促進(jìn)細(xì)胞存活的預(yù)處理的用途。本文引用的所有參考文獻(xiàn)明確地以其整體通過(guò)參考并入本文。許多科學(xué)家已經(jīng)提出使用GLP-2或GLP-2類似物治療多種疾病。然而，仍然存在對(duì)改善的、穩(wěn)定的GLP-2類似物的需要。

發(fā)明內(nèi)容
寬泛而言，本發(fā)明涉及GLP-2類似物，其與野生型GLP-2相比包含一種或多種替換，并且可能具有體內(nèi)生物活性改善和/或化學(xué)穩(wěn)定性(例如體外穩(wěn)定性測(cè)定中評(píng)估的穩(wěn)定性)改善的特點(diǎn)。更具體地，本發(fā)明優(yōu)選的GLP-2類似物包含野生型GLP-2序列8位、16位、24位和/或28位中一個(gè)或多個(gè)位置上的替換，其任選地與2位(如引言所述)以及3、5、7、10和11位中一個(gè)或多個(gè)位置的其他替換和/或野生型GLP-2序列31至33位中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失和/或N-端或C-端穩(wěn)定肽序列的添加組合。除了提供可能具有改善的化學(xué)穩(wěn)定性和/或生物活性的GLP-2類似物之外，本發(fā)明還涉及提供這樣的化合物其在小腸中比在結(jié)腸中具有優(yōu)選的腸生長(zhǎng)促進(jìn)活性，反之亦然，尤其是通過(guò)包含野生型GLP-2Asp3和/或Ser8和/或Asnl6和/或Ash24和/或Gln28位中一個(gè)或多個(gè)位置上的修飾而產(chǎn)生的化合物。因此，在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供通式I代表的GLP-2類似物或其可藥用鹽或衍生物Rl-Zl-His-Xs-Xs-Gly-Xs-Xe-XT-Xs-Xg-XlO-Xll-X12-X13-X14-X15-X16-X17_Ala-X19-X20-X21-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z2-R2其中R1為氫、Cy烷基(例如甲基)、乙?；?、甲?；?、苯甲?；蛉阴；鵛2 為 Gly、Ala 或 SarX3 為 Glu 或 AspX5 為 Ser 或 ThrX6 為 Phe 或 ProX7 為 Ser 或 Thr
X8 為 Asp 或 SerX9 為 Glu 或 AspXlO為Met、Leu、Nle或氧化穩(wěn)定的Met取代氨基酸Xll 為 Asn、Ala、Lys 或 SerX12 為 Thr 或 LysX13 為 lie、Glu 或 GlnX14 為 Leu、Met 或 Nle X15 為 Asp 或 GluX16 為 Asn 或 AlaX17 為 Leu 或 GluX18 為 Ala 或 AibX19 為 Ala 或 ThrX20 為 Arg 或 LysX21 為 Asp 或 IleX24 為 AsruAla 或 GluX28 為 GlruAla 或 AsnX31 為 Pro、Ile 或缺失X32為Thr或缺失X33 為 Asp、Asn 或缺失R2 為 NH2 或 OH ；Z1 和 Z2 獨(dú)立地為不存在或選自 Ala、Leu、Ser> Thr> Tyr> Asn、Gin、Asp、Glu、Lys>Arg、His、Met和Orn的3至20個(gè)氨基酸單位的肽序列；并且其中所述GLP-2類似物包含選自以下的一種或多種替換X8為Ser和/或X16為Ala和/或X24為Ala和/或X28為Ala0在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通式II代表的GLP-2類似物或者其可藥用鹽或衍生物Rl-Zl-His-Gly-Xs-Gly-Xs-Phe-XT-Xs-Xg-Xio-Xll-X^-Xis-XH-Xis-Xie-XlT-Ala-X19~Arg-Asp-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z2-R2其中R1為氫、Cp4烷基(例如甲基)、乙?；?、甲?；?、苯甲?；蛉阴；鵛3 為 Glu 或 AspX5 為 Ser 或 ThrX7 為 Ser 或 ThrX8 為 Asp 或 SerX9 為 Glu 或 AspXlO為Met、Leu、Nle或氧化穩(wěn)定的Met取代氨基酸Xll 為 Asn、Ala、Lys 或 SerX12 為 Thr 或 Lys
X13 為 lie、Glu 或 GlnX14 為 Leu、Met 或 NleX15 為 Asp 或 GluX16 為 Asn 或 AlaX17 為 Leu 或 GluX19 為 Ala 或 ThrX24 為 Asn 或 AlaX28 為 GlruAla 或 AsnX31 為 Pro、Ile 或缺失X32為Thr或缺失X33為Asp或缺失R2 為 NH2 或 OH ；Z1 和 Z2 獨(dú)立地為不存在或選自 Ala、Leu、Ser> Thr> Tyr> Asn、Gin、Asp、Glu、Lys>Arg、His、Met和Orn的3至20個(gè)氨基酸單位的肽序列；并且其中所述GLP-2類似物包含選自以下的一種或多種替換X8為Ser和/或X16為Ala和/或X24為Ala和/或X28為Ala0在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通式III代表的GLP-2類似物或者其可藥用鹽或衍生物Rl-Zl-His-Gly-Xs-Gly-Xs-Phe-XT-Xs-Glu-Xio-Xll-Thr-Ile-Leu-Asp-Xie-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z2-R2其中R1為氫、Cm烷基(例如甲基)、乙?；?、甲?；?、苯甲?；蛉阴；鵛3 為 Glu 或 AspX5 為 Ser 或 ThrX7 為 Ser 或 ThrX8 為 Asp 或 SerXlO為Met、Leu、Nle或氧化穩(wěn)定的Met取代氨基酸Xll 為 Asn、Ala、Lys 或 SerX24 為 Asn 或 AlaX28 為 Gln 或 AlaX31為Pro或缺失X32為Thr或缺失X33為Asp或缺失 R2 為 NH2 或 OH ；Z1 和 Z2 獨(dú)立地為不存在或選自 Ala、Leu、Ser> Thr> Tyr> Asn、Gin、Asp、Glu、Lys>Arg、His、Met和Orn的3至20個(gè)氨基酸單位的肽序列；并且其中所述GLP-2類似物包含選自以下的一種或多種替換X8為Ser和/或X16為Ala和/或X24為Ala和/或X28為Ala。X16不是Ala時(shí)，它將是Asn。
在某些實(shí)施方案中，當(dāng)存在Z1時(shí)，R1可以是H，當(dāng)存在Z2時(shí)，R2可以是0H。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，GLP-2類似物與具有本申請(qǐng)引言中所公開(kāi)序列的野生型GLP-2 (1-33)具有至少60 %的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選至少63%的序列同一性，更優(yōu)選至少66%的序列同一性，并且還更優(yōu)選至少69%的序列同一性。就GLP-2多肽序列而言，“氨基酸序列同一性百分比(％ ) ”定義為候選序列中與野生型GLP-2序列中氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比，所述定義在以下步驟后得出比對(duì)序列和必要時(shí)引入缺口以實(shí)現(xiàn)最高序列同一性百分比，并且不將任何保守性替換認(rèn)為是序列同一性的一部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)例如使用公眾可用的軟件如BLAST、BLAST2或Align軟件進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)程序參閱=AItschul等(Methodsin Enzymology, 266 460-480 (1996) ；http://blast. wustl/edu/blast/README. html)或Pearson等(Genomics,46,24,36,1997)和 http://moIbioI. soton. ac. uk/compute/align. html o使用這些程序及其默認(rèn)設(shè)置測(cè)定本文使用的以及根據(jù)本發(fā)明的序列同一性百分t匕。更一般地，技術(shù)人員能夠容易地確定用于測(cè)定比對(duì)的適當(dāng)參數(shù)，包括在所比較序列的全長(zhǎng)上實(shí)現(xiàn)最佳比對(duì)所需的任何算法。在一些優(yōu)選實(shí)施方案中，式I、II或III代表的GLP-2肽類似物包含X8、X16、X24和/或X28位中一個(gè)以上位置上的替換和/或這些替換與其它替換的組合，優(yōu)選與X3、X5、父7310和/或乂11位替換組合。落入式I至III的X8位、X16位、X24和/或X28位替換組合的實(shí)例包括Ser8, Alal6Ser8, Ala24Ser8, Ala28Alal6，Ala24Alal6，Ala28Ala24，Ala28Ser8, Alal6, Ala24Ser8, Alal6, Ala28Ser8, Ala24, Ala28Alal6, Ala24, Ala28Ser8，Alal6，Ala24，Ala28。落入式I至III并且可與X8、X16、X24和/或X28位中一個(gè)或多個(gè)位置上的替換組合的乂335、乂7310和/或父11位替換的實(shí)例包括Glu3, LeulO, Alall, 24Glu3, Thr5, LeulO, Serll, Alal6，24，28Glu3, Thr5, LeulO, Lysll, Alal6，24，28Glu3, Thr5, Ser8, LeulO, Lysll, Alal6, 24, 28Glu3, Thr5, Ser8,11，LeulO, Alal6，24，28Glu3, Thr5, Ser8,11，LeulO, Alal6，24，28Glu3, Ser8,11，LeulO, Alal6，24，28
Glu3, LeulO, Serll, Alal6，24，28Glu3, LeulO, Lysll, Alal6, 24, 28Glu3, Thr5, LeulO, Alall, 16,24,28Glu3, Thr5, LeulO, Alall, 16，24，28，Ile21Glu3, Thr5, Ser8, LeulO, Alall, 16，24，28Glu3, Ser8, LeulO, Alall, 16，24，28Glu3, LeulO, Alall, 16,24,28Thr7, LeulO, Alall, 24Thr7, LeulO, Lysll, Ala24Thr7, LeulO, Serll, Ala24Thr7, LeulO, Ser8,11, Ala24Thr7, Ser8, LeulO, Alall, 24Thr7, Ser8, LeulO, Lysll, Ala24Ser8, LeulO, Alall, 24LeulO, Ala24LeulO, Alall, Ala24LeulO, Alall, 24, 28LeulO, Alall, 16,24,28LeulO, Lysll, Ala24LeulO, Serll, Ala24LeulO, Ser8,11, Ala24或與上述8、16、24和/或28位變化組合的X31-X33位中一個(gè)或多個(gè)位置上的缺失。下文的詳細(xì)描述中公開(kāi)了本發(fā)明GLP-2化合物的具體實(shí)例。除了提供可能改善了化學(xué)穩(wěn)定性和/或生物活性的GLP-2類似物以外，本發(fā)明還涉及提供這樣的化合物其在小腸中具有比在結(jié)腸中優(yōu)選的生長(zhǎng)促進(jìn)活性，反之亦然。具體而言，本文描述的實(shí)驗(yàn)顯示，在對(duì)測(cè)試動(dòng)物施用時(shí)，與結(jié)腸質(zhì)量增加相比較，野生型GLP-2中Asp3和/或Ser8和/或Asnl6和/或Asn24和/或Gln28位的替換提供優(yōu)選的小腸重量增加。這些發(fā)現(xiàn)意味著示例性化合物可用于治療這樣的病癥其中在小腸中具有提高的生長(zhǎng)促進(jìn)效應(yīng)而在結(jié)腸中效應(yīng)較低是有利的，反之亦然。因此，優(yōu)選用于引起小腸生長(zhǎng)的化合物一般包含野生型GLP-2中3、8、16和/或28位中一個(gè)或多個(gè)位置上的替換。這樣的化合物可選擇性地引起小腸而不是結(jié)腸的生長(zhǎng)。因此，它們可用于影響或涉及小腸的病癥。優(yōu)選地，這樣的小腸選擇性化合物包含X3、X7、X16、X24、X28、X31、X32和/或X33位中一個(gè)以上位置上的替換。因此，小腸選擇性化合物可包含一個(gè)以上的下列替換X3為Glu、X7 為 Ser、X16 為 Ala、X24 為 Ala、X28 為 Ala、X31 為 He、X32 為 Thr 和 X33 為 Asp。可任選地缺失X31、X32和X33位的氨基酸殘基。 優(yōu)選刺激小腸中上皮生長(zhǎng)的示例性化合物包括1809、1818、1819、1820、1826、1827、1844、1845、1846、1848、1849、1850、1851、1852、1853、1855、1857、1858、1859。
另一方面，不具有這些改動(dòng)的本發(fā)明化合物，例如包含10、11和/或24位中一個(gè)或多個(gè)位置上的替換的本發(fā)明化合物可能優(yōu)選用于誘導(dǎo)結(jié)腸而不是小腸生長(zhǎng)。因此，它們可用于治療影響或涉及結(jié)腸的病癥。這樣的結(jié)腸選擇性化合物可包含X3、X8和/或X24位中一個(gè)以上位置上的替換。例如，它們可包含一個(gè)以上選自X3為Asp、X8為Asp和X24為Ala的替換?？梢匀芜x地缺失X31、X32和X33位的氨基酸殘基。優(yōu)選地刺激結(jié)腸中上皮生長(zhǎng)的示例性化合物包括1830、1831、1835、1836、1839、 1840、1841和 1843。不引起小腸或結(jié)腸優(yōu)選生長(zhǎng)的示例性化合物[Gly2]GLP_2(即參照分子)、1559、1821、1822、1823、1825、1828、1829、1832、1833、1834、1842、1854。本發(fā)明的化合物還具有提高的化學(xué)穩(wěn)定性，例如針對(duì)酸水解、氧化和脫酰胺作用的穩(wěn)定性。相信X3和/或X33位的替換可提高對(duì)酸水解的穩(wěn)定性。XlO位的替換可提高氧化穩(wěn)定性。X11、X16和/或X24位中一個(gè)或多個(gè)位置的替換可提高針對(duì)脫酰胺作用的穩(wěn)定性，因此，相對(duì)于Gly2-GLP-2，本發(fā)明的GLP-2類似物可顯示出針對(duì)酸性溶液中降解、針對(duì)脫酰胺作用和/或針對(duì)氧化降解的穩(wěn)定性的增強(qiáng)。優(yōu)選地，所述GLP-2類似物維持下文實(shí)施例7所述至少一個(gè)降解測(cè)試中起始純度的至少70%的觀察純度。作為補(bǔ)充或替代，其在12天后可維持O. IM HCl溶液中起始純度的至少60%的觀察純度。作為補(bǔ)充或替代，其在6天后可維持O. IM NH4HCO3溶液中起始純度的至少70 %的觀察純度。在另一方面中，本發(fā)明提供包含與載體混合的本文定義的GLP-2類似物或者其鹽或衍生物的組合物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述組合物為可藥用組合物，所述載體為可藥用載體。GLP-2肽類似物可以是GLP-2類似物的可藥用酸加成鹽。在另一方面中，本發(fā)明提供用于治療的本文定義的GLP-2類似物或其鹽。在另一方面中，本發(fā)明提供GLP-2類似物或者其鹽或衍生物用于制備治療和/或預(yù)防胃和腸相關(guān)病癥的藥物中的用途，比如治療患有腸功能受損、骨質(zhì)疏松和DPP-IV(二肽基肽酶-IV)介導(dǎo)的病癥的新生兒。例如，所述胃和腸相關(guān)病癥包括潰瘍、胃炎、消化病癥、吸收不良綜合征、短腸綜合征(short gut syndrome)、盲管綜合征、炎性腸病、腹型斯?jié)姳R腹瀉(例如由麩質(zhì)誘發(fā)的腸病或乳糜瀉病引起)、熱帶型斯?jié)姳R腹瀉、低丙種球蛋白血癥型斯?jié)姳R腹瀉、腸炎、局限性腸炎(克羅恩病)、潰瘍性結(jié)腸炎、腹瀉相關(guān)的腸易激綜合征、小腸損傷或短腸綜合征(short bowel syndrome)?？捎帽景l(fā)明GLP-2類似物治療或可使用GLP-2類似物進(jìn)行預(yù)防或治療的其它病癥包括放射性腸炎、傳染性腸炎或感染后腸炎以及由于毒劑或其它化學(xué)治療劑引起的小腸損傷。這可能需要在化學(xué)療法或放射療法的療程之前、同時(shí)或之后施用GLP-2類似物，以降低化學(xué)療法的副作用例如腹瀉、腹部痛性痙攣和嘔吐，以及降低其后由化學(xué)療法或放射療法引起的腸上皮結(jié)構(gòu)和功能損傷。因此，本發(fā)明還提供治療藥盒，其包含癌癥放射療法藥物和本發(fā)明的GLP-2類似物，其中每一種均任選地與可藥用載體組合。所述兩種治療劑可以分開(kāi)包裝(例如在分開(kāi)的瓶中)以分別施用，或可以在同一組合物中提供。因此本發(fā)明還提供包含與可藥用載體組合的癌癥化學(xué)療法藥物和本發(fā)明GLP-2類似物的藥物組合物。
