專(zhuān)利名稱(chēng)：利用聚酮合酶生產(chǎn)α-烯烴的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用聚酮合酶產(chǎn)生α -烯烴，因而涉及化學(xué)、微生物學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
I型聚酮合酶(PKS)是能夠具有脂肪酸合酶(FAS)的所有催化能力的可編程的多功能酶。然而，與FAS酶反復(fù)延伸并完全還原每次延伸烴主鏈所產(chǎn)生的β-羰基不同，PKS系統(tǒng)每次延伸和還原新生鏈時(shí)利用分散排列的酶促結(jié)構(gòu)域。這些通常被稱(chēng)為模塊的排列能夠引入導(dǎo)致不同側(cè)鏈的多種延伸單元。它們還能夠編碼O至3個(gè)與FAS相關(guān)的還原結(jié)構(gòu)域，其在生長(zhǎng)的聚酮鏈的β位分別導(dǎo)致酮基、羥基、雙鍵或完全飽和的碳(Hopwood andSherman.1990.Annual Review of Genetics24:37-66)。由于其模塊性，PKS系統(tǒng)已被廣泛開(kāi)發(fā)用于產(chǎn)生“非天然的”天然產(chǎn)物(Weissmanand Leadlay.2005.Nature Reviews Microbiology3:925-936)。已經(jīng)產(chǎn)生數(shù)百種這樣的分子，范圍從堿性?xún)?nèi)酯到修飾形式的藥物和藥物樣化合物。發(fā)明概述本發(fā)明提供了能夠合成α-烯烴的聚酮合酶(PKS)，用于產(chǎn)生所述聚酮合酶的重組表達(dá)載體，表達(dá)所述聚酮合酶并產(chǎn)生期望的α-烯烴的重組宿主細(xì)胞，制備α-烯烴的方法以及通過(guò)所述方法產(chǎn)生的α-烯烴。本發(fā)明的PKS不是天然存在的，因而被稱(chēng)為“重組的’TKS酶。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，α-烯烴不是由天然存在的PKS合成的化合物。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，PKS是包含來(lái)自?xún)煞N、三種、四種或更多種天然存在的PKS的模塊和/或其一部分的雜合PKS。雜合PKS可以含有來(lái)自?xún)煞N或更多種天然存在的PKS的天然存在的模塊和/或其可以含有一個(gè)或多個(gè)模塊，所述模塊由來(lái)自同一種天然存在的PKS或來(lái)自?xún)煞N或更多種天然存在的PKS或以上兩種情況的兩個(gè)或更多個(gè)模塊的一部分(包括完整的結(jié)構(gòu)域)組成。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，利用包含天然存在的或重組的CurM模塊或其一部分的重組核酸。本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明PKS的重組核酸。重組核酸包括以下核酸:包含本發(fā)明的一部分或全部PKS的核酸，還包含調(diào)控序列如啟動(dòng)子和翻譯起始和終止序列的核酸，以及還可包含促進(jìn)在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定維持的序列(即，提供復(fù)制起始功能的序列或促進(jìn)通過(guò)同源重組整合入宿主細(xì)胞染 色體DNA或其它DNA中的序列)的核酸。在一些實(shí)施方案中，重組核酸被穩(wěn)定地整合入宿主細(xì)胞的染色體。在一些實(shí)施方案中，重組核酸是質(zhì)粒。因此，本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明重組核酸的載體，包括表達(dá)載體。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的重組核酸和/或PKS中的任一種的宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)在合適的條件下培養(yǎng)時(shí)，宿主細(xì)胞能夠產(chǎn)生α-烯烴。這些宿主細(xì)胞包括，例如但不限于原核生物以及真核生物，所述原核生物如腸桿菌(Ε.coli)、芽孢桿菌(Bacillus)屬、鏈霉菌(Streptomyces)屬、粘細(xì)菌(Myxobacterial)屬,所述真核生物包括但不限于酵母和真菌菌株。因此，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的一種或多種重組核酸和/或PKS的多種宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)，宿主細(xì)胞能夠產(chǎn)生α-烯烴，在不存在本發(fā)明核酸的條件下，α-烯烴不會(huì)產(chǎn)生或以較低的水平產(chǎn)生。本發(fā)明提供了產(chǎn)生α -烯烴的方法，所述方法大體包括:提供本發(fā)明的宿主細(xì)胞，在合適的條件下，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，使其產(chǎn)生α -烯烴。本發(fā)明還提供了組合物，所述組合物包含來(lái)自宿主細(xì)胞(其產(chǎn)生α-烯烴)的α -烯烴，并且在一些實(shí)施方案中，可以包含宿主細(xì)胞的痕量殘留物和/或其它成分。這類(lèi)痕量殘留物和/或其它成分可以包括，例如，由宿主細(xì)胞裂解所產(chǎn)生的細(xì)胞物質(zhì)。本發(fā)明還提供了純化α-烯烴的方 法以及將所述α-烯烴轉(zhuǎn)化成其它有用的產(chǎn)物的方法。


本領(lǐng)域技術(shù)人員由以下詳細(xì)描述的示例性實(shí)施方案結(jié)合附圖閱讀時(shí)，將易于理解本發(fā)明的以上方面和實(shí)施方案以及其它方面。圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明適于合成1-己烯的生物合成途徑的模塊構(gòu)建的示例性實(shí)例。在該圖中，推薦的模塊來(lái)源于來(lái)自紅霉素PKS的DEBSl的裝載模塊，來(lái)自制霉菌素PKSNysC的模塊5和curacin PKS的CurM末端模塊。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，制霉菌素PKS模塊5用來(lái)自茚滿(mǎn)霉素(indanomyCin)PKS的模塊9和10的一部分替代。這種可選擇的實(shí)施方案實(shí)際上已用于產(chǎn)生1-己烯。圖2顯示了所用的模塊類(lèi)型和用于引入聚酮鏈的對(duì)應(yīng)前體。裝載模塊被命名為S。盡管可以使用任何合適的裝載結(jié)構(gòu)域(諸如裝載醋酸鹽和苯甲酸的那些結(jié)構(gòu)域)，但在該圖中僅示出了兩個(gè)實(shí)例。其余化合物代表利用延伸模塊A - P引入生長(zhǎng)的聚酮鏈中的結(jié)構(gòu)。虛線(xiàn)指示通過(guò)克萊森(Claisen)縮合反應(yīng)形成的C-C鍵；鍵右側(cè)的原子和虛線(xiàn)左側(cè)的C原子代表由所用模塊決定的結(jié)構(gòu)。R基代表在由模塊決定引入之前已存在的酰基鏈。圖3顯示:㈧根據(jù)本發(fā)明可用于產(chǎn)生1-己烯的PKS系統(tǒng)，⑶可如何添加其它模塊以產(chǎn)生更長(zhǎng)的偶數(shù)鏈α-烯烴，以及(C)根據(jù)本發(fā)明的方法，如何改變引入醋酸鹽(來(lái)自丙二酰輔酶Α)的裝載模塊來(lái)允許達(dá)到飽和的線(xiàn)性奇數(shù)鏈α-烯烴。圖4顯示了圖解利用除蟲(chóng)菌素PKS裝載模塊的本發(fā)明的一實(shí)施方案。所示的側(cè)鏈僅僅是實(shí)例，而并非構(gòu)成可利用除蟲(chóng)菌素裝載模塊(或相似的裝載模塊)根據(jù)本發(fā)明的方法和教導(dǎo)引入的整個(gè)側(cè)鏈庫(kù)。圖5在(A)部分中顯示了 3-亞甲基-4-戊烯酸的示例性途徑的實(shí)例，根據(jù)本發(fā)明的方法利用PKS獲取羧化丁二烯衍生物的實(shí)例，以及二烯烴和羧酸部分之間的距離可如何通過(guò)使用其它PKS模塊來(lái)增加。圖5在(B)部分中顯示了從jamaicamide途徑生物合成環(huán)外亞甲基所提出的機(jī)制(參見(jiàn)Edwards et al.2004.Chem Biol.11 (6):817-33;通過(guò)引用并入本文)。