對(duì)于患有胃腸粘膜瘤形成或胃腸粘膜瘤形成風(fēng)險(xiǎn)提高的患者，可能期望選擇化合物以降低或消除已降低副作用(例如刺激或加重胃腸粘膜瘤形成)的風(fēng)險(xiǎn)。例如，選擇用于治療患有結(jié)腸瘤形成(良性或惡性)或有發(fā)生結(jié)腸瘤形成風(fēng)險(xiǎn)的患者的化合物時(shí)，選擇對(duì)小腸的選擇性高于結(jié)腸的化合物比非選擇性化合物或?qū)Y(jié)腸的選擇性高于小腸的化合物可能更合適。在其他方面中，本發(fā)明提供GLP-2類似物用于制備治療和/或預(yù)防營(yíng)養(yǎng)不良(例如消耗綜合征惡病質(zhì)和厭食癥之類的病癥)的藥物的用途。在其他方面中，本發(fā)明提供包含編碼本文定義GLP-2類似物的核酸序列的核酸分子。在其他方面中，本發(fā)明提供包含任選地與指導(dǎo)其表達(dá)的序列組合的上述核酸序列的表達(dá)載體，以及用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞能夠表達(dá)并分泌、GLP-2類似物。在另一方面中，本發(fā)明提供生產(chǎn)GLP-2類似物的方法，所述方法包括在適于表達(dá)所述GLP-2類似物的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞和純化這樣制備的GLP-2類似物。本發(fā)明還提供用于治療的本發(fā)明核酸、本發(fā)明表達(dá)載體或者能夠表達(dá)并分泌本發(fā)明GLP-2類似物的宿主細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解，所述核酸、表達(dá)載體和宿主細(xì)胞可用于治療任何可用GLP-2類似物本身進(jìn)行治療的本文所述病癥。因此提到包含本發(fā)明GLP-2類似物的治療組合物或施用本發(fā)明的GLP-2類似物時(shí)，應(yīng)解釋為包括施用本發(fā)明的核酸、表達(dá)載體或宿主細(xì)胞，除非其上下文中另有說(shuō)明。在另一方面中，本發(fā)明提供通過(guò)施用有效量的本文定義的GLP-2類似物或者其鹽或衍生物或者本發(fā)明的核酸、表達(dá)載體或宿主細(xì)胞來(lái)治療有此需要的患者中胃和腸相關(guān)病癥的方法。上文提供了胃和腸相關(guān)病癥的實(shí)例。在另一方面中，本發(fā)明提供治療或預(yù)防有此需要的患者中化學(xué)療法或放射療法副作用的方法，所述方法包括施用有效量的本文定義的GLP-2類似物或者其鹽或衍生物或者本發(fā)明的核酸、表達(dá)載體或宿主細(xì)胞。在另一方面中，本發(fā)明提供治療和/或預(yù)防有此需要的患者中營(yíng)養(yǎng)不良(例如消耗綜合征惡病質(zhì)和厭食癥之類的病癥)的方法，所述方法包括施用有效量的本文定義的GLP-2類似物或者其鹽或衍生物或者本發(fā)明的核酸、表達(dá)載體或宿主細(xì)胞。用于舉例而非限制地，現(xiàn)參照附圖更詳細(xì)地描述本發(fā)明的實(shí)施方案。


圖I :四種小腸選擇性化合物(化合物編號(hào)1846、1855、1848和1858)在C57BL小鼠小腸(SI)質(zhì)量上的完全劑量-應(yīng)答數(shù)據(jù)的實(shí)施例。在三天中每日兩次皮下注射施用以下劑量的化合物0(載體)、5、15、45、135、405nmol/kg(n = 6/劑量組)。將每個(gè)劑量下水平的應(yīng)答與采用非選擇性參照化合物[G1 y2] GLP-2治療的配對(duì)治療小鼠中相同劑量水平下得到的應(yīng)答進(jìn)行比較。為了校正體重(BW)變化，SI質(zhì)量表達(dá)為與BW的相對(duì)值(SI-BWK值)，并且用非選擇性參照化合物[Gly2]GLP-2觀察到的應(yīng)答將每個(gè)劑量水平下的生長(zhǎng)應(yīng)答歸一化。結(jié)果證明，在5至405nmol/kg的劑量范圍內(nèi)，小腸選擇性化合物1846、1855、1848和1858的劑量-應(yīng)答關(guān)系與非選擇性參照化合物[Gly2]GLP-2存在顯著差異(P < O. 05，兩因素AN0VA)，所有四種化合物均以顯著高于[Gly2]GLP-2的最大應(yīng)答刺激小腸生長(zhǎng)。值為平均值土 SEM。* :相對(duì)于等摩爾劑量[Gly2]GLP-2的p < O. 05。圖2:，四種小腸選擇性化合物(化合物編號(hào)1846、1855、1848、1858)在小腸
(SI)-結(jié)腸敏感性指標(biāo)上相對(duì)于非選擇性參照化合物[Gly2]GLP-2的完全劑量-應(yīng)答數(shù)據(jù)的實(shí)施例。在三天中每日兩次對(duì)C57BL小鼠皮下注射施用以下劑量的化合物0(載體)、5、15、45、135、405nmol/kg(n = 6/劑量組)。將每個(gè)劑量下水平的應(yīng)答與采用非選擇性參照化合物[Gly2]GLP-2治療的配對(duì)治療小鼠中相同劑量水平下得到的應(yīng)答進(jìn)行比較。SI-結(jié)腸敏感性指標(biāo)計(jì)算為相對(duì)于結(jié)腸質(zhì)量的SI質(zhì)量，并且用非選擇性參照化合物[Gly2]GLP-2觀察到的應(yīng)答將每個(gè)劑量水平下的敏感性指標(biāo)歸一化。結(jié)果證明，在5至405nmol/kg劑量范圍內(nèi)，小腸選擇性化合物1857和1820的劑量-應(yīng)答關(guān)系與非選擇性參照化合物[Gly2]GLP-2存在顯著差異(P < O. 05，兩因素AN0VA)，相對(duì)于[Gly2]GLP_2，化合物1846、1855和1848均顯示最高小腸敏感性的提高。值為平均值土 SEM。* :相對(duì)于等摩爾劑量[Gly2]GLP-2的 P < O. 05。 圖3 :兩種小腸選擇性化合物(化合物編號(hào)1857、1849和1820)在C57BL小鼠小腸(SI)質(zhì)量上的全部劑量-應(yīng)答數(shù)據(jù)的實(shí)施例。在三天中每日兩次皮下注射施用以下劑量的化合物0(載體)、5、15、45、135、405nmol/kg(n = 6/劑量組)。將每個(gè)劑量下水平的應(yīng)答與采用非選擇性參照化合物[Gly2]GLP-2治療的配對(duì)治療小鼠中相同劑量水平下得到的應(yīng)答進(jìn)行比較。為了校正體重(BW)變化，SI質(zhì)量表達(dá)為與BW的相對(duì)值(SI-BW比值)，并且用非選擇性參照化合物[Gly2]GLP-2觀察到的應(yīng)答將每個(gè)劑量水平下的生長(zhǎng)應(yīng)答歸一化。結(jié)果證明，在5至405nmol/kg的劑量范圍內(nèi)，小腸選擇性化合物1857、1849和1820的劑量-應(yīng)答關(guān)系與非選擇性參照化合物[Gly2]GLP-2存在顯著差異(P < O. 05，兩因素AN0VA)，兩種化合物均以顯著高于[Gly2]GLP-2的最大應(yīng)答刺激小腸生長(zhǎng)。值為平均值土 SEM。* :相對(duì)于等摩爾劑量[Gly2]GLP-2的p < O. 05。圖4 :三種小腸選擇性化合物(化合物編號(hào)1857、1820、1849)在小腸(SI) -結(jié)腸敏感性指標(biāo)上相對(duì)于非選擇性參照化合物[Gly2]GLP-2的完全劑量-應(yīng)答數(shù)據(jù)的實(shí)施例。在三天中每日兩次對(duì)C57BL小鼠皮下注射施用以下劑量的化合物0(載體)、5、15、45、135、405nmol/kg(η = 6/劑量組)。將每個(gè)劑量下水平的應(yīng)答與采用非選擇性參照化合物[Gly2]GLP-2治療的配對(duì)治療小鼠中相同劑量水平下得到的應(yīng)答進(jìn)行比較。SI-結(jié)腸敏感性指標(biāo)計(jì)算為相對(duì)于結(jié)腸質(zhì)量的SI質(zhì)量，并且用非選擇性參照化合物[Gly2]GLP-2觀察到的應(yīng)答將每個(gè)劑量水平下的敏感性指標(biāo)歸一化。結(jié)果證明,在5至405nmol/kg劑量范圍內(nèi)，小腸選擇性化合物1857、1820和1849的劑量-應(yīng)答關(guān)系與非選擇性參照化合物[Gly2]GLP_2存在顯著差異(P <0. 05，兩因素AN0VA)，相對(duì)于[Gly2]GLP-2，全部三種化合物均顯示最高小腸敏感性的提高。值為平均值土SEM。* :相對(duì)于等摩爾劑量[Gly2]GLP-2的p < O. 05。圖5 :非選擇性化合物([Gly2]GLP_2)和小腸選擇性化合物(化合物1848)在小腸、結(jié)腸和胃質(zhì)量上的完全劑量-應(yīng)答數(shù)據(jù)的實(shí)施例。在三天中每日兩次對(duì)C57BL小鼠皮下注射施用以下劑量的化合物0(載體)、5、15、45、135、405nmol/kg(n = 6/劑量組)。結(jié)果證明，在5至405nmol/kg劑量范圍內(nèi)，[Gly2]GLP_2在小腸、結(jié)腸和胃中產(chǎn)生劑量依賴性生長(zhǎng)刺激，而化合物1848僅在小腸中產(chǎn)生劑量依賴性生長(zhǎng)刺激。值為平均值土SEM。相對(duì)于載體的P < O. 05。圖6 :顯示化合物 1846(5、15、45、135、405 和 810nmol/kg，皮下，每日兩次，η = 6/劑量組)對(duì)采用細(xì)胞抑制藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)處理的小鼠中A)小腸-體重比(SI-BW)和B)小腸長(zhǎng)度(SI長(zhǎng)度)的影響的實(shí)施例?；衔?846在施用每日一次腹膜內(nèi)注射的50mg/kg5-FU之前施用3天，然后與5-FU —起施用4天。作為參照，對(duì)一組動(dòng)物給予[Gly2]GLP-2 (405nmol/kg)。還顯示了僅使用載體(PBS)或5-FU處理的對(duì)照動(dòng)物的結(jié)果?；衔?846阻止了 C57BL小鼠中5-FU誘導(dǎo)的小腸萎縮(器官質(zhì)量減少和縮短)。值為平均值土 SEM。* :相對(duì)于 5-FU 的 P < O. 05。圖7 :顯示化合物 1848(5、15、45、135、405 和 810nmol/kg，皮下，每日兩次，η = 6/劑量組)對(duì)采用細(xì)胞抑制藥 物5-氟尿嘧啶(5-FU)處理的小鼠中Α)小腸-體重比(SI-BW)和B)小腸長(zhǎng)度(SI長(zhǎng)度)的影響的實(shí)施例?；衔?848在施用每日一次腹膜內(nèi)注射的50mg/kg5-FU之前施用3天，然后與5-FU —起施用4天。作為參照，對(duì)一組動(dòng)物給予[Gly2]GLP-2 (405nmol/kg)。還顯示了僅使用載體(PBS)或5-FU處理的對(duì)照動(dòng)物的結(jié)果。化合物1848阻止了 C57BL小鼠中5-FU誘導(dǎo)的小腸萎縮(器官質(zhì)量減少和縮短)，并且高劑量的化合物1848比[Gly2]GLP-2更有效。值為平均值+SEM0 * :相對(duì)于[Gly2]GLP_2的p< O. 05。圖8 :顯示化合物1855(5、15、45、135和405nmol/kg，皮下，每日兩次，η = 6/劑量組)對(duì)采用細(xì)胞抑制藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)處理的小鼠中Α)小腸-體重比(SI-BW)和B)小腸長(zhǎng)度(SI長(zhǎng)度)的影響的實(shí)施例?；衔?855在施用每日一次腹膜內(nèi)注射的50mg/kg5-FU之前施用3天，然后與5-FU —起施用4天。作為參照，對(duì)一組動(dòng)物給予[Gly2]GLP-2 (405nmol/kg)。還顯示了僅使用載體(PBS)或5-FU處理的對(duì)照動(dòng)物的結(jié)果。化合物1855阻止了 C57BL小鼠中5-FU誘導(dǎo)的小腸萎縮(器官質(zhì)量減少和縮短)，并且最高劑量的化合物1855比等摩爾劑量的[Gly2]GLP-2更有效。值為平均值土SEM。* :相對(duì)于[Gly2]GLP-2 的 p < O. 05。圖9 :顯示化合物1857(5、15、45、135和405nmol/kg，皮下，每日兩次，η = 6/劑量組)對(duì)采用細(xì)胞抑制藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)處理的小鼠中Α)小腸-體重比(SI-BW)和B)小腸長(zhǎng)度(SI長(zhǎng)度)的影響的實(shí)施例。化合物1857在施用每日一次腹膜內(nèi)注射的50mg/kg5-FU之前施用3天，然后與5-FU —起施用4天。作為參照，對(duì)一組動(dòng)物給予[Gly2]GLP-2 (405nmol/kg)。還顯示了僅使用載體(PBS)或5-FU處理的對(duì)照動(dòng)物的結(jié)果?；衔?857阻止了 C57BL小鼠中5-FU誘導(dǎo)的小腸萎縮(器官質(zhì)量減少和縮短)，并且最高劑量的化合物1857比等摩爾劑量的[Gly2]GLP-2更有效。值為平均值土SEM。* :相對(duì)于[Gly2]GLP-2 的 p < O. 05。圖10 :顯示化合物1846 (16、80和400nmol/kg/天,皮下，η = 6/劑量組)在用細(xì)胞抑制藥物5-氟尿嘧啶(5-FU)處理的雄性Spague-Dawley大鼠中的作用的實(shí)施例。化合物1846在施用每日一次腹膜內(nèi)注射的75mg/kg 5-FU之前施用3天，然后與5-FU —起施用4天。將結(jié)果與僅使用載體(鹽水)或5-FU處理對(duì)照動(dòng)物中的應(yīng)答進(jìn)行比較。還顯示了鹽水和5-FU對(duì)照。化合物1846阻止了大鼠中5-FU誘導(dǎo)的小腸萎縮(小腸質(zhì)量減少和腸縮短)。值為平均值土 SEM。* :相對(duì)于僅有5-FU的P < O. 05，。圖11 :該實(shí)施例展示化合物1846對(duì)由細(xì)胞抑制藥物5_氟尿嘧啶(5_FU)處理誘發(fā)的腹灣的影響。每日一次用5-FU 75mg/kg處理大鼠4天(第I至4天)；(n = 40只大鼠)。在5-FU處理之前最后3天(第-3至-I天)和5-FU處理的4天(第O至3天)中，半數(shù)動(dòng)物接受化合物1846(400nmol/kg，皮下，每日一次)的其他處理。每日兩次(早晨和傍晚)觀察大鼠以確定動(dòng)物是否發(fā)生腹瀉，并且根據(jù)以下尺度對(duì)腹瀉的嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分(O)無(wú)腹瀉；⑴輕度-肛門周圍糞便污染；(2)中度-后肢和尾巴糞便污染；和(3)重度-前肢和腹部糞便污染。第5天，約70%僅接受5-FU的Sprague Dawley大鼠發(fā)生腹瀉(圖11A)，而僅30%與化合物1846共處理的大鼠發(fā)生腹瀉(圖11B)。這些結(jié)果表明化合物1846有效地防止小腸損傷，從而在用5-FU進(jìn)行細(xì)胞抑制處理期間防止了腹瀉的發(fā)生。圖12 :該實(shí)施例展示化合物1846對(duì)上皮隱窩-絨毛高度(圖12A)和空腸(即小腸中段)肌厚度(圖12B)的影響。用化合物1846(0·62、3·41或6.2mg/kg，每日一次)靜脈內(nèi)處理Sprague Dawley大鼠5天(η = 6/劑量組)。然后處死動(dòng)物,在幽門括約肌遠(yuǎn)端25cm處收集小腸活檢(1cm)。固定所述活檢、石蠟包埋、切片并用蘇木精和伊紅染色。在顯微鏡下檢查染色的切片，測(cè)量隱窩深度、絨毛高度、隱窩-絨毛長(zhǎng)度和肌厚度。根據(jù)圖示，化合物1846劑量依賴性地提高空腸腸上皮中的隱窩-絨毛長(zhǎng)度，但是對(duì) 空腸肌厚度沒(méi)有影響。這些結(jié)果提示化合物1846通過(guò)刺激小腸上皮生長(zhǎng)而主要在小腸中發(fā)揮其增殖作用。值為平均值土 SEM。* :相對(duì)于載體對(duì)照(Omg/kg/天)的P < O. 05。圖13 :該實(shí)施例展示化合物1848對(duì)吲哚美辛誘導(dǎo)的小腸潰瘍的影響。使用載體(鹽水；第I組)或吲哚美辛(7mg/kg皮下，每日一次，進(jìn)行2天；第2至7組)處理雄性Sprague Dawley大鼠。僅給予Π引哚美辛(第2組)或與潑尼松龍組合(10mg/kg皮下,第3組)或與8、40或200nmol/kg化合物1848組合(皮下，每日一次，第4至6組)。最后，采用潑尼松龍(10mg/kg皮下)和化合物1848 (200nmol/kg皮下,每日一次)的組合處理來(lái)處理一組大鼠(第7組)。吲哚美辛之前4天開(kāi)始進(jìn)行化合物1848處理并且在吲哚美辛處理的2天期間繼續(xù)處理。第3天，處死大鼠，在尸檢時(shí)輕輕地用10%福爾馬林沖洗小腸并用福爾馬林填充小腸5分鐘，之后沿系膜小腸對(duì)向部邊緣將腸剪開(kāi)并懸掛在聚丙烯盤(pán)上。小心地用鑷子除去任何剩余的腸內(nèi)容物。室溫下再固定24小時(shí)后，在Milli-Q水中清洗組織，并用制備為 1% 乙酸(Bie&Bernstsen)中 O. 5%溶液的 Alcian Green3BX(Chroma)表面染色20分鐘。除去過(guò)量的染色液和Milli-Q水后，將所述組織制備物轉(zhuǎn)移到70%醇中并使用立體顯微鏡在低倍(X7)下進(jìn)行分析。從幽門開(kāi)始仔細(xì)檢查小腸并利用標(biāo)準(zhǔn)尺(精度O. 5mm)測(cè)量所有潰瘍的性狀(圓形和線形)和大小(圓形潰瘍直徑，線形潰瘍長(zhǎng)X寬)。潰瘍定義為缺少上皮表面的部分。在正在愈合的潰瘍中，即使較大面積中仍然缺少絨毛結(jié)構(gòu)，也僅將仍然缺少上皮表面的部分認(rèn)為是潰瘍。以盲法進(jìn)行所有分析。如圖13所示，吲哚美辛強(qiáng)烈誘導(dǎo)小腸潰瘍(總小腸潰瘍=333±21mm2)。潑尼松龍?zhí)幚硪饾兎秶@著下降約29%?；衔?848處理以劑量依賴性方式防止吲哚美辛誘導(dǎo)的潰瘍，在最高劑量下，總潰瘍降低約50% (178±17mm2)。這種對(duì)化合物1846的最大應(yīng)答高于潑尼松龍的作用，與高劑量化合物1848組合加入潑尼松龍未產(chǎn)生任何附加效應(yīng)。這些結(jié)果表明，化合物1848有效防止吲哚美辛誘導(dǎo)的小腸潰瘍。值為平均值土SEM。*:與吲哚美辛(第2組)的P < O. 05。# :與潑尼松龍(第3組)的P < O. 05。圖14:該實(shí)施例展示化合物1848對(duì)由吲哚美辛誘導(dǎo)小腸炎癥的大鼠中小腸TNF-α含量的影響。使用載體(鹽水；第I組)或吲哚美辛(7mg/kg皮下，每日一次，進(jìn)行2天；第2至7組)處理雄性Sprague Dawley大鼠。僅給予卩引哚美辛(第2組)或與潑尼松龍組合(10mg/kg皮下,第3組)或與8、40或200nmol/kg化合物1848組合(皮下，每日一次，第4至6組)。最后，采用潑尼松龍(10mg/kg皮下)和化合物1848 (200nmol/kg皮下，每日一次)的組合處理來(lái)處理一組大鼠(第7組)。吲哚美辛之前4天開(kāi)始進(jìn)行化合物1848處理并且在吲哚美辛處理的2天期間繼續(xù)處理。第3天處死大鼠，在尸檢時(shí)將小腸分成長(zhǎng)度相等的三個(gè)節(jié)段，分別對(duì)應(yīng)于I)十二指腸和近端空腸、2)中部空腸和遠(yuǎn)端空腸以及3)回腸。立即在液氮中快速冷凍樣品并保存在-80°C至分析。根據(jù)下述方案進(jìn)行小腸節(jié)段的勻漿和細(xì)胞蛋白的提取對(duì)組織節(jié)段稱重，加入每克組織I. 5ml體積用冰預(yù)冷(40C )的提取緩沖液(IOmM Tris-HCI(Sigma)和 ImM EDTA(J. T. Baker), (pH 7.6)，含O. 05 % 疊氮化鈉(Fluka)、1% Tween-80 (Fluka)、2mM 苯甲基磺酰氟(PMSF，F(xiàn)luka)以及蛋白酶抑制劑抑肽酶、亮抑蛋白酶肽和胃蛋白酶抑制劑A各I μ g/ml (Roche Diagnostics))。用剪刀將組織剪成小塊并以9500rpm 20秒勻衆(zhòng)3次(IKA UltraTurrax T25homogenizer,Janke&Kunkel)，其間在冰上冷卻30秒。在4°C下以20. OOOXg離心組織勻漿30分鐘，收集上清液并保存在_20°C至分析TNF-α。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)使用市售的ELISA試劑盒(Rat Tumor Necrosis Factor-a Ultrasensitive ELISA kit, Biosource InternationalInc.)分析小腸蛋白提取物的TNF-α。該測(cè)定的檢出限為O. 7pg/ml。使用市售的測(cè)定(DCprotein assay, Bio-Rad Laboratories Ltd.)分析蛋白提取物中的總蛋白含量。TNF-α 的小腸組織水平表達(dá)為與總蛋白的相對(duì)值?；衔?848顯著降低促炎細(xì)胞因子TNF-α的小腸組織水平，并且這種效應(yīng)在近端節(jié)段(小腸的前1/3)最為顯著。在近端和中部節(jié)段(小腸第二個(gè)1/3)中，化合物1848比潑尼松龍更有效。有意思的是，化合物1848比潑尼松龍更有效地抑制小腸炎癥，并且當(dāng)與化合物1848組合施用時(shí)，潑尼松龍沒(méi)有附加效應(yīng)。這些結(jié)果提示化合物1848對(duì)影響小腸的疾病過(guò)程具有顯著的抗炎潛能。值為平均值土SEM。* :與吲哚美辛(第2組)的P < O. 05。本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明定義除非另外指出，為上述書(shū)面描述中使用的特定術(shù)語(yǔ)提供下述定義。在說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)全篇中，使用天然氨基酸的常規(guī)單字母代碼和三字母代碼以及其它α -氨基酸例如肌氨酸(Sar)、正亮氨酸(Nle)和α -氨基異丁酸(Aib)的普遍公認(rèn)的三字母代碼。本發(fā)明的肽中所有氨基酸殘基優(yōu)選為L(zhǎng)-構(gòu)型，然而，也可以存在D-構(gòu)型
的氨基酸。本發(fā)明的優(yōu)選化合物具有至少一種GLP-2生物活性，尤其是引起腸生長(zhǎng)。這可以如實(shí)施例中所述在體內(nèi)測(cè)定中進(jìn)行評(píng)估，其中在用GLP-2類似物處理或接觸測(cè)試動(dòng)物之后測(cè)定腸或其部分的質(zhì)量。與天然GLP-2和上述定義的GLP-2相比較，本發(fā)明的GLP-2類似物具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換、缺失、倒位或添加。這一定義還包括同義術(shù)語(yǔ)GLP-2模擬物和/或GLP-2激動(dòng)劑。此外，本發(fā)明的類似物還可具有一個(gè)或多個(gè)其氨基酸側(cè)基、α -碳原子、末端氨基、或末端羧酸基的化學(xué)修飾?；瘜W(xué)修飾包括但不限于添加化學(xué)部分、形成新鍵以及去除化學(xué)部分。氨基酸側(cè)基修飾包括但不限于賴氨酸ε -氨基的?；?、精氨酸、組氨酸或賴氨酸的N-烷基化、谷氨酸或天冬氨酸羧酸基的烷基化以及谷氨酸或天冬氨酸的脫酰胺作用。末端氨基修飾包括但不限于去氨基(deS-amino)、N-低級(jí)烷基、N-二低級(jí)烷基以及N-?；揎?。末端羧基修飾包括但不限于酰胺、低級(jí)烷基酰胺、二烷基酰胺以及低級(jí)烷基酯修飾。本文優(yōu)選的低級(jí)烷基為C1-C4烷基。此外，可通過(guò)肽化學(xué)普通技術(shù)人員公知的保護(hù)基保護(hù)一個(gè)或多個(gè)側(cè)基或端基。氨基酸的α-碳可被單甲基化或二甲基化。在其存在時(shí)，氧化穩(wěn)定的Met-取代氨基酸指選自以下的氨基酸Met(0)(甲硫氨酸亞砜)、Met (O) 2 (甲硫氨酸砜)、Val、lie、Asn、Glx (Glu 或 Gin)、Tyr> Phe> Trp,優(yōu)選為L(zhǎng)eu、Nle、Ala、Ser 和 Gly。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的肽還可以以鹽或其它衍生物的形式提供。鹽包括可藥用鹽例如酸加成鹽和堿鹽。酸加成鹽的實(shí)例包括鹽酸鹽、檸檬酸鹽和乙酸鹽。堿鹽的實(shí)例包括陽(yáng)離子選自以下的鹽堿金屬例如鈉和鉀、堿土 金屬例如鈣以及銨離子+N (R3)3(R4)(其中R3和R4獨(dú)立地表示任意取代的Cu烷基、任意取代的C2_6烯基、任意取代的芳基或任意取代的雜芳基)?？伤幱名}的其它實(shí)例描述于“Remington' s Pharmaceutical Sciences”第17版Ed. Alfonso R. Gennaro (Ed.),Mark Publishing Company, Easton, PA, U. S. A. , 1985 和更新的版本以及 the Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology 中。本發(fā)明GLP-2類似物的其它衍生物包括與金屬離子如Mn2+和Zn2+的配位絡(luò)合物、酯如體內(nèi)可水解的酯、游離酸或堿、水合物、前藥或脂質(zhì)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域熟知的技術(shù)在化合物中存在的羥基或羧酸基之間以及適當(dāng)?shù)聂人峄虼挤磻?yīng)配偶體之間形成酯。作為前藥的化合物衍生物可在體內(nèi)或體外轉(zhuǎn)化成母體化合物之一。一般地，化合物的至少一種生物活性將在化合物前藥形式中降低，并且可通過(guò)前藥轉(zhuǎn)化被活化，以釋放該化合物或其代謝物。前藥的實(shí)例包括使用保護(hù)基，所述保護(hù)基可原位除去以釋放活性化合物，或者可在體內(nèi)抑制藥物的清除。在其存在時(shí)，Z1和Z2各自獨(dú)立地代表3至20個(gè)或4至20個(gè)氨基酸殘基的肽序列，例如在4至15個(gè)氨基酸殘基范圍內(nèi)、更優(yōu)選在4至10個(gè)氨基酸殘基范圍內(nèi)，尤其是在4至7個(gè)氨基酸殘基范圍內(nèi)，例如4、5、6或7個(gè)氨基酸殘基，比如6個(gè)氨基酸殘基。肽序列Z 中每個(gè)氨基酸殘基可獨(dú)立地選自 Ala、Leu、Ser> Thr> Tyr> Asn、Gin、Asp、Glu、Lys> Arg、His、Met、Orn。優(yōu)選地,所述氨基酸殘基選自 Ser、Thr> Tyr> Asn、Gin、Asp、Glu、Lys> Arg、His、Orn和Met以及落入W001/04156中所定義的式I的氨基酸,例如Dbu (2，4-二氨基丁酸)或Dpr (2，3-二氨基丙酸)，更優(yōu)選選自GhuLys和Met，尤其是Lys。上述氨基酸可為D-或L-構(gòu)型，但優(yōu)選上述氨基酸為L(zhǎng)-構(gòu)型。特別優(yōu)選的序列Z是4個(gè)、5個(gè)或6個(gè)連續(xù)賴氨酸殘基、特別是6個(gè)連續(xù)賴氨酸殘基的序列。示例性序列Z示于W001/04156。在某些實(shí)施方案中不存在Z1。在這種情況下，可以存在或不存在Z2。本發(fā)明包含下文實(shí)驗(yàn)章節(jié)中進(jìn)一步描述的下述肽。參照GLP-2類似物1559H-[Gly2]hGLP-2-0 HH-HGDGSFSDEMNTILDNLAARDFINWLIQTKITD-OH本發(fā)明GLP-2類似物的實(shí)例1809 [Gly2, Glu3, Thr5, LeulO, Alall, 16，24，28]hGLP_2_(Lys)6-NH2HGEGTFSDELATILDALAARDFIAffLIATKITDK6-NH21810[Gly2,Glu3,Thr5,LeulO,Alall,16,24,28,Ile21]hGLP_2(1—30)-(Lys) 2_NH2HGEGTFSDELATILDALAARIFIAffLIATK6-NH21811 [Gly2, Pro6, LeulO, Alall, 16，24，28]hGLP_2_NH2[οι 99]hgdgspsdelatildalaardfiawliatkitd-nh21812 [Gly2，Glu3, LeulO, Alall, 24]hGLP_2_NH2HGEGSFSDELATILDNLAARDFIAffLIQTKITD-NH21813 [Gly2，LeulO, Alall, 16，24，28]hGLP_2_NH2H-HGDGSFSDELATILDALAARDFIAffLIATKITD-NH21814[Gly2，LeulO, Alall，24，28]hGLP_2_NH2H-HGDGSFSDELATILDNLAARDFIAffLIATKITD-NH2
1815[Gly2，Glu3，LeulO，Alall，16，24，28]hGLP-2-N H2H-HGEGSFSDELATILDALAARDFIAffLIATKITD-NH21818 [Gly2，Ser8, LeulO, Alal1, 24]hGLP-2 (1-30) -K6-NH2H-HGDGSFSSELATILDNLAARDFIAffLIQTK6-NH21819 [Gly2，LeulO, Serll, Ala24]hGLP_2 (1—30)-K6-NH2
H-HGDGSFSDELSTILDNLAARDFIAffLIQTK6-NH21820 [Gly2, Thr7, Ser8, LeulO, Alal1, 24]hGLP-2 (1-30) -K6-NH2H-HGDGSFTSELATILDNLAARDFIAffLIQTK6-NH21821 [Gly2, LeulO, Lysll, Ala24]hGLP_2 (1—30)-K6-NH2H-HGDGSFSDELKTILDNLAARDFIAffLIQTK6-NH21822 [Gly2, Thr7, LeulO, LyslI，Ala24]hGLP_2 (1—30)-K6-NH2H-HGDGSFTDELKTILDNLAARDFIAffLIQTK6-NH21823 [Gly2, Thr7, Ser8, LeulO, LyslI，Ala24]hGLP_2 (1-30)-K6-NH2H-HGDGSFTSELKTILDNLAARDFIAffLIQTK6-NH21824 [Gly2，Thr7, LeulO, Alal1, 24]hGLP-2 (1-30) -K6-NH2
H-HGDGSFTDELATILDNL-AARDFIAffLIQTK6-NH21825 [Gly2, Ser8, LeulO, Alal1, 24]hGLP-2 (1-30) -NH2H-HGDGSFSSELATILDNLAARDFIAWLIQTK-NH21826 [Gly2, LeulO, Ala24]hGLP-2_K6-NH2H-HGDGSFSDELNTILDNLAARDFIAWLIQTKITDK6-NH21827 [Gly2, Thr7, LeulO, Ser 11, Ala24] hGLP-2 (1-30) -K6-NH2H-HGDGSFTDELSTILDNLAARDFIAffLIQTK6-NH21828 [Gly2, Thr7, LeulO, Ser8,11，Ala24]hGLP-2 (1-30) -K6-NH2H-HGDGSFTSELSTILDNLAARDFIAffLIQTK6-NH21829 [Gly2, LeulO, Ser8,11，Ala24]hGLP_2 (1-30) _K6_NH2
H-HGDGSFSSELSTILDNLAARDFIAffLIQTK6-NH21830 [Gly2, LeulO, Serll, Ala24]hGLP_2 (1—30)-NH2H-HGDGSFSDELSTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH21831 [Gly2, Thr7, LeulO, Ser 11, Ala24] hGLP-2 (1-30) -NH2H-HGDGSFTDELSTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH21832 [Gly2, Thr7, LeulO, Ser8，11，Ala24]hGLP_2 (1-30)-NH2H-HGDGSFTSELSTILDNLAARDFIAffLIQTK-NH2
1833 [Gly2, LeulO, Ser8,11，Ala24]hGLP_2 (1-30) _NH2H-HGDGSFSSELSTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH21834 [Gly2，Thr7, Ser8, LeulO，Alai 1，24] hGLP-2 (1-30) _NH2