圖6顯示了根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生丁二烯的PKS。盡管本發(fā)明不以任何方式受本文列舉的或顯示的任何所提出的作用機(jī)制的限制，但是該圖為了簡(jiǎn)單的目的示例了羥基以水分子脫除，酶促機(jī)制利用硫酸鹽作為離去基團(tuán)。圖7顯示了根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生丁二烯的PKS。(A)和⑶部分顯示了利用修飾成接受丙烯酰輔酶A的DEBS丙酰輔酶A特異性裝載結(jié)構(gòu)域裝載丙烯酰輔酶A。(C)部分顯示了丙烯酸鹽部分的硫轉(zhuǎn)移至KS結(jié)構(gòu)域。(D)部分顯示了丙二酰輔酶A的結(jié)合并轉(zhuǎn)移至ACP結(jié)構(gòu)域。(E)部分顯示了 KS催化部分的縮合并釋放C02。(F)部分顯示了 KR催化β_羰基基團(tuán)的還原。(G)部分顯示了終步驟以及丁二烯、CO2和水的釋放(如圖6，用水分子示例羥基基團(tuán)的脫除，但是酶促機(jī)制利用硫酸鹽作為離去基團(tuán))。圖8顯示了通過(guò)本發(fā)明的方法和材料產(chǎn)生丙烯酰輔酶A可獲得的酶促途徑，包括外源供給丙酸鹽，并表達(dá)PrpE和酰基輔酶A脫氫酶活性。為包含該系統(tǒng)的宿主細(xì)胞提供丙酸鹽，如果丙酸鹽不是由所選擇用于生產(chǎn)的宿主細(xì)胞內(nèi)源產(chǎn)生的，則可以外源供給。圖9顯示了通過(guò)本發(fā)明的方法和材料產(chǎn)生丙烯酰輔酶A可獲得的酶促途徑，包括外源供給丙酸鹽和葡萄糖。為包含該系統(tǒng)的宿主細(xì)胞提供丙酸鹽和宿主細(xì)胞可以直接或間接轉(zhuǎn)化成丙酮酸鹽的合適的有機(jī)分子，所述丙酸鹽通過(guò)外源供給或上文所述的丙酸鹽生物合成途徑引入。例如，如果宿主細(xì)胞是大腸桿菌，合適的有機(jī)分子可以是葡萄糖。該途徑利用中心代謝的中間體丙酮酸鹽通過(guò)乳酸脫氫酶產(chǎn)生乳酸鹽。然后通過(guò)乳酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶利用丙酰輔酶A作為輔因子將乳酸鹽轉(zhuǎn)化成乳酰輔酶Α，并釋放丙酸鹽。然后利用乳酰輔酶A脫水酶使乳酰輔酶A脫水，以產(chǎn)生丙烯酰輔酶Α。本發(fā)明的一實(shí)施方案包括來(lái)自大腸桿菌的乳酸脫氫酶LdhA，來(lái)自丙酸梭菌的乳酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶Pct，以及來(lái)自丙酸梭菌的乳酰輔酶A脫水酶酶EI和EII。將該途徑引入大腸桿菌或酵母中用于二烯烴(如丁二烯)生產(chǎn)代表了這些酶的新應(yīng)用。本發(fā)明的一實(shí)施方案是將該途徑用于基于PKS的丙烯酸鹽生產(chǎn)的用途。圖10顯示了通過(guò)本發(fā)明的方法和材料從共有的代謝前體丙二酰輔酶A開(kāi)始產(chǎn)生丙烯酰輔酶A可獲得的酶促途徑。該途徑利用乙酰輔酶A羧化酶，乙酰輔酶A和CO2產(chǎn)生丙二酰輔酶A。然后，通過(guò)丙二酰輔酶A還原酶還原丙二酰輔酶A，并釋放丙二酰半醛。利用底物特異的氧化還原酶將丙二酰半醛轉(zhuǎn)化成3-羥基丙酸鹽。3-羥基丙酸輔酶A連接酶催化3-羥基丙酰輔酶A的形成。然后， 該中間體通過(guò)3-羥基丙酰輔酶A水合酶的可逆反應(yīng)脫水形成丙烯酰輔酶A。在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，這些酶是來(lái)自大腸桿菌的乙酰輔酶A羧化酶復(fù)合物(AccA/AccD)，丙二酰輔酶A還原酶。將該途徑引入大腸桿菌或酵母中用于二烯烴(如丁二烯)生產(chǎn)代表了這些酶的新應(yīng)用，并且是本發(fā)明特有的實(shí)施方案。本發(fā)明的一實(shí)施方案是將該途徑用于基于PKS的丙烯酸鹽生產(chǎn)的用途。圖11顯示了通過(guò)本發(fā)明的方法和材料經(jīng)由甲羥戊酸鹽途徑產(chǎn)生異戊二烯可獲得的酶促途徑。