H-HGDGSFTSELATILDNLAARDFIAWLIQTK-NH21835 [Gly2, LeulO, Lysll, Ala24]hGLP_2 (1—30) _NH2H-HGDGSFSDELKTILDNLAARDFIAWLIQTK_NH21836 [Gly2, Thr7, LeulO, Lysll, Ala24]hGLP_2 (1-30) _NH2H-HGDGSFTDELKTILDNLAARDFIAWLIQTK_NH21839 [LeulO, Alall, Ala24]hGLP-2 (1-33)-K6-NH2H-HGDGSFSDELATILDNLAARDFIAWLIQTKITDK6_NH21840 [LeulO, Alall, Ala24]hGLP-2 (1-33)-NH2H-HGDGSFSDELATILDNLAARDFIAWLIQTKITD_NH21841 [LeulO, Alall, Ala24]hGLP-2 (1-30)-NH2
H-HGDGSFSDELATILDNLAARDFIAWLIQTK-NH21842 [Thr7, Ser8, LeulO, Lysll, Ala24]hGLP_2 (1-30) _NH2H-HGDGSFTSELKTILDNLAARDFIAWLIQTK_NH21843 [Thr7, LeulO, Alall, Ala24]hGLP_2 (1-30) _NH2H-HGDGSFTDELATILDNLAARDFIAWLIQTK_NH21844 [Gly2, Glu3, Thr5, Ser8,11，LeulO, Alal6, 24, 28]hGLP-2 (1-33) - (Lys) 6-NH2h-hgegtfsselstildalaardfiawliatkitdk6-nh21845 [Gly2, Glu3, Thr5, LeulO, Serll, Alal6, 24, 28]hGLP-2 (1-33) - (Lys) 6-NH2h-hgegtfsdelstildalaardfiawliatkitdk6-nh21846 [Gly2, Glu3, Ser8,11，LeulO, Alal6, 24, 28] hGLP-2 (1-33) - (Lys) 6-NH2
H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFIAWLIATKITDK6NH21847 [Gly2, Glu3, LeulO, Serll, Alal6，24，28]hGLP_2 (1-33) - (Lys) 6_NH2h-hgegsfsdelstildalaardfiawliatkitdk6-nh21848 [Gly2, Glu3, Thr5, Ser8, LeulO, Alall, 16, 24, 28]hGLP-2 (1-33) - (Lys) 6-NH2h-hgegtfsselatildalaardfiawliatkitdk6-nh21849 [Gly2, Glu3, Ser8, LeulO, Alall, 16，24，28]hGLP_2 (1-33) - (Lys) 6_NH2h-hgegsfsselatildalaardfiawliatkitdk6-nh21850 [Gly2, Glu3, LeulO, Lysll, Alal6，24，28]hGLP_2 (1—33) - (Lys) 6_NH2h-hgegsfsdelktildalaardfiawliatkitdk6-nh21851 [Gly2, Glu3, Thr5, LeulO, Lysll, Alal6, 24, 28]hGLP-2 (1-33) - (Lys) 6-NH2h-hgegtfsdelktildalaardfiawliatkitdk6-nh21852 [Gly2, Glu3, Thr5, Ser8, LeulO, Lysll, Alal6, 24, 28]hGLP-2 (1-33) -NH2h-hgegtfsselktildalaardfiawliatkitdk6-nh21853 [Gly2, Glu3, Thr5, Ser8,11，LeulO, Alal6, 24, 28]hGLP-2 (1-33) -NH2h-hgegtfsselstildalaardfiawliatkitd-nh21854[Gly2，Glu3, Thr5, LaulO, Serll, Alal6, 24, 28]hGLP-2 (1-33) -NH2
h-hgegtfsdelstildalaardfiawliatkitd-nh21855 [Gly2, Glu3, Thr5, Ser8, LeulO, Alall, 16, 24, 28]hGLP-2 (1-33) -NH2h-hgegsfsselstildalaardfiawliatkitd-nh21856 [Gly2, Glu3, Ser8,11，LeulO, Alal6, 24, 28]hGLP-2 (1-33) -NH2 h-hgegsfsdelstildalaardfiawliatkitd-nh21857 [Gly2, Glu3, LeulO, Serll, Alal6, 24, 28]hGLP-2 (1-33) -NH2H-HGEGTFSSELATILDALAARDFIAffLIATKITD-NH21858 [Gly2, Glu3, Ser8, LeulO, Alall, 16, 24, 28]hGLP-2 (1-33) -NH2h-hgegsfsselatildalaardfiawliatkitd-nh21859 [Gly2, Glu3, LeulO, Lysll, Alal6, 24, 28]hGLP-2 (1-33) -NH2H-HGEGSFSDELKTILDALAARDFIAffLIATKITD-NH21860 [Gly2, Glu3, Thr5, LeulO, Lysll, Alal6, 24, 28]hGLP-2 (1-33) -NH2H-HGEGTFSDELKTILDALAARDFIAffLIATKITD-NH21861 [Gly2, Glu3, Thr5, Ser8, LeulO, Lysll, Alal6, 24, 28]hGLP-2 (1-33) -NH2
HGEGTFSSELKTILDALAARDFIAffLIATKITD本發(fā)明特別優(yōu)選的化合物包括化合物1834、1846、1847、1848、1849、1855、1857和1858。
1834H-HGDGSFTSELATILDNLAARDFlAWLlQTK-NHa
1846H-HGEGsFssELsTILDALAARDFIAWLIATKtTDK6NH2
1847H-Hgegsfsdelstildalaardfiawliatkitdk6-NH2
1848H-Hgegtfsselatildalmrdfiawliatkitdk6-NH2
1849H-Hgegsfsselatildalaardfiawliatkitdk6-NH2
1855H-HGEGSFSSELSTILDALAARDFlAWDATKiTD-NH2
1857H-Hgegtfsselatildalaardfiawliatkitd-NH2
1858H-Hgegsfsselatildalaardfiawliatkitd-NH2穩(wěn)定件研究技術(shù)人員能設(shè)計(jì)適當(dāng)方法(例如定量法)用于檢測(cè)GLP-2類似物的降解產(chǎn)物，例如基于下面描述的方法。降解可以以氧化、水解和脫酰胺作用的形式發(fā)生，取決于任何給定的GLP-2類似物中氨基酸的特性和位置以及條件例如pH、溶液和溫度。當(dāng)在應(yīng)激條件(即可能引起降解的條件)下孵育化合物并且隨后分析化合物中剩余完整肽的含量時(shí)，可根據(jù)化學(xué)穩(wěn)定性對(duì)化合物進(jìn)行分級(jí)。此外，得到的對(duì)應(yīng)激條件下所得主要降解產(chǎn)物的了解對(duì)于任何后來(lái)分析方法的開(kāi)發(fā)都是很重要的。檢測(cè)GLP類似物的定暈測(cè)定技術(shù)人員還能夠設(shè)計(jì)方法(例如定量法)用于檢測(cè)復(fù)雜環(huán)境或溶液(例如血漿、尿、組織勻漿、細(xì)胞勻漿、唾液等)中的GLP-2類似物，以研究施用于哺乳動(dòng)物之后GLP-2類似物的吸收、分布、代謝和排泄，或者作為體外細(xì)胞體系功能研究的一部分。
在一個(gè)實(shí)施方案中，定量測(cè)定可基于針對(duì)GLP類似物或其片段的抗體。從經(jīng)免疫的動(dòng)物中得到的抗體可用于定量分析。在一個(gè)實(shí)施例中，可利用固定在多孔板中的與所述分子中一部分具有親和力的第一抗體制備直接夾層ELISA。然后對(duì)孔應(yīng)用樣品，GLP類似物被第一抗體捕獲。然后所捕獲的GLP類似物被與GLP類似物另一部分具有親和力的第二抗體識(shí)別?？捎妹?辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶或半乳糖苷酶)或放射性同位素標(biāo)記所述第二抗體。然后可通過(guò)加入比色底物或直接計(jì)數(shù)輻射或通過(guò)閃爍來(lái)檢測(cè)所捕獲的GLP類似物的量?；蛘撸ㄟ^(guò)加入與第二抗體具有親和力的標(biāo)記抗體來(lái)間接檢測(cè)所捕獲的GLP類似物的量。可由含有已知量GLP類似物的外標(biāo)曲線得到的應(yīng)答來(lái)估計(jì)樣品中的濃度?；蛘?，所述抗體可用于制備直接競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定，其中將對(duì)GLP類似物具有特異性的抗體固定在多孔板上，并將樣品與預(yù)定固定濃度的標(biāo)記GLP類似物一起在孔中孵育。所述標(biāo)記可以是酶、熒光團(tuán)、放射性同位素或生物素，并使用以下方法檢測(cè)，例如對(duì)所述酶具有特異性的底物(例如比色、熒光或化學(xué)發(fā)光)、閃爍或者與酶連接的抗生物素蛋白，隨后進(jìn)行上述檢測(cè)?？赏ㄟ^(guò)適當(dāng)?shù)姆椒z測(cè)已結(jié)合的標(biāo)記GLP類似物的量，并可由得自上述外標(biāo)曲線的應(yīng)答來(lái)得出樣品中GLP類似物的濃度。在另一個(gè)實(shí)施方案中，定量測(cè)定可基于液相層析-串聯(lián)質(zhì)譜法。在這樣的設(shè)置中，根據(jù)與惰性氣體(He或Ar)碰撞引起的母體化合物斷裂來(lái)監(jiān)測(cè)對(duì)待研究GLP類似物具有特異性的片段的應(yīng)答。斷裂之前通過(guò)反相層析分離樣品組分，或直接將樣品注入質(zhì)譜儀中。適當(dāng)時(shí)可對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理(即加入蛋白酶抑制劑、蛋白質(zhì)沉淀、固相萃取、免疫-親和萃取等)。由上述外標(biāo)曲線所得應(yīng)答得出樣品中存在的GLP類似物濃度，這可以是在使用與待研究的GLP類似物相似的內(nèi)標(biāo)校正應(yīng)答之后。產(chǎn)生特異性抗體可在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)并從血清中純化針對(duì)GLP類似物或其片段的特異性抗體。GLP類似物或片段可直接與佐劑一起用于免疫兔、小鼠或其它哺乳動(dòng)物，或者GLP類似物或其片段可與載體分子(即匙孔槭血藍(lán)蛋白、卵白蛋白、白蛋白等)化學(xué)連接，并與佐劑一起注射?？稍谘娱L(zhǎng)的時(shí)間中以2至4周的間隔重復(fù)所述注射，以提高抗體的親和力和選擇性?？芍苯訌难瀚@得多克隆抗體。為了得到單克隆抗體，應(yīng)將分離自免疫動(dòng)物(優(yōu)選小鼠)的B細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞融合，以形成產(chǎn)生抗體的雜交瘤。利用固定的GLP類似物或其肽隨后用標(biāo)記的抗-抗體檢測(cè)來(lái)篩選和選擇適當(dāng)?shù)目寺『涂贵w。或者，所述篩選和選擇可基于固定抗體隨后用標(biāo)記的GLP類似物或其片段檢測(cè)。在所有情況下，所述標(biāo)記均可以是放射性同位素、酶、熒光團(tuán)或生物素，并使用以下方法檢測(cè)，例如對(duì)所述酶具有特異性的底物(例如比色、熒光或化學(xué)發(fā)光)、閃爍或者抗生物素蛋白與酶連接，隨后進(jìn)行上述檢測(cè)。合成GLP類似物優(yōu)選通過(guò)固相或液相肽合成手段合成本發(fā)明的類似物。在該上下文中，參照W098/11125 和 Fields,GB 等，2002,“Principles and practice of solid-phase peptidesynthesis” . In :Synthetic Peptides (2nd Edition)以及本文的實(shí)施例。因此，可用多種方式合成GLP類似物，例如包括以下步驟的方法(a)通過(guò)固相或液相肽合成手段合成肽并回收這樣得到的合成肽；或 (b)當(dāng)所述肽由天然存在的氨基酸組成時(shí)，在宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼所述肽的核酸構(gòu)建體，并從所述宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中回收表達(dá)產(chǎn)物；或(C)當(dāng)所述肽由天然存在的氨基酸組成時(shí)，實(shí)現(xiàn)編碼所述肽的核酸構(gòu)建體的無(wú)細(xì)胞體外表達(dá)，并回收所述表達(dá)產(chǎn)物；或(a)、(b)和(C)方法的組合以得到所述肽的片段，隨后連接所述片段以得到所述肽，并回收所述肽。因此，對(duì)于本發(fā)明的一些類似物，使用基因工程技術(shù)可能是有利的。這可能是當(dāng)肽足夠大(或作為融合構(gòu)建體產(chǎn)生)和當(dāng)肽僅包含可由活生物RNA翻譯的天然存在氨基酸的情況。就重組基因技術(shù)而言，編碼本發(fā)明肽的核酸片段是重要的化學(xué)產(chǎn)物。因此，本發(fā)明的另一方面提供包含編碼本發(fā)明GLP-2類似物的核酸序列的核酸分子，其中所述肽優(yōu)選包含于天然存在氨基酸中。本發(fā)明的核酸片段為DNA或RNA片段。本發(fā)明的核酸片段通常插入適當(dāng)?shù)妮d體中，以形成攜帶本發(fā)明核酸片段的克隆載體或表達(dá)載體；這種新載體也是本發(fā)明的一部分。涉及構(gòu)建本發(fā)明這些載體的細(xì)節(jié)將在下文轉(zhuǎn)化細(xì)胞和微生物的上下文中討論。取決于應(yīng)用的目的和類型，所述載體可以是質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、微染色體或病毒的形式，但僅在某些細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)的裸DNA也是重要的載體。本發(fā)明優(yōu)選的克隆載體和表達(dá)載體(質(zhì)粒載體)能自主復(fù)制，從而能夠?yàn)榱擞糜陔S后克隆的高水平表達(dá)或高水平復(fù)制而實(shí)現(xiàn)高拷貝數(shù)。 本發(fā)明載體的一般概況包括在5’ 一 3’方向有效連接的下述特征用于驅(qū)動(dòng)本發(fā)明核酸片段表達(dá)的啟動(dòng)子，任選的編碼允許分泌(分泌至胞外相或適當(dāng)時(shí)分泌至周質(zhì)體中)的前導(dǎo)肽或多種目的(如組合分泌、純化標(biāo)記和酶修飾以校正肽或?qū)⒍嚯钠握系侥ぶ?的前導(dǎo)肽的核酸序列、編碼本發(fā)明肽的核酸片段以及任選的編碼終止子的核酸序列。當(dāng)用表達(dá)載體在生產(chǎn)株或細(xì)胞系中操作時(shí)，為了轉(zhuǎn)化細(xì)胞的基因穩(wěn)定，優(yōu)選所述載體在引入宿主細(xì)胞時(shí)整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中。使用本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以產(chǎn)生經(jīng)修飾的本發(fā)明肽。這樣的轉(zhuǎn)化細(xì)胞也是本發(fā)明的一部分，可以是用于增殖本發(fā)明核酸片段和載體或用于重組產(chǎn)生本發(fā)明肽的培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)胞系。本發(fā)明優(yōu)選的轉(zhuǎn)化細(xì)胞是微生物例如細(xì)菌(如埃希菌(Escherichia)(如大腸桿菌)、芽孢桿菌(Bacillus)(如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、沙門氏菌(Salmonella)或分枝桿菌(Mycobacterium)(優(yōu)選非致病性的，如牛分枝桿菌(M. bovis)BCG)的物種)、酵母(如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))和原生動(dòng)物?；蛘撸鲛D(zhuǎn)化細(xì)胞來(lái)自多細(xì)胞生物，即可以是真菌細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。來(lái)自人的細(xì)胞也是有意義的，參照下文對(duì)細(xì)胞系和載體的討論。為了克隆和/或最優(yōu)化表達(dá)的目的，優(yōu)選所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞能復(fù)制本發(fā)明核酸片段。本發(fā)明的實(shí)施方案優(yōu)選使用表達(dá)所述核酸片段的細(xì)胞；它們可用于小規(guī)?；虼笠?guī)模制備本發(fā)明的肽。通過(guò)轉(zhuǎn)化細(xì)胞生產(chǎn)本發(fā)明的肽時(shí)，雖然遠(yuǎn)非必要，但將表達(dá)產(chǎn)物運(yùn)出至培養(yǎng)基或攜帶到轉(zhuǎn)化細(xì)胞表面是便利的。已經(jīng)鑒定了有效的生產(chǎn)細(xì)胞時(shí)，優(yōu)選基于所述生產(chǎn)細(xì)胞建立攜帶本發(fā)明載體和表達(dá)編碼所述肽的核酸片段的穩(wěn)定細(xì)胞系。優(yōu)選地，這種穩(wěn)定細(xì)胞系分泌或攜帶本發(fā)明的肽，從而便于純化。一般而言，將含有復(fù)制子和控制序列的質(zhì)粒載體(來(lái)源于與宿主細(xì)胞相容的物種)與宿主一起使用。所述載體通常帶有復(fù)制位點(diǎn)以及能在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中提供表型選擇的標(biāo)記序列。例如，一般使用來(lái)源于大腸桿菌物種的質(zhì)粒PBR322(但是存在許多其它可用的質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化大腸桿菌(參閱如Bolivar等，1977)。pBR322質(zhì)粒含有氨芐青霉素和四環(huán)素抗性基因，因而提供鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的簡(jiǎn)單手段。PBR質(zhì)?；蚱渌⑸镔|(zhì)粒或噬菌體必須還包含啟動(dòng)子或經(jīng)修飾以包含啟動(dòng)子，其可被原核微生物用于表達(dá)。在原核重組DNA構(gòu)建中最普遍使用的啟動(dòng)子包括內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)(Chang等，1978 ;ltakura等，1977 ;Goeddel等，1979)以及色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)(Goeddel等，1979 ;EP 0036776A)。盡管這些是最常用的，但也已發(fā)現(xiàn)并使用了 其它微生物啟動(dòng)子，其核苷酸序列的細(xì)節(jié)已公開(kāi)，使得技術(shù)人員能將其與質(zhì)粒載體功能性連接(Siebwenlist等，1980)。除了原核生物、真核微生物以外,還可使用例如酵母培養(yǎng)物，而且這時(shí)所述啟動(dòng)子也應(yīng)能夠啟動(dòng)表達(dá)。在真核微生物中，釀酒酵母或普通面包酵母是最常用的，盡管許多其它株也是普遍可得的。例如，對(duì)于酵母屬中的表達(dá)，質(zhì)粒YRP7是常用的(Stinchcomb 等，1979 ；Kingsman 等，1979 ；Tschemper 等，1980)。該質(zhì)粒已含有為不能生長(zhǎng)在色氨酸中的酵母突變株(如ATCC No. 44076或PEP4-1 (Jones，1977))提供選擇標(biāo)記的trpl基因。然后，作為酵母宿主細(xì)胞基因組特征的trpl損傷的存在提供了用于通過(guò)在無(wú)色氨酸情況下培養(yǎng)檢測(cè)轉(zhuǎn)化的有效環(huán)境。酵母載體中適當(dāng)?shù)膯?dòng)序列包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzman等，1980)或其它糖酵解酶(Hess等，1968 ；Holland等，1978)的啟動(dòng)子,例如烯醇化酶、甘油醒_3_磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶以及葡糖激酶的啟動(dòng)子。在構(gòu)建適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)質(zhì)粒時(shí)，還將與這些基因相關(guān)的終止序列還被連接到表達(dá)載體中待表達(dá)序列的3’，以提供mRNA多聚腺苷酸化和終止。具有轉(zhuǎn)錄由生長(zhǎng)條件控制的額外優(yōu)點(diǎn)的其它啟動(dòng)子為乙醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關(guān)的降解酶和上述甘油醛-3-磷酸脫氫酶以及負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶。含有酵母兼容性啟動(dòng)子、復(fù)制起點(diǎn)和終止序列的任何質(zhì)粒載體都是適用的。除了微生物以外，來(lái)源于多細(xì)胞生物的細(xì)胞培養(yǎng)物也可用作宿主。原則上任何這樣的細(xì)胞培養(yǎng)物都是可使用的，不管來(lái)自脊椎動(dòng)物或無(wú)脊椎動(dòng)物培養(yǎng)物。然而，脊椎動(dòng)物細(xì)胞是最有意義的，近年來(lái)，脊椎動(dòng)物在培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中的繁殖已經(jīng)成為常規(guī)方案(Tissue Culture，1973)。這種可用的宿主細(xì)胞系的實(shí)例為VERO和HeLa細(xì)胞、中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系以及 W138、BHK、C0S-7293、草地貪夜蛾(spodoptera frugiperda, SF)細(xì)胞(完整的表達(dá)系統(tǒng)可購(gòu)自 i. a. Protein Sciences, IOOOResearch Parkway, Meriden,CT06450, U.S.A.和 Invitrogen)、 Invitrogen(PO Box 2312,9704CHGroningen, TheNetherlands)提供的黑腹果蜆(D. melanogaster)細(xì)胞系S2以及MDCK細(xì)胞系。這些細(xì)胞的表達(dá)載體通常包括(如果需要)復(fù)制起點(diǎn)、位于待表達(dá)基因之前的啟動(dòng)子以及任何必需的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、RNA剪接位點(diǎn)、多腺苷酸化位點(diǎn)以及轉(zhuǎn)錄終止子序列。對(duì)于哺乳動(dòng)物中的應(yīng)用，表達(dá)載體的控制功能通常由病毒物質(zhì)提供。例如，常用的啟動(dòng)子來(lái)源于多瘤病毒、腺病毒2，最常用的是猿猴病毒40 (SV40)。SV40病毒的早期和晚期啟動(dòng)子是特別有用的，因?yàn)樗鼈兌既菀滓酝瑫r(shí)包括SV40病毒復(fù)制起點(diǎn)的片段的形式從病毒中得到(Fiers等，1978)。還可以使用更小或更大的SV40片段，只要其包括從Hind III位點(diǎn)至病毒復(fù)制起點(diǎn)中Bg II位點(diǎn)的約250bp序列。此外，還可能(并且通常希望)利用正常情況下與目的基因序列相關(guān)的啟動(dòng)子或控制序列，只要這樣的控制序列與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容。復(fù)制起點(diǎn)可通過(guò)構(gòu)建載體提供以包含外源起點(diǎn)來(lái)提供，例如可來(lái)自SV40或其它病毒(例如多瘤病毒、腺病毒、VSV、BPV)，或者可以由宿主細(xì)胞染色體復(fù)制機(jī)制提供。如果所述載體整合進(jìn)宿主細(xì)胞染色體中，后者通常是足夠的。為了在重組生產(chǎn)方法中得到滿意的產(chǎn)量，通過(guò)將肽與可用作親和標(biāo)記(為了易于純化)的融合配偶體和/或通過(guò)具有多個(gè)肽重復(fù)來(lái)將所述類似物制備為融合蛋白可能是有利的。這些方法需要存在適當(dāng)?shù)碾拿盖懈钗稽c(diǎn)，但是技術(shù)人員會(huì)知道如何加工其背后的基因構(gòu)建體。重組制備后，可通過(guò)本領(lǐng)域普遍公知的方法純化本發(fā)明的肽，包括多步層析(離子交換、大小排阻以及親和層析技術(shù))?；蛘?，可在無(wú)細(xì)胞體系中體外制備由天然存在的氨基酸組成的肽。這在肽可能對(duì)推定的宿主細(xì)胞有毒性的情況下特別有利。因此，本發(fā)明還考慮使用無(wú)細(xì)胞體外翻譯/表 達(dá)以制備本發(fā)明的肽。在這種情況下，參照來(lái)自例如Ambion Inc. , 2130ffoodward, Austin,TX78744-1832，USA的市售體外翻譯試劑盒、材料和技術(shù)文件。最后，當(dāng)然可以組合可用方法，從而制備如半合成類似物。在這樣的設(shè)置中，使用至少2個(gè)分開(kāi)的步驟或方法制備肽片段，隨后連接所述片段以得到最終的肽產(chǎn)物。藥物纟目合物和施用本發(fā)明的GLP-2類似物或者其鹽或衍生物可配制成用于保存或施用的藥物組合物，并且其在可藥用載體中包含治療有效量的本發(fā)明GLP-2肽或者其鹽或衍生物。本發(fā)明化合物的治療有效量取決于給藥途徑、受治哺乳動(dòng)物的類型以及所考慮的具體哺乳動(dòng)物的身體特征。這些因素及其與確定該量之間的關(guān)系是醫(yī)藥領(lǐng)域中技術(shù)人員熟知的?？烧{(diào)整該量和施用方法以達(dá)到最佳效力，從而將肽遞送到大腸，但是將取決于醫(yī)藥領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的因素例如體重、飲食、同時(shí)用藥(concurrent medication)和其它因素。本發(fā)明中提供藥物組合物，其中所述GLP-2類似物或其鹽以有效治療或預(yù)防胃和腸相關(guān)病癥的量存在。利用有機(jī)和無(wú)機(jī)堿可形成具有酸性部分的本發(fā)明化合物的可藥用鹽。與堿形成的適當(dāng)鹽包括金屬鹽比如堿金屬或堿土金屬鹽，例如鈉、鉀或鎂鹽；銨鹽和有機(jī)胺鹽，比如與嗎啉、硫代嗎啉、哌啶、吡咯烷、單_、二-或三羥基低級(jí)烷基胺(例如單_、二-或三乙醇胺)形成的鹽。還可以形成內(nèi)鹽。相似地，當(dāng)本發(fā)明的化合物包含堿性部分時(shí)，可利用有機(jī)和無(wú)機(jī)酸形成鹽。例如，可由下述酸形成鹽醋酸、丙酸、乳酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、延胡索酸、馬來(lái)酸、丙二酸、苦杏仁酸、蘋(píng)果酸、鄰苯二甲酸、鹽酸、氫溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、甲基磺酸、萘磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸和樟腦磺酸以及其它公知的可藥用酸。還可利用氨基酸例如賴氨酸、甘氨酸或苯丙氨酸形成氨基酸加成鹽。對(duì)醫(yī)藥領(lǐng)域中技術(shù)人員顯而易見(jiàn)地，本發(fā)明的肽或藥物組合物的“治療有效量”將根據(jù)年齡、體重和受治哺乳動(dòng)物的物種、使用的具體化合物、具體的給藥方式以及所需效果和治療適應(yīng)證進(jìn)行變化。由于這些因素與確定該量的關(guān)系是醫(yī)藥領(lǐng)域熟知的，因此確定治療有效的劑量水平、實(shí)現(xiàn)預(yù)防和/或治療本文描述的腸和胃相關(guān)疾病的理想結(jié)果所需的量以及本文公開(kāi)的其它醫(yī)學(xué)適應(yīng)證將在技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。本文使用的“治療有效量”是降低給定病癥或病理的癥狀、優(yōu)選使患有所述病癥或病理的個(gè)體的生理反應(yīng)正?；牧??？梢允褂帽绢I(lǐng)域的常規(guī)方法確定癥狀的降低或生理反應(yīng)的正?；?，并且可根據(jù)給定的病癥或病理而改變。在一個(gè)方面中，一種或多種GLP-2類似物或含有一種或多種GLP-2類似物的藥物組合物的治療有效量是這樣的量其將可檢測(cè)的生理參數(shù)恢復(fù)到與未患所述病癥或病狀的個(gè)體中所述參數(shù)基本相同的值(優(yōu)選在所述值的+30 %以內(nèi)，更優(yōu)選在+20 %以內(nèi)，并且還更優(yōu)選在+10 %以內(nèi))。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，開(kāi)始以較低的劑量水平施用本發(fā)明的化合物或藥物組合物，提高劑量水平直至實(shí)現(xiàn)預(yù)防/治療相關(guān)醫(yī)療適應(yīng)證例如腸和胃相關(guān)疾病的理想效果。這將定義為治療有效量。對(duì)于單獨(dú)的或作為藥物組合物一部分的本發(fā)明的肽，這樣的劑量可以在約O. 01mg/kg體重至100mg/kg體重之間，比如在約O. 01mg/kg體重至10mg/kg 體重之間，例如在10至100 μ g/kg體重之間。對(duì)于治療用途，將選定的GLP-2類似物與可藥用并且適于通過(guò)選定的給藥途徑遞送肽的載體配制在一起。就本發(fā)明目的而言，外周腸胃外途徑包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下以及腹膜內(nèi)給藥途徑。用于本發(fā)明的某些化合物還可能適于通過(guò)口服、直腸、鼻腔或下呼吸道途徑給藥。這些是所謂的非胃腸外(non-parenteral)途徑。本發(fā)明的藥物組合物包含本發(fā)明的GLP-2類似物或者其鹽或衍生物以及可藥用載體。適當(dāng)?shù)目伤幱幂d體是常規(guī)地與基于肽的藥物一起使用的載體，比如稀釋劑、賦形劑等。用于治療用途的可藥用載體是藥學(xué)領(lǐng)域熟知的，并且描述于例如 Remington' s Pharmaceutical Sciences, Mack PublishingCo. (A. R. Gennaro edit. 1985)。例如,可以使用弱酸性或生理pH的無(wú)菌鹽水和磷酸緩沖鹽水。PH緩沖劑可以是磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)、N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、碳酸氫銨、二乙醇胺、組氨酸(是優(yōu)選的緩沖劑)、精氨酸、賴氨酸、或乙酸鹽或其混合物。優(yōu)選的緩沖范圍是PH4至8、pH 6. 5至8，更優(yōu)選pH 7至7. 5。所述藥物組合物中可包含防腐劑，例如對(duì)甲酚、間甲酚和鄰甲酚、對(duì)羥苯甲酸甲酯和對(duì)羥苯甲酸丙酯、酚、苯甲醇、苯甲酸鈉、苯甲酸、苯甲酸芐酯、山梨酸、丙酸、對(duì)羥基苯甲酸酯。所述藥物組合物中可包含防止氧化、脫酰胺、異構(gòu)化、消旋化、環(huán)化、肽水解的穩(wěn)定劑，例如抗壞血酸、甲硫氨酸、色氨酸、EDTA、天冬酰胺、賴氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和甘氨酸。所述藥物組合物中可包含防止聚集、纖維化和沉淀的穩(wěn)定劑，比如十二烷基硫酸鈉、聚乙二醇、羧甲基纖維素、環(huán)糊精。所述藥物組合物中可包含增溶或防止聚集的有機(jī)改性劑，比如乙醇、乙酸或乙酸酯及其鹽。所述藥物組合物中可包含等滲劑比如鹽例如氯化鈉或最優(yōu)選的碳水化合物例如葡萄糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、蔗糖或其混合物。所述藥物組合物中可包含去污劑比如Tween 20、Tween 80、SDS、泊洛沙姆例如Pluronic F_68、Pluronic F-127。所述藥物組合物中可包含染料甚至是芳香劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含GLP-2肽類似物的可藥用酸加成鹽?？