圖12顯示了本發(fā)明提供的用于產(chǎn)生異戊二烯的PKS可獲得的示例性途徑的實(shí)例。(A)顯示了利用修飾成接受丙烯酰輔酶A的DEBS丙酰輔酶A特異性裝載結(jié)構(gòu)域裝載丙烯酰輔酶A，并用丙二酰輔酶A延伸以形成β-酮酯酰ACP結(jié)合的中間體。(B)-(D)部分顯示了利用來(lái)自枯草桿菌(Bacillus subtilis)PKSX(Bacillaene)集簇的PKS酶,用甲基取代β _擬基基團(tuán)所涉及的HMG-輔酶A樣機(jī)制(Butcher, et al.2007.Proc Natl Acad SciUS A.104(5):1506-9;通過(guò)引用并入本文)。本發(fā)明并不受本文所示的任何所提出機(jī)制的限制。在該實(shí)施方案中，倒數(shù)第二個(gè)產(chǎn)物作為游離酸釋放，并隨后根據(jù)本發(fā)明的方法通過(guò)脫羧酶或細(xì)胞外化學(xué)催化/熱解而脫羧基形成異戊二烯。圖13顯示了本發(fā)明提供的用于產(chǎn)生伍)-1，3_戊二烯的？1 。該圖示出了羥基基團(tuán)以水分子脫除，但是酶促機(jī)制利用硫酸鹽作為離去基團(tuán)。圖14顯示了用于產(chǎn)生之前的附圖中所描述的丙烯酰輔酶A和[2S]-甲基丙二酰輔酶A的大腸桿菌中的前體供應(yīng)途徑。所描述的每種酶均可以在宿主細(xì)胞中表達(dá)，其中每種酶可以獨(dú)立地為宿主細(xì)胞內(nèi)源的或天然的，或者被引入重組體。圖15顯示了本發(fā)明所提供的用于最大化大腸桿菌中前體供應(yīng)途徑的方法和材料。最大化丙烯酰輔酶A的途徑可以包括“敲除”(消除或降低其表達(dá))PrpC活性，敲除YgfH活性，外源供給丙酸鹽(或內(nèi)源產(chǎn)生丙酸鹽)，過(guò)表達(dá)PrpE活性以增加丙酰輔酶A胞質(zhì)庫(kù)中的一種或多種。從該中間體，丙酰輔酶A羧化酶復(fù)合物(AccA/PccB)的引入將產(chǎn)生甲基丙二酰輔酶 A (Pfeifer，et al.Science.2001Mar2; 291 (5509):1790-2;通過(guò)引用并入本文)。該丙酰輔酶A庫(kù)還可以用在圖8和9所述的途徑中。

圖16顯示了本發(fā)明所提供的產(chǎn)生3-羥基-1-辛烯的示例性PKS。PKS包含以下元件:(i)來(lái)自PikAl (苦霉素)的裝載模塊和KSl，隨后為(ii)模塊I和KS2:來(lái)自模塊5的AT-ACP區(qū)段和來(lái)自制霉菌素PKS的KS6結(jié)構(gòu)域，(iii)模塊2:來(lái)自蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)ZmaA(雙效菌素PKS)的羥基丙二酸鹽特異性AT和鄰近的ACP結(jié)構(gòu)域，來(lái)自南昌霉素PKS模塊2的DH, ER KR結(jié)構(gòu)域，以及(iv)模塊3 =CurM模塊(curacinPKS)的AT-TE區(qū)段。為了產(chǎn)生前體羥基丙二酰-ACP，酶ZmaD，ZmaG和ZmaE也由宿主菌株產(chǎn)生或提供。該圖示出了羥基基團(tuán)以水分子脫除，然而，應(yīng)當(dāng)注意，酶促機(jī)制利用硫酸鹽作為離去基團(tuán)。圖17顯示了本發(fā)明所提供的產(chǎn)生1-癸烯的示例性PKS。PKS包含以下元件:(i)來(lái)自PikAl的裝載模塊和KSl，隨后為(ii)模塊I和KS2:來(lái)自模塊5的AT - ACP區(qū)段和來(lái)自制霉菌素PKS的KS6結(jié)構(gòu)域，(iii)模塊2和KS3:來(lái)自模塊15的AT-ACP區(qū)段和來(lái)自制霉菌素PKS的KS16結(jié)構(gòu)域，(iv)模塊3和KS4:來(lái)自模塊3的AT - ACP區(qū)段和來(lái)自寡霉素PKS的K4結(jié)構(gòu)域，以及(V)模塊4:來(lái)自CurM的AT - TE區(qū)段。該圖示出了羥基基團(tuán)以水分子脫除，然而，應(yīng)當(dāng)注意，酶促機(jī)制利用硫酸鹽作為離去基團(tuán)。圖18顯示了本發(fā)明所提供的產(chǎn)生1-辛烯的示例性PKS。