梢允褂弥鷳覄?。所述藥物組合物中可包含有機(jī)調(diào)節(jié)劑比如乙醇、叔丁醇、2-丙醇、乙醇、甘油、聚乙二醇，用于冷凍凍干的產(chǎn)物。所述藥物組合物中可包含填充劑和等滲劑比如鹽例如氯化鈉或最優(yōu)選的碳水化合物例如葡萄糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、蔗糖或其混合物、氨基酸例如甘氨酸、谷氨酸或賦形劑半胱氨酸、卵磷脂或人血清白蛋白或其混合物用于冷凍。本發(fā)明的藥物組合物可以配制成以下形式并使用用于口腔給藥的片劑、膠囊劑或酏劑；用于直腸給藥的栓劑；用于注射給藥的優(yōu)選的無(wú)菌溶液或無(wú)菌粉劑或懸液等等。可調(diào)整給藥劑量和方法以實(shí)現(xiàn)最佳效力，但是將取決于這樣的因素比如體重、飲食、并行的藥物處理和其它因素，這是醫(yī)藥領(lǐng)域中技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到的。當(dāng)進(jìn)行胃腸外給藥時(shí)，比如靜脈內(nèi)和皮下，例如以每日為基礎(chǔ)，注射用藥物組合物可制備成水溶液或懸液的常規(guī)形式；適用在臨用前重建或在注射前懸于液體中的凍干固體形式，或作為乳劑。用于重建凍干產(chǎn)品的稀釋劑可以是上述列表中的適當(dāng)緩沖劑、水、鹽水、葡萄糖、甘露醇、乳糖、海藻糖、蔗糖、卵磷脂、白蛋白、谷氨酸鈉、鹽酸半胱氨酸；或添加洗滌劑比如Tween 20、Tween 80、SDS、泊洛沙姆例如 Pluronic F-68 或 Pluronic F-127、聚乙二醇和或添加防腐劑比如對(duì)甲酚、間甲酚和鄰甲酚、對(duì)羥苯甲酸甲酯和對(duì)羥苯甲酸丙酯、酚、苯甲醇、苯甲酸鈉、苯甲酸、苯甲酸芐酯、山梨酸、丙酸、對(duì)羥基苯甲酸酯和或添加有機(jī)改性劑比如乙醇、乙酸、檸檬酸、乳酸或其鹽的注射用水。此外，如果需要，所述注射用藥物組合物可包含少量非毒性輔助物質(zhì)，比如濕潤(rùn)劑或PH緩沖劑?？墒褂迷鰪?qiáng)吸收的制劑(例如脂質(zhì)體、洗滌劑和有機(jī)酸)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，將化合物配制成用于輸注給藥，例如在用作全胃腸外營(yíng)養(yǎng)治療的患者(例如新生兒，或患有惡病質(zhì)或厭食癥的患者)的液體營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑時(shí)，或用于注射給藥，例如皮下、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)，并且相應(yīng)地以無(wú)菌和無(wú)熱原形式的水溶液使用，并優(yōu)選地緩沖至生理上可接受的PH，例如弱酸性或生理pH。用于肌內(nèi)給藥的制劑可基于植物油溶液或懸液，例如蕓苔油、玉米油或大豆油。這些基于油的制劑可利用抗氧化劑進(jìn)行穩(wěn)定，例如BHA( 丁化羥基苯甲醚)和BHT ( 丁化羥基甲苯)。因此，本發(fā)明的肽化合物可在載體如蒸餾水或鹽水、磷酸緩沖鹽水、5 %葡萄糖溶液或油中施用。如果需要，可通過(guò)摻入增溶劑例如洗滌劑和乳化劑提高GLP-2類似物的溶解度。為了用作注射劑，可向水性載體或載體中補(bǔ)充明膠，所述明膠的量是在注射部位處或附近駐留GLP-2類似物使得GLP-2類似物向理想的作用部位緩慢釋放的量。替代的凝膠劑比如透明質(zhì)酸也可用作駐留劑(depot agents)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑包含a.溶解在水中的L-組氨酸，終濃度為O. 5mM至300mM，優(yōu)選3至200mM，最優(yōu)選20至 IOOmM ；b.甘露醇，最高為350mM，優(yōu)選30至300mM，最優(yōu)選IOOmM至230mM ;和c.乙酸,溶液中最高為200mM,優(yōu)選O. 05至IOOmM,最優(yōu)選O. 5至50mM。添加適當(dāng)量的治療化合物以達(dá)到濃度為I至100mg/mL,優(yōu)選5至50mg/mL,最優(yōu)選10至30mg/mL。將pH調(diào)整為終pH為4至8，優(yōu)選6. 5至7. 5，最優(yōu)選6. 7至7. 3。將所得的溶液調(diào)整成目標(biāo)重量，無(wú)菌過(guò)濾并以適當(dāng)?shù)牡确衷嚇臃盅b到瓶中用于藥用。按照液體產(chǎn)物或凍干產(chǎn)物進(jìn)一步處理所述制劑。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑包含a.溶解在水中的L-組氨酸，終濃度為O. 5mM至300mM，優(yōu)選3至200mM，最優(yōu)選20至 IOOmM ；b. L-精氨酸，最高為200mM,優(yōu)選O. 5至IOOmM,最優(yōu)選5至50mM ；c.甘露醇，最高為350mM，優(yōu)選30至300mM，最優(yōu)選100至230mM ;和d.醋酸，溶液中最高為200mM，優(yōu)選O. 05至IOOmM,最優(yōu)選0. 5至50mM。
添加適當(dāng)量的治療化合物以達(dá)到濃度為I至100mg/mL,優(yōu)選5至50mg/mL,最優(yōu)選10至30mg/mL。將pH調(diào)整為終pH為4至8，優(yōu)選6. 5至7. 5，最優(yōu)選6. 7至7. 3。將所得的溶液調(diào)整成目標(biāo)重量，無(wú)菌過(guò)濾并以適當(dāng)?shù)牡确衷嚇臃盅b到瓶中用于藥用。按照液體產(chǎn)物或凍干產(chǎn)物進(jìn)一步處理所述制劑。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑包含a.溶解在水中的L-組氨酸，終濃度最高為200mM，優(yōu)選3至lOOmM，最優(yōu)選5至50mM L-組氨酸； b. L-精氨酸，最高為200mM,優(yōu)選O. 5至IOOmM,最優(yōu)選5至50mM ；c.甘露醇，最高為350mM，優(yōu)選30至300mM，最優(yōu)選100至230mM ;和d.醋酸，溶液中最高為200mM，優(yōu)選O. 05至IOOmM,最優(yōu)選0. 5至50mM。添加適當(dāng)量的治療化合物以達(dá)到濃度為I至100mg/mL,優(yōu)選5至50mg/mL,最優(yōu)選10至30mg/mL。將pH調(diào)整為終pH為4至8，優(yōu)選6. 5至7. 5，最優(yōu)選6. 7至7. 3。將所得的溶液調(diào)整成目標(biāo)重量，無(wú)菌過(guò)濾并以適當(dāng)?shù)牡确衷嚇臃盅b到瓶中用于藥用。按照液體產(chǎn)物或凍干產(chǎn)物進(jìn)一步處理所述制劑。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑包含a.溶解在水中的L-組氨酸，終濃度為0. 5mM至300mM，優(yōu)選3至200mM，最優(yōu)選20至 IOOmM ；b. L-精氨酸，最高為200mM,優(yōu)選0. 5至IOOmM,最優(yōu)選5至50mM ；c.甘露醇，最高為350mM，優(yōu)選30至300mM，最優(yōu)選100至230mM ;和d.醋酸，使得溶液中最高為200mM，優(yōu)選0. 05至IOOmM,最優(yōu)選0. 5至50mM。添加適當(dāng)量的治療化合物以達(dá)到濃度為I至100mg/mL,優(yōu)選5至50mg/mL,最優(yōu)選10至30mg/mL。將pH調(diào)整為終pH為4至8，優(yōu)選6. 5至7. 5，最優(yōu)選6. 7至7. 3。將所得的溶液調(diào)整成目標(biāo)重量，無(wú)菌過(guò)濾并以適當(dāng)?shù)牡确衷嚇臃盅b到瓶中用于藥用。按照液體產(chǎn)物或凍干產(chǎn)物進(jìn)一步處理所述制劑。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑包含a.溶解在水中的L-組氨酸，終濃度最高為200mM，優(yōu)選3至lOOmM，最優(yōu)選5至50mM L-組氨酸；b. L-精氨酸，最高為200mM,優(yōu)選0. 5至IOOmM,最優(yōu)選5至50mM ；c.甘露醇，最高為350mM，優(yōu)選30至300mM，最優(yōu)選100至230mM ;和d.醋酸，使得溶液中最高為200mM，優(yōu)選0. 05至IOOmM,最優(yōu)選0. 5至50mM。添加適當(dāng)量的治療化合物以達(dá)到濃度為I至100mg/mL,優(yōu)選5至50mg/mL,最優(yōu)選10至30mg/mL。將pH調(diào)整為終pH為4至8，優(yōu)選6. 5至7. 5，最優(yōu)選6. 7至7. 3。將所得的溶液調(diào)整成目標(biāo)重量，無(wú)菌過(guò)濾并以適當(dāng)?shù)牡确衷嚇臃盅b到瓶中用于藥用。按照液體產(chǎn)物或凍干產(chǎn)物進(jìn)一步處理所述制劑。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑包含a.溶解在水中的N-乙酸鹽，終濃度最高為200mM，優(yōu)選3至lOOmM，最優(yōu)選5至50mM L-組氨酸；b甘露醇，最高為350mM，優(yōu)選30至300mM，最優(yōu)選100至230mM ;和添加適當(dāng)量的治療化合物以達(dá)到濃度為I至100mg/mL,優(yōu)選5至50mg/mL,最優(yōu)選10至30mg/mL。將pH調(diào)整為終pH為4至8，優(yōu)選6. 5至7. 5，最優(yōu)選6. 7至7. 3。將所得的溶液調(diào)整成目標(biāo)重量，無(wú)菌過(guò)濾并以適當(dāng)?shù)牡确衷嚇臃盅b到瓶中用于藥用。按照液體產(chǎn)物或凍干產(chǎn)物進(jìn)一步處理所述制劑。還可將本發(fā)明的GLP-2類似物配制成緩慢釋放的植入裝置，用于延長(zhǎng)和持續(xù)施用GLP-2肽類似物。這樣的持續(xù)釋放制劑可以是位于身體表面的貼片形式。持續(xù)釋放制劑的實(shí)例包括生物相容性聚合物的復(fù)合材料，比如聚(乳酸)、乳酸-羥基乙酸共聚物、甲基纖維素、透明質(zhì)酸、唾液酸、硅酸鹽、膠原、脂質(zhì)體等。當(dāng)希望提供本發(fā)明GLP-2類似物的高局部濃度時(shí)，所述持續(xù)釋放制劑是特別有意義的?？梢砸院心c營(yíng)養(yǎng)(intestinotrophic)量的肽的無(wú)菌-填充小瓶或安瓿形式、以單位劑量或多劑量的量應(yīng)用GLP-2類似物。所述小瓶或安瓿可含有GLP-2類似物和理想的載體，作為可施用的制劑?；蛘?，所述小瓶或安瓿可含有適于在適當(dāng)載體(如無(wú)菌水或磷酸緩沖鹽水)中重建的形式(如冷凍形式)的GLP-2肽。作為注射制劑的替代方案，GLP-2類似物可配制成用于通過(guò)其它途徑給藥。可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)藥物實(shí)踐配制口服劑型比如片劑、膠囊劑等。根據(jù)本發(fā)明，施用GLP-2類似物以治療將受益于小腸組織生長(zhǎng)的個(gè)體?？赏ㄟ^(guò)加入增強(qiáng)劑例如殼聚糖或洗漆劑例如Tween 20、Tween80、泊洛沙姆例如Pluronic F-68、Pluronic F-127> Brij 35、Brij 72> cremophor EL 來(lái)配制鼻腔劑型。本發(fā)明的肽化合物可單獨(dú)使用，或者與具有抗炎效應(yīng)的化合物組合使用。不限于理論地，設(shè)想這樣的組合治療可增強(qiáng)本發(fā)明肽類似物的有益治療效果。當(dāng)然，最適于患者治療的治療劑量和方案將根據(jù)待治療的疾病或病癥以及患者的體重和其它參數(shù)而變化。不希望限于任何特定理論地，預(yù)計(jì)μ g/kg范圍內(nèi)的劑量以及更短或更長(zhǎng)的治療時(shí)間或頻率可產(chǎn)生治療上有用的結(jié)果，比如尤其是小腸質(zhì)量的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性增加。在一些情況下，治療方案可包括施用維持劑量，所述劑量適于預(yù)防初始治療停止后出現(xiàn)的組織退化?？筛鶕?jù)本發(fā)明得到的結(jié)果指導(dǎo)最適于人類應(yīng)用的劑量大小和給藥方案，并可在正確設(shè)計(jì)的臨床試驗(yàn)中進(jìn)行證實(shí)?？赏ㄟ^(guò)常規(guī)手段確定有效劑量和治療方案，從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中的低劑量開(kāi)始，然后提高劑量同時(shí)監(jiān)測(cè)效果，并系統(tǒng)性地變化給藥方案。在對(duì)給定的對(duì)象確定最佳劑量時(shí)，臨床醫(yī)生可考慮許多因素。這樣的考慮因素是技術(shù)人員公知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明GLP-2肽的人類劑量可以從約10 μ g/kg體重/天至約I Omg/kg/天,優(yōu)選約50 μ g/kg/天至約5mg/kg/天，并且最優(yōu)選約100 μ g/kg/天至約lmg/kg/ 天。醫(yī)療條件通過(guò)施用有效量的本文所述的GLP-2類似物或其鹽，本發(fā)明的肽可用作預(yù)防或治療患有胃腸(包括食管上消化道)病癥的個(gè)體的藥劑。所述胃和腸相關(guān)病癥包括任何病因的潰瘍(例如消化性潰瘍、藥物誘發(fā)的潰瘍、與感染或其它病原體有關(guān)的潰瘍)、消化病癥、吸收不良綜合征、短腸綜合征、盲管綜合征、炎性腸病、腹型斯?jié)姳R腹瀉(例如由麩質(zhì)誘發(fā)的腸病或乳糜瀉病引起)、熱帶型斯?jié)姳R腹瀉、低丙種球蛋白血癥型斯?jié)姳R腹瀉、腸炎、潰瘍 性結(jié)腸炎、小腸損傷和化學(xué)療法誘發(fā)的腹瀉/粘膜炎(CID)。如上文一般所述，將受益于小腸質(zhì)量提高以及隨后發(fā)生和/或維持正常小腸粘膜結(jié)構(gòu)和功能的個(gè)體是采用本發(fā)明GLP-2類似物治療的候選者?？捎肎LP-2類似物治療的具體病癥包括多種形式的斯?jié)姳R腹瀉，包括腹型斯?jié)姳R腹瀉，其由熱α-麥醇溶蛋白的毒性反應(yīng)引起，并且可能是麩質(zhì)誘發(fā)的腸病或乳糜瀉病的結(jié)果，以小腸絨毛的顯著喪失為特征；熱帶型斯?jié)姳R腹瀉，由感染引起，以絨毛的部分扁平為特征；丙種球蛋白血癥型斯?jié)姳R腹瀉，通常在患有普通變異型免疫球蛋白缺乏癥或低丙種球蛋白血癥的患者中觀察到，以絨毛高度顯著降低為特征。GLP-2類似物治療的治療效力可通過(guò)檢查絨毛形態(tài)的腸活檢、營(yíng)養(yǎng)吸收的生物化學(xué)評(píng)估、患者的體重增加、或這些病癥相關(guān)癥狀的改善來(lái)監(jiān)測(cè)。除上述以外，可用本發(fā)明GLP-2類似物治療或可用GLP-2類似物預(yù)防的其它病癥 還包括上述放射性腸炎、傳染性腸炎或感染后腸炎以及由于癌癥化學(xué)治療劑或毒劑引起的小腸損傷。GLP-2類似物還可用于治療營(yíng)養(yǎng)不良，例如惡病質(zhì)和厭食癥。本發(fā)明的具體實(shí)施方案涉及使用本發(fā)明的肽預(yù)防和/或治療腸損傷和功能障礙。這樣的損傷和功能障礙是癌癥化學(xué)療法治療熟知的副作用?；瘜W(xué)療法的施用經(jīng)常伴隨著涉及胃腸系統(tǒng)的不需要的副作用，比如粘膜炎、腹瀉、細(xì)菌易位、吸收不良、腹部痛性痙攣、胃腸出血和嘔吐。這些副作用是腸上皮結(jié)構(gòu)和功能損傷的臨床結(jié)果，經(jīng)常使得必須降低化學(xué)療法的劑量和頻率。施用本發(fā)明的GLP-2肽激動(dòng)劑可增強(qiáng)腸隱窩的營(yíng)養(yǎng)效應(yīng)并且迅速提供新細(xì)胞以取代化學(xué)療法后損傷的腸上皮。施用本發(fā)明肽實(shí)現(xiàn)的最終目標(biāo)是降低進(jìn)行化學(xué)療法治療患者中相關(guān)胃腸損傷的發(fā)病率，同時(shí)產(chǎn)生癌癥治療的最佳化學(xué)療法方案。根據(jù)本發(fā)明，可向正在進(jìn)行或準(zhǔn)備進(jìn)行放射療法的患者提供伴隨的預(yù)防性或治療性治療。由于增殖迅速，小腸粘膜干細(xì)胞對(duì)化學(xué)療法的細(xì)胞毒效應(yīng)特別敏感(Keefe等，Gut 2000;47:632-7)。臨床上，化學(xué)療法引起的小腸粘膜損傷通常稱為胃腸粘膜炎，特征為小腸吸收和屏障受損。例如，已經(jīng)顯示廣泛應(yīng)用的化學(xué)治療劑5-FU、伊立替康和氨甲蝶呤提高凋亡，引起嚙齒動(dòng)物小腸絨毛萎縮和隱窩發(fā)育不全(Keefe等，Gut 47 =632-7,2000 ；Gibson 等，J Gastroenterol Hepatol. Sep ； 18 (9) :1095_1100, 2003 ;Tamaki 等，J Int MedRes. 31(1) 6-16,2003)。在人中，已經(jīng)顯示化學(xué)治療劑在施用后24小時(shí)提高腸隱窩中的凋亡，并且其后在化學(xué)治療后3天降低絨毛面積、隱窩長(zhǎng)度、每個(gè)隱窩的有絲分裂數(shù)和腸細(xì)胞高度(Keefe等，Gut 2000 ；47 :632_7)。因此，小腸內(nèi)的結(jié)構(gòu)變化直接導(dǎo)致腸功能障礙，并在一些情況下導(dǎo)致腹瀉。癌癥化學(xué)療法后的胃腸粘膜炎是一旦出現(xiàn)就基本上不能治療的日益嚴(yán)重的問(wèn)題，盡管能逐漸緩和。利用常用的細(xì)胞抑制癌癥藥物5-FU和伊立替康進(jìn)行的研究證明，使用這些藥物的有效化學(xué)療法主要影響小腸的結(jié)構(gòu)完整性和功能，而結(jié)腸的敏感性較低，并且主要應(yīng)答為粘液形成的提高(Gibson 等，J Gastroenterol Hepatol. Sep ； 18 (9) :1095_1100，2003 ;Tamaki 等，J Int Med Res. 31(1) :6_16，2003)。本發(fā)明的新GLP-2類似物可用于預(yù)防和/或治療化學(xué)治療劑的胃腸損傷和副作用。這種可能很重要的治療應(yīng)用可適用于目前使用的化學(xué)治療劑，例如但不限于5-FU、六甲蜜胺、博來(lái)霉素、白消安、卡培他濱、卡鉬、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉬、克拉屈濱、Crisantaspase、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、達(dá)卡巴嗪、放線菌素D、柔紅霉素、多西紫杉醇、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟達(dá)拉濱、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、伊達(dá)比星、異環(huán)磷酰胺、伊立替康、脂質(zhì)體多柔比星、亞葉酸、洛莫司汀、美法侖、巰嘌呤、美司鈉、氨甲蝶呤、絲裂霉素、米托蒽醌、奧沙利鉬、紫杉醇、Pemetrexed、噴司他丁、丙卡巴肼、雷替曲塞、鏈脲菌素、替加氟-尿嘧啶、替莫唑胺、塞替派、硫鳥(niǎo)嘌呤/硫代鳥(niǎo)嘌呤、托泊替康、曲奧舒凡、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春 地辛、長(zhǎng)春瑞濱、博來(lái)霉素、白消安、卡培他濱、卡鉬、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、順鉬、克拉屈濱、Crisantaspase、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、達(dá)卡巴嗪、放線菌素D、柔紅霉素、多西紫杉醇、多柔比星、表柔比星、依托泊苷、氟達(dá)拉濱、氟尿嘧啶、吉西他濱、羥基脲、伊達(dá)比星、異環(huán)磷酰胺、伊立替康、脂質(zhì)體多柔比星、亞葉酸、洛莫司汀、美法侖、巰嘌呤、氨甲蝶呤、絲裂霉素、米托蒽醌、奧沙利鉬、紫杉醇、Pemetrexed、噴司他丁、丙卡巴肼、雷替曲塞、鏈脲菌素、替加氟-尿嘧啶、替莫唑胺、塞替派、硫鳥(niǎo)嘌呤/硫代鳥(niǎo)嘌呤、托泊替康、曲奧舒凡、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春地辛和長(zhǎng)春瑞濱。設(shè)想可通過(guò)施用有效量的GLP-2類似物或其鹽將本發(fā)明的肽用于治療新生兒的方法中。通過(guò)利用本發(fā)明的肽激動(dòng)劑可克服由于缺少腸發(fā)育造成的喂養(yǎng)新生兒的相關(guān)并發(fā)癥。在本發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施方案中，描述了通過(guò)向有此需要的患者施用有效量的GLP-2類似物或其鹽來(lái)治療DPP-IV (二肽基肽酶-IV)介導(dǎo)的病癥的方法。這樣的疾病包括DPP-IV酶過(guò)表達(dá)的病癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，可將藥物組合物配制成引起上述GLP-2類似物或其鹽或衍生物的緩慢釋放。設(shè)想可通過(guò)施用有效量的GLP-2類似物或其鹽將本發(fā)明的肽用于治療新生兒的方法中。通過(guò)利用本發(fā)明的肽激動(dòng)劑可克服由于缺少腸發(fā)育造成的喂養(yǎng)新生兒的相關(guān)并發(fā)癥。在本發(fā)明的另外一個(gè)實(shí)施方案中，描述了通過(guò)向有此需要的患者施用有效量的GLP-2類似物或其鹽來(lái)治療DPP-IV (二肽基肽酶-IV)介導(dǎo)的病癥的方法。這樣的疾病包括DPP-IV酶過(guò)表達(dá)的病癥。實(shí)施例提供下述實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的優(yōu)選方面，而不意在限制本發(fā)明的范圍。
_4] 一般肽合成儀器和合成策略在裝有用于過(guò)濾的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中分批合成肽，使用9-芴甲氧羰基(Fmoc)作為N- α -氨基保護(hù)基和適當(dāng)?shù)耐ㄓ脗?cè)鏈功能性保護(hù)基。溶劑將溶劑DMF (N, N-二甲基甲酰胺,Riedel de-Haen, Germany)通過(guò)填充強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂(Lewatit S 100MB/H strong acid, Bayer AG Leverkusen, Germany)的柱進(jìn)行純化，并在使用前加入3，4-二氫-3-羥基-4-氧代-I，2，3-苯并三嗪(Dhbt-OH)分析其中的游離胺，如果存在游離胺，則產(chǎn)生黃色(Dhbt-O-陰離子)。不經(jīng)純化直接使用溶劑DCM( 二氯甲燒，分析級(jí)，Riedel de_Haen, Germany)。不經(jīng)純化直接使用乙腈(HPLC-級(jí),Lab-Scan,Dublin Ireland)。氨基酸以適當(dāng)?shù)膫?cè)鏈保護(hù)形式從Advanced ChemTech (ACT)購(gòu)得Fmoc保護(hù)的氨基酸。偶聯(lián)試劑
偶聯(lián)試劑二異丙基碳二亞胺(DIC)購(gòu)自Riedel de-Haen, Germany。固體支持物在TentaGel S樹(shù)脂O. 22-0. 31mmol/g上合成肽,在優(yōu)選C端酰胺化肽的情況下使用 TentaGel S-Ram、TentaGel SRAM-Lys (Boc) Fmoc (Rapp polymere, Germany),而當(dāng)優(yōu)選 C端游離竣酸時(shí)使用 TentaGel S PHB, TentaGel S PHB Lys (Boc) Fmoc0催化劑和其它試劑二異丙基乙胺(DIEA)購(gòu)自Aldrich, Germany,哌卩定和卩比卩定來(lái)自Riedel-de Haen,Frankfurt, Germany。ethandithiol 購(gòu)自 Riedel-de Haen, Frankfurt, Germany。3,4-二氫-3-羥基-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪(Dhbt-OH)、I-羥基苯并三唑(HOBt) (HOAt)得自 Fluka, Switzerland。乙酸酐得自 Fluka。偶聯(lián)方案在DMF中通過(guò)DIC法由適當(dāng)?shù)腘_a_保護(hù)的氨基酸和HObt或HOAt將氨基酸偶聯(lián)為原位合成的HObt或HOAt酯。在80°C進(jìn)行茚三酮測(cè)試檢查酰化作用，以防止測(cè)試期間Fmoc去保護(hù)(Larsen, B. D. and Holm, A.，Int. J. Peptide Protein Res. 43,1994,1-9)。N-α-氨基保護(hù)基(Fmoc)的去保護(hù)按以下進(jìn)行Fmoc基的去保護(hù)利用DMF中的20 %哌啶進(jìn)行處理(I X 5和I X 10分鐘)，隨后用DMF沖洗(5 X 15ml，每次5分鐘)直到向排出的DMF中加入Dhbt-OH后不能檢測(cè)到黃色為止。HOBt-酯的偶聯(lián)將3份N- a -氨基保護(hù)的氨基酸與3份HObt和3份DIC —起溶解在DMF中，然后加入樹(shù)脂中。用酸從樹(shù)脂中切割肽利用三氟乙酸(TFA, Riedel-de Haen, Frankfurt, Germany)-水(體積 / 體積)或95% TFA和5%乙二硫醇(體積/體積)在室溫下處理2小時(shí)從樹(shù)脂中切割肽。用95% TFA-水洗滌過(guò)濾的樹(shù)脂，減壓蒸發(fā)濾液和洗液。用醚沖洗殘留物并在醋酸-水中凍干。通過(guò)高效液相層析(HPLC)分析粗冷凍產(chǎn)物并通過(guò)質(zhì)譜(MS)進(jìn)行鑒定。在TentaGel樹(shù)脂(PEG-PS)上進(jìn)行分批肽合成將TentaGel樹(shù)脂(lg,O. 23-0. 24mmol/g)置于裝有用于過(guò)濾的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中。所述樹(shù)脂在DMF(15ml)中膨脹，并用DMF中的20 %哌啶處理，以除去接頭TentaGel S RAM上或樹(shù)脂TentaGel S RAM-Lys (Boc) Fmoc的第一個(gè)氨基酸上的初始Fmoc基團(tuán)。排干樹(shù)脂并用DMF洗滌直到向排出的DMF中加入Dhbt-OH后不能檢測(cè)到黃色為止。如上述將根據(jù)序列的氨基酸偶聯(lián)為預(yù)制的Fmoc-保護(hù)的HObt酯(3份)。除非另外指出，繼續(xù)偶聯(lián)2小時(shí)。排干樹(shù)脂并用DMF (5 X 15ml，每次5分鐘)洗滌以除去過(guò)量的試劑。通過(guò)上述茚三酮測(cè)試檢查所有的?；饔?。完成合成后，用DMF (3 X 15ml，每次5分鐘)、DCM (3 X 15ml，每次I分鐘)以及最后用二乙醚(3X15ml，每次I分鐘)洗滌肽-樹(shù)脂，并真空干燥。如上所述從樹(shù)脂中切割肽并如下所述分析和純化粗肽產(chǎn)物。HPLC 條件用HP 1100四元泵、HP 1100自動(dòng)進(jìn)樣器、HP 1100柱恒溫器和HP 1100多波長(zhǎng)檢測(cè)器組成的Hewlett Packard HP 1100HPLC系統(tǒng)進(jìn)行梯度HPLC分析。使用HewlettPackard Chemstation for LC軟件(A. 06. Ol版)進(jìn)行儀器控制和數(shù)據(jù)采集。使用以下的柱和HPLC緩沖系統(tǒng)柱VYDAC238TP5415，C-18，5mm，300人 150 X 4. 6mm。緩沖液AMQV 中 0· 1% 的 TFA ；Β 0. 085% TFAUO % MQV,90 % MeCN。梯度0-1·5 分鐘· 0% B
I. 5-25 分鐘 50% B25-30 分鐘 100% B30-35 分鐘 100% B35-40 分鐘 0% B流速Iml/分鐘，箱溫度40°C，UV檢測(cè)I = 215nm。粗肽的HPLC純化通過(guò)PerSeptive Biosystems VISION工作站純化粗妝產(chǎn)物，VISION 3. O軟件用于儀器控制和數(shù)據(jù)采集。使用下述柱和HPLC緩沖系統(tǒng)柱KromasilKR 100 A, IOmm C_8,250X50· 8mm。緩沖體系緩沖液AMQV 中 O. 1% 的 TFA ；B 0. 085% TFAUO% MQV,90% MeCN0梯度0-37分鐘.0-40% B流速35ml/ 分鐘，UV 檢測(cè)I = 215nm 和 280nm。質(zhì)譜將妝溶解在超梯度甲醇(Labscan,Dublin, Ireland)、milli-Q 水(Millipore,Bedford,MA)和甲酸(Merck,Damstadt,Germany) (50 : 50 : 0. lv/v/v)中得到 I 至 IOmg/ml的濃度。利用準(zhǔn)確度為+/-0. lm/z的LCT質(zhì)譜儀(Micromass, Manchester, UK)通過(guò)ESI-TOF-MS以正極性方式分析肽溶液(20ml)。一般合成方案在所有合成中，將干燥的TentaGel-S-Ram樹(shù)脂(lg，0. 22-0. 31mmol/g)置于裝有用于過(guò)濾的聚丙烯濾器的聚乙烯容器中。所述樹(shù)脂在DMF(15ml)中膨脹，并用含有20%哌啶的DMF處理以保證樹(shù)脂上非質(zhì)子化氨基的存在。排干樹(shù)脂并用DMF洗滌，直到向排出的DMF中加入Dhbt-OH后不能檢測(cè)到黃色為止。如上述將根據(jù)序列的氨基酸偶聯(lián)為預(yù)制的Fmoc-保護(hù)的HObt酯(3份)。除非另外指出，繼續(xù)偶聯(lián)2小時(shí)。排干樹(shù)脂并用DMF (5 X 15ml，每次5分鐘)洗滌以除去過(guò)量的試劑。在80°C進(jìn)行茚三酮測(cè)試檢查所有的?；饔?。完成合成后，用DMF(3X 15ml，每次5分鐘)、DCM(3X 15ml，每次I分鐘)以及最后用二乙醚(3X15ml，每次I分鐘)洗滌肽-樹(shù)脂，并真空干燥。如上所述從樹(shù)脂中切割肽并凍干。利用上述制備性HPLC純化后，收集肽產(chǎn)物并通過(guò)ES-MS確定肽的身份。該方案用于合成下文進(jìn)一步示例的所有肽。合成的化合物利用上述技術(shù)，使用上述方法合成化合物1809至1861以及參照化合物1559 (H- [Gly2] hGLP-2-0H)(表 I)。表I :合成的化合物
權(quán)利要求
1.通式I代表的胰高血糖素樣肽2(GLP-2)類似物或者其可藥用鹽或衍生物 R'-Z'-His^-XS-Gly-XS-Xe-XT-XS-Xg-XlO-Xll-X^-XlS-XH-XlS-Xie-XlT-Ala-Xig-X20-X21-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z2-R2其中 R1為氫、CV4烷基(例如甲基)、こ?；?、甲?；⒈郊柞；蛉初；? X2 為 Gly、Ala 或 SarX3 為 Glu 或 AspX5 為 Ser 或 ThrX6 為 Phe 或 ProTl 為 Ser 或 ThrX8 為 Asp 或 SerX9 為 Glu 或 Asp XlO為Met、Leu、Nle或氧化穩(wěn)定的Met取代氨基酸 Xll 為 Asn、Ala、Lys 或 SerX12 為 Thr 或 Lys X13 為 Ile、Glu 或 GlnX14 為 Leu、Met 或 NleX15 為 Asp 或 GluX16 為 Asn 或 AlaX17 為 Leu 或 GluX18 為 Ala 或 AibX19 為 Ala 或 ThrX20 為 Arg 或 LysX21 為 Asp 或 Ile X24 為 Asn、Ala 或 Glu X28 為 GlruAla 或 Asn X31為Pro、Ile或缺失 X32為Thr或缺失 X33為Asp、Asn或缺失R2 為 NH2 或 OH ； Z1 和 Z2 獨(dú)立地為不存在或選自 Ala、Leu、Ser> Thr> Tyr、Asn、Gin、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met和Orn的3至20個(gè)氨基酸單位的肽序列；并且 其中所述GLP-2類似物包含選自以下的一種或更多種替換X8為Ser和/或X16為Ala和/或X24為Ala和/或X28為Ala。