PKS包含以下元件:(i)來(lái)自PikAl的裝載模塊和KSl，隨后為(ii)模塊I和KS2:來(lái)自模塊5的AT - ACP區(qū)段和來(lái)自制霉菌素PKS的KS6結(jié)構(gòu)域，(iii)模塊2和KS3:來(lái)自模塊15的AT-ACP區(qū)段和來(lái)自制霉菌素PKS的KS16結(jié)構(gòu)域，以及接著(iv)模塊3:來(lái)自CurM模塊的AT - TE區(qū)段。該圖示出了羥基基團(tuán)以水分子脫除，然而，應(yīng)當(dāng)注意，酶促機(jī)制利用硫酸鹽作為離去基團(tuán)。發(fā)明詳述本發(fā)明并不限于所描述的具體實(shí)施方案，由此當(dāng)然可以發(fā)生變化。本文所用的術(shù)語(yǔ)僅僅是為了描述具體實(shí)施方案的目的，而并非意圖限制，因?yàn)楸景l(fā)明的范圍僅受所附權(quán)利要求的限制。如果提供了數(shù)值范圍，除非上下文明確指出并非如此，在該范圍的上限和下限之間的每個(gè)中間值至下限單位的十分之一也被具體公開(kāi)了。所述范圍內(nèi)的任何所述值或中間值之間的每個(gè)更小的范圍以及該所述范圍內(nèi)的任何其它所述值或中間值都包括在本發(fā)明內(nèi)。除非指明并非如此，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常所理解的含義。盡管與本文所描述的相似或等同的任何方法和材料都可以用于實(shí)施本發(fā)明，但在此描述了合適的方法和材料。所引用的所有出版物通過(guò)引用并入本文，以便公開(kāi)和描述其中的方法和/或材料和/或結(jié)果。如本文和所附權(quán)利要求中所用的單數(shù)形式“一 (a) ”、“一 (an) ”和“所述(the) ”包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文明確指出并非如此。因此，例如，就“一種α-烯烴”而言，包括多種這樣的α-烯烴，依此類(lèi)推。術(shù)語(yǔ)“偶數(shù)鏈α-烯烴”指其碳主鏈(與任何官能團(tuán)或取代基無(wú)關(guān))具有偶數(shù)個(gè)碳原子的α-烯烴。術(shù)語(yǔ)“奇數(shù)鏈α-烯烴”指其碳主鏈(與任何官能團(tuán)或取代基無(wú)關(guān))具有奇數(shù)個(gè)碳原子的α-烯烴。術(shù)語(yǔ)“功能變體”描述這樣的酶，該酶所具有的多肽序列與本文所述的酶至少70%，75%，80%, 85%，90%, 95%或99% —致。“功能變體”酶可以保留被認(rèn)為是天然的酶保守的氨基酸殘基和/或可以具有非保守的氨基酸殘基。相對(duì)于天然的酶，氨基酸可以是取代的(不同的)，插入的，或缺失的，但是變體與本文所述的酶相比通常具有相似的酶活性。“功能變體”酶可以是天然存在的或可以是其基因改造的突變體(重組體)。在閱讀完以下更全面描述的本發(fā)明的詳述之后，本發(fā)明的目的、優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將變得更加顯而易見(jiàn)。聚酮合酶(PKS)本發(fā)明提供了能夠合成α-烯烴的重組聚酮合酶(PKS)酶。本發(fā)明的PKS酶不是天然存在的PKS。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，α-烯烴不是由天然存在的PKS合成的化合物。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，PKS是包含來(lái)自?xún)煞N或更多種PKS的模塊、結(jié)構(gòu)域和/或其一部分或者其功能變體的雜合PKS。這樣的α -烯烴包括二酮和三酮，以及多于三個(gè)酮單元的聚酮，諸如4，5或6或更多個(gè)酮單元。α -烯烴除了表征它們的雙鍵外，還可以包括一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)。這類(lèi)官能團(tuán)包括但不限于，乙基、甲基和羥基側(cè)鏈、內(nèi)烯烴以及酮。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，α -烯烴是具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu)的偶數(shù)鏈α _烯烴:
權(quán)利要求
1.非天然存在的聚酮合酶(PKS)或其功能變體，其能夠合成a-烯烴。
2.如權(quán)利要求1所述的PKS，其中所述a-烯烴不是由天然存在的PKS所合成的化合物。
3.如權(quán)利要求1所述的PKS，其中所述PKS是包含來(lái)自?xún)煞N或更多種PKS的模塊，結(jié)構(gòu)域和/或其一部分，或以上的功能變體的雜合PKS。
4.如權(quán)利要求3所述的PKS，其中所述PKS包含末端模塊，所述末端模塊包含巨大鞘絲藻(Lyngbya majuscula) CurM的ST和TE,或以上的功能變體。
5.如權(quán)利要求4所述的PKS，其中所述PKS包含末端模塊，所述末端模塊包含巨大鞘絲藻CurM的KR、ACP、ST和TE，或以上的功能變體。
6.如權(quán)利要求5所述的PKS，其中所述PKS包含末端模塊，所述末端模塊包含巨大鞘絲藻CurM的AT、KR、ACP、ST和TE，或以上的功能變體。
7.如權(quán)利要求3所述的PKS，其中所述PKS包含至少一個(gè)末端模塊，所述末端模塊包含表2-4所述的ST和TE，或以上的功能變體。
8.如權(quán)利要求3所述的PKS，其中所述PKS包含引入丙烯酰輔酶A的裝載模塊。
9.如權(quán)利要求3所述的PKS，其中所述PKS包含的裝載模塊是經(jīng)修飾成接受丙烯酰輔酶A的DEBS丙酰輔酶A特 異性裝載結(jié)構(gòu)域。
10.如權(quán)利要求9所述的PKS，其中所述PKS包含其中的末端碳作為甲基基團(tuán)被引入隨后被氧化的模塊。
11.如權(quán)利要求1所述的PKS，其中所述a-烯烴具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu):
12.如權(quán)利要求11所述的PKS，其中所述α-烯烴是1-己烯、1-癸烯或(E)_l，5_癸二烯。
13.如權(quán)利要求1所述的PKS，其中所述α-烯烴是具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu)的芳香族α-烯烴:
14.如權(quán)利要求1所述的PKS，其中所述α-烯烴具有以下化學(xué)結(jié)構(gòu):
15.重組核酸，其編碼權(quán)利要求1-13所述的聚酮合酶(PKS)。
16.包含重組核酸14的復(fù)制子，其中所述復(fù)制子能夠被穩(wěn)定地維持在宿主細(xì)胞中。
17.如權(quán)利要求16所述的復(fù)制子，其中所述復(fù)制子是質(zhì)?；蜉d體。
18.如權(quán)利要求17所述的復(fù)制子，其中所述載體是表達(dá)載體。
19.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求15所述的重組核酸。
20.宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求16-18所述的復(fù)制子。
21.如權(quán)利要求19或20所述的宿主細(xì)胞，其中培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞時(shí)能產(chǎn)生所述α-烯烴。
22.如權(quán)利要求21所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含產(chǎn)生丁二烯的PKS，并且還包含編碼丙酰輔酶A連接酶(合成酶)(EC6.2.1.17)和酰基輔酶A脫氫酶(哺乳動(dòng)物)(EC1.3.99.3)或以上的功能變體的一種或多種核酸，所述PKS包含含有丙烯酰-ACP起始物的裝載模塊，其中當(dāng)培養(yǎng)并任選地提供丙酸鹽時(shí)，所述PKS能合成丙烯酰輔酶A并產(chǎn)生丁二烯。