2.通式II代表的權(quán)利要求I所述GLP-2類似物或者其可藥用鹽或衍生物 R'-Z'-His-Gly-XS-Gly-XS-Phe-XT-XS-Xg-XlO-Xll-X^-XlS-XH-XlS-Xie-XlT-Ala-XI9-Arg-Asp-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z2-R2其中 R1為氫、CV4烷基(例如甲基)、こ?；?、甲?；⒈郊柞；蛉初；鵛3 為 Glu 或 AspX5 為 Ser 或 ThrTl 為 Ser 或 ThrX8 為 Asp 或 SerX9 為 Glu 或 Asp XlO為Met、Leu、Nle或氧化穩(wěn)定的Met取代氨基酸Xll 為 Asn、Ala、Lys 或 SerX12 為 Thr 或 LysX13 為 Ile、Glu 或 GlnX14 為 Leu、Met 或 NleX15 為 Asp 或 GluX16 為 Asn 或 AlaX17 為 Leu 或 GluX19 為 Ala 或 ThrX24 為 Asn 或 AlaX28 為 GlruAla 或 Asn X31為Pro、Ile或缺失 X32為Thr或缺失 X33為Asp或缺失R2 為 NH2 或 OH ； Z1 和 Z2 獨(dú)立地為不存在或選自 Ala、Leu、Ser> Thr> Tyr、Asn、Gin、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met和Orn的3至20個(gè)氨基酸單位的肽序列；并且 其中所述GLP-2類似物包含選自以下的一種或更多種替換X8為Ser和/或X16為Ala和/或X24為Ala和/或X28為Ala。
3.通式III代表的權(quán)利要求I或權(quán)利要求2所述GLP-2類似物或者其可藥用鹽或衍生物R'-Z'-His-Gly-XS-Gly-XS-Phe-XT-XS-Glu-XlO-Xll-Thr-Ile-Leu-Asp-Xie-Leu-Ala-Ala-Arg-Asp-Phe-Ile-X24-Trp-Leu-Ile-X28-Thr-Lys-X31-X32-X33-Z2-R2其中 R1為氫、CV4烷基(例如甲基)、こ酰基、甲?；⒈郊柞；蛉初；? X3 為 Glu 或 Asp X5 為 Ser 或 Thr Tl 為 Ser 或 Thr X8 為 Asp 或 Ser XlO為Met、Leu、Nle或氧化穩(wěn)定的Met取代氨基酸 Xll 為 Asn、Ala、Lys 或 SerX24 為 Asn 或 AlaX28 為 Gln 或 AlaX31為Pro或缺失X32為Thr或缺失X33為Asp或缺失R2 為 NH2 或 OH ； Z1 和 Z2 獨(dú)立地為不存在或選自 Ala、Leu、Ser> Thr> Tyr、Asn、Gin、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Met和Orn的3至20個(gè)氨基酸單位的肽序列；并且 其中所述GLP-2類似物包含選自以下的一種或更多種替換X8為Ser和/或X16為Ala和/或X24為Ala和/或X28為Ala。
4.權(quán)利要求I至3中任一項(xiàng)的GLP-2類似物，其中所述GLP-2類似物與野生型 GLP-2(l-33)具有至少60%的氨基酸序列同一性，并且在體內(nèi)具有引起小腸質(zhì)量增加的生物活性。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的GLP-2類似物，其中所述GLP-2類似物包含X8、X16、X24和/或X28中一個(gè)以上位置的替換和/或一個(gè)或更多個(gè)所述替換與X3、X5、X7、X10和/或Xll中一個(gè)或更多個(gè)位置上的替換組合。
6.權(quán)利要求5的GLP-2類似物，其中所述XlO位上的替換為L(zhǎng)eiuNle或氧化穩(wěn)定的Met取代氨基酸，例如Met (O)或Met(0)2。
7.權(quán)利要求5的GLP-2類似物，其中所述Xll位上的替換為Ala、Ser或Lys。
8.權(quán)利要求4的GLP-2類似物，其中所述GLP-2類似物包含一種或更多種以下替換 Ser8, Alal6Ser8，Ala24Ser8, Ala28Alal6，Ala24Alal6，Ala28Ala24，Ala28Ser8，Alal6，Ala24Ser8, Alal6，Ala28Ser8, Ala24，Ala28Alal6，Ala24，Ala28Ser8, Alal6，Ala24，Ala28。
9.權(quán)利要求5的GLP-2類似物，其中所述GLP-2類似物包含一種或更多種下述替換 Glu3, LeulO, Alall,24Glu3, Thr5, LeulO, Serll, Alal6，24，28Glu3, Thr5, LeulO, Lysll, Alal6，24，28Glu3, Thr5, Ser8, LeulO, Lysll, Alal6，24，28Glu3, Thr5, Ser8,11，LeulO, Alal6，24，28Glu3, Thr5, Ser8,11，LeulO, Alal6，24，28Glu3, Ser8,11，LeulO, Alal8，24，28Glu3, LeulO, Serll, Alal6，24，28Glu3, LeulO, Lysll, Alal6，24，28Glu3, Thr5, LeulO, Alall, 16，24，28Glu3, Thr5, LeulO, Alall, 16，24，28，Ile21Glu3, Thr5, Ser8, LeulO, Alall, 16，24，28Glu3, Ser8, LeulO, Alall, 16，24，28Glu3, LeulO, Alall,16,24,28Thr7, LeulO, Alall,24Thr7, LeulO, Lysll, Ala24Thr7, LeulO, Serll, Ala24Thr7, LeulO, Ser8,11，Ala24Thr7, Ser8, LeulO, Alall, 24Thr7, Ser8, LeulO, Lysll, Ala24Ser8, LeulO, Alall, 24LeulO, Ala24LeulO, Alall, Ala24LeulO, Alall,24,28LeulO, Alall,16,24,28LeulO, Lysll, Ala24LeulO, Serll, Ala24LeulO, Ser8,11, Ala24 ;或 X31-X33中一個(gè)或更多個(gè)位置上的缺失。
10.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的GLP-2類似物或者其可藥用鹽或衍生物，所述GLP-2類似物如本文表I所公開(kāi)。
11.權(quán)利要求I至9中任一項(xiàng)的GLP-2類似物，其中所述GLP-2類似物包含X3、X8和/或X24中一個(gè)以上位置上的替換。
12.權(quán)利要求11的GLP-2類似物或者其可藥用鹽或衍生物，其中所述GLP-2類似物包含一種或更多種選自以下的替換X3為Asp、X8為Asp和X24為Ala，并任選地缺失了 X31、X32和X33位置上的氨基酸殘基。
13.權(quán)利要求11或權(quán)利要求12的GLP-2類似物或者其可藥用鹽或衍生物，所述GLP-2類似物為 1830H-HGDGSFSDELSTILDNLMRDFIAWLIQTK-NH21831H-HGDGSFTDELST1LDNLAARDFIAWLIQTK-NH21835H-HGDGSFSDELKTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH21836H-HGDGSFTDELKTILDNLAARDFIAWLIQTK-NH21839H-HGDGSFSDELATILDNLAARDFIAWLIQTKITDKKKKKK-NH21840H-HGDGSFSDELATILDNLAARDFIAWLIQTKITD-NH21841H-HGDGSFSDELATILDNLAARDFIAWLIQTK-NH21843 H-HGDGSFTDHLATILDNLAARDFIAWLIQTK-NH2 °
14.權(quán)利要求I至9中任一項(xiàng)的GLP-2類似物，其具有X3、X33、X10、XII、X16和/或X24中一個(gè)或更多個(gè)位置上的替換。
15.前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的GLP-2類似物，用于治療。
16.藥物組合物，其包含與載體混合的前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的GLP-2類似物或者其鹽或衍生物。
17.權(quán)利要求16的藥物組合物，其中所述GLP-2類似物為可藥用酸加成鹽。
18.權(quán)利要求16或權(quán)利要求17的藥物組合物，其被配制成適于注射或輸注的液體，或被配制成使所述GLP-2類似物緩慢釋放。
19.權(quán)利要求I至14中任一項(xiàng)的GLP-2類似物在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療和/或預(yù)防胃和腸相關(guān)病癥。
20.權(quán)利要求19的用途，其中所述胃和腸相關(guān)病癥為潰瘍、消化病癥、吸收不良綜合征、短腸綜合征(short gut syndrome)、盲管綜合征、炎性腸病、腹型斯?jié)姳R腹瀉(例如由麩質(zhì)誘發(fā)的腸病或乳糜瀉病引起)、熱帶型斯?jié)姳R腹瀉、低丙種球蛋白血癥型斯?jié)姳R腹瀉、腸炎、局限性腸炎(克羅恩病)、潰瘍性結(jié)腸炎、小腸損傷、短腸綜合征(short bowelsyndrome)、胃炎或腹瀉相關(guān)的腸易激綜合征。
21.權(quán)利要求19的用途，其中所述胃和腸相關(guān)病癥為放射性腸炎、傳染性腸炎或感染后腸炎，或者由于毒劑或者其它化學(xué)治療劑引起的小腸損傷。
22.權(quán)利要求I至14中任一項(xiàng)的GLP-2類似物在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療和/或預(yù)防化學(xué)療法或放射治療的副作用。
23.權(quán)利要求22的用途，其中所述副作用是由于化學(xué)療法引起的腹瀉、腹部痛性痙攣或嘔吐，或者由化學(xué)療法或放射療法治療引起的腸上皮結(jié)構(gòu)和功能損傷。
24.權(quán)利要求I至14中任一項(xiàng)的GLP-2類似物在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療新生兒腸功能受損、骨質(zhì)疏松或DPP-IV(二肽基肽酶-IV)介導(dǎo)的病癥。
25.權(quán)利要求I至14中任一項(xiàng)的GLP-2類似物在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療和/或預(yù)防與營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的病癥。
26.權(quán)利要求25的用途，其中所述與營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的病癥為惡病質(zhì)或厭食癥。
27.核酸分子，其包含編碼權(quán)利要求I至14中任一項(xiàng)的GLP-2類似物的核酸序列。
28.表達(dá)載體，其包含與指導(dǎo)其表達(dá)的控制序列組合的權(quán)利要求27所述核酸序列。
29.已轉(zhuǎn)化權(quán)利要求28所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
30.生產(chǎn)權(quán)利要求I至14中任一項(xiàng)的GLP-2類似物的方法，所述方法包括在適于表達(dá)GLP-2類似物的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求29的宿主細(xì)胞以及純化這樣生產(chǎn)的GLP-2類似物。
31.根據(jù)權(quán)利要求27的核酸分子、根據(jù)權(quán)利要求28的表達(dá)載體或根據(jù)權(quán)利要求29的宿主細(xì)胞，用于治療。
32.根據(jù)權(quán)利要求27的核酸分子、根據(jù)權(quán)利要求28的表達(dá)載體或根據(jù)權(quán)利要求29的宿主細(xì)胞在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療和/或預(yù)防胃和腸相關(guān)病癥，或者用于治療和/或預(yù)防化學(xué)療法或放射治療的副作用，或者用于治療新生兒腸功能受損、骨質(zhì)疏松或DPP-IV (二肽基肽酶-IV)介導(dǎo)的病癥。
33.治療有此需要的患者中胃和腸相關(guān)病癥的方法，所述方法通過(guò)施用有效量的權(quán)利要求I至14中任一項(xiàng)的GLP-2類似物、根據(jù)權(quán)利要求27的核酸分子、根據(jù)權(quán)利要求28的表達(dá)載體或根據(jù)權(quán)利要求29的宿主細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述胃和腸相關(guān)病癥為潰瘍、消化病癥、吸收不良綜合征、短腸綜合征(short gut syndrome)、盲管綜合征、炎性腸病、腹型斯?jié)姳R腹瀉(例如由麩質(zhì)誘發(fā)的腸病或乳糜瀉病引起)、熱帶型斯?jié)姳R腹瀉、低丙種球蛋白血癥型斯?jié)姳R腹瀉、小腸炎、局限性腸炎(克羅恩病)、潰瘍性結(jié)腸炎、小腸損傷、短腸綜合征(short bowelsyndrome)、胃炎或腹瀉相關(guān)的腸易激綜合征。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述胃和腸相關(guān)病癥為放射性腸炎、傳染性腸炎或感染后腸炎，或者由于毒劑或者其它化學(xué)治療劑引起的小腸損傷。
36.在有此需要的患者中治療或預(yù)防化學(xué)療法或放射療法副作用的方法，所述方法包括施用有效量的權(quán)利要求I至14中任一項(xiàng)的GLP-2類似物、根據(jù)權(quán)利要求27的核酸分子、根據(jù)權(quán)利要求28的表達(dá)載體或根據(jù)權(quán)利要求29的宿主細(xì)胞。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述副作用為由于化學(xué)療法引起的腹瀉、腹部痛性痙攣或嘔吐,或者由化學(xué)療法或放射療法治療弓I起的腸上皮結(jié)構(gòu)或功能損傷。
38.在需要其治療的患者中治療新生兒腸功能受損、肥胖、骨質(zhì)疏松或DPP-IV(二肽基肽酶-IV)介導(dǎo)的病癥的方法，所述方法包括施用有效量的權(quán)利要求I至14中任一項(xiàng)的GLP-2類似物、根據(jù)權(quán)利要求27的核酸分子、根據(jù)權(quán)利要求28的表達(dá)載體或根據(jù)權(quán)利要求29的宿主細(xì)胞。
39.治療藥盒，其包含癌癥化學(xué)療法藥物以及根據(jù)權(quán)利要求I至14中任一項(xiàng)的GLP-2類似物、根據(jù)權(quán)利要求27的核酸分子、根據(jù)權(quán)利要求28的表達(dá)載體或根據(jù)權(quán)利要求29的宿主細(xì)胞，其中每一種均任選地與可藥用載體組合。
40.藥物組合物，其包含與可藥用載體組合的癌癥化學(xué)療法藥物以及根據(jù)權(quán)利要求I至14中任一項(xiàng)的GLP-2類似物、根據(jù)權(quán)利要求27的核酸分子、根據(jù)權(quán)利要求28的表達(dá)載體或根據(jù)權(quán)利要求29的宿主細(xì)胞。
全文摘要
本文公開(kāi)了GLP-2類似物，與[hGly2]GLP-2相比，所述GLP-2類似物包含一個(gè)或多個(gè)替換并且提高了體內(nèi)生物活性和/或提高了化學(xué)穩(wěn)定性，例如通過(guò)體外穩(wěn)定性測(cè)定評(píng)估的化學(xué)穩(wěn)定性。更具體地，本文公開(kāi)的優(yōu)選GLP-2類似物包含野生型GLP-2序列8、16、24和/或28位中一個(gè)或多個(gè)位置上的替換和/或31至33位氨基酸中一個(gè)或多個(gè)缺失和/或N端或C端穩(wěn)定肽序列的添加，其中所述替換任選地與2位(如說(shuō)明書(shū)中所述)和3、5、7、10以及11位中的一個(gè)或多個(gè)位置上的其他替換組合。所述類似物尤其可用于預(yù)防或治療胃和腸相關(guān)病癥以及用于減輕化學(xué)療法的副作用。
文檔編號(hào)C12N15/16GK102659938SQ20121012433
公開(kāi)日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2006年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月4日
發(fā)明者伊薇特·米亞塔·彼得森, 基爾斯滕·埃貝霍伊, 比亞內(nèi)·杜·拉森 申請(qǐng)人:西蘭制藥公司