23.如權(quán)利要求21所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含能產(chǎn)生丁二烯的PKS，并且還包含編碼乳酸脫氫酶(EC6.2.1.17)，乳酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶(EC2.8.3.1)，丙酰輔酶A連接酶(合成酶)(EC6.2.1.17)和乳酰輔酶A脫水酶(EC4.2.164)或以上的功能變體的一種或多種核酸，所述PKS包含含有丙烯酰-ACP起始物的裝載模塊，其中當(dāng)培養(yǎng)并任選地提供丙酸鹽和葡萄糖時(shí)，所述PKS能合成丙烯酰輔酶A并產(chǎn)生丁二烯。
24.如權(quán)利要求21所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含能產(chǎn)生丁二烯的PKS，并且還包含編碼乙酰輔酶A羧化酶(EC6.4.1.2)，丙二酰輔酶A還原酶(EC1.2.1.-)，3-羥基丙酸輔酶A連接酶和3-羥基丙酰輔酶A水合酶(EC4.2.1.17)或以上的功能變體的一種或多種核酸，所述PKS包含含有丙烯酰-ACP起始物的裝載模塊，其中當(dāng)培養(yǎng)時(shí)，所述PKS能合成丙烯酰輔酶A并產(chǎn)生丁二烯。
25.如權(quán)利要求21所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含能產(chǎn)生丁二烯的PKS，并且還包含編碼丙酰輔酶A連接酶(合成酶)(EC6.2.1.17) ,AccA/PccB基因產(chǎn)物和乳酰輔酶A脫水酶(EC4.2.164)，和乳酸脫氫酶(EC6.2.1.17)，乳酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶(EC2.8.3.1)，丙酰輔酶A連接酶(合成酶)(EC6.2.1.17)以及乳酰輔酶A脫水酶(EC4.2.164)或?；o酶A脫氫酶或以上的功能變體的一種或多種核酸，所述PKS包含含有丙烯酰-ACP起始物的裝載模塊，其中當(dāng)培養(yǎng)并任選地提供丙酸鹽時(shí)，所述PKS能合成丙烯酰輔酶A并產(chǎn)生丁二烯。
26.產(chǎn)生α-烯烴的方法，其包括產(chǎn)生權(quán)利要求21-25中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞，并在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞使其產(chǎn)生α-烯烴。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其還包括將所述分離的α-烯烴分離。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其還包括使所述α-烯烴聚合以產(chǎn)生聚合物。
29.如權(quán)利要求26-28中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述α-烯烴是聚烯烴。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述聚烯烴是丁二烯、異戊二烯或(E)-1，5-癸二烯。
31.組合物，其包含從權(quán)利要求21-25中任一項(xiàng)所述的宿主細(xì)胞分離的α-烯烴，以及所述宿主細(xì)胞的痕量殘留物和/或污染物。
32.如權(quán)利要求31所述的組合物，其中所述α-烯烴是聚烯烴。
33.如權(quán)利要求32所述的組合物，其中所述聚烯烴是丁二烯、異戊二烯或(E)-1，5-癸二烯。
全文摘要
本發(fā)明提供了能合成α-烯烴如1-己烯或丁二烯的聚酮合酶(PKS)。本發(fā)明還提供了包含PKS且在培養(yǎng)時(shí)能夠產(chǎn)生α-烯烴的宿主細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12P5/02GK103249837SQ201180054807
公開(kāi)日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2011年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月28日
發(fā)明者杰弗里·L·福特曼, 倫納德·卡茲, 艾里克·J·斯蒂恩, 杰伊·D·基斯靈 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)