專利名稱：無網(wǎng)格bac文庫的建立方法及該無網(wǎng)格bac文庫陽性克隆的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種簡便基因文庫的建立與篩選。
背景技術(shù)：
BAC(細(xì)菌人造染色體)克隆對于整個分子生物學(xué)的發(fā)展，特別是現(xiàn)代基因組學(xué)的發(fā)展作出了巨大的貢獻(xiàn)。雖然，現(xiàn)在高通量測序技術(shù)降低了 BAC文庫的利用率，但是BAC克隆對于基因克隆及基因資源的保存有著重要的作用。制取BAC克隆，一般放入96孔板或 384孔聚乙烯樣品板中，但是所要的超低溫(_80°C )儲藏空間巨大；而且，利用BAC克隆篩選還要制作有關(guān)的三維篩選體系或轉(zhuǎn)移至纖維素或尼龍雜交膜中，需一系列的篩選過程來獲得陽性克隆。無網(wǎng)格(混合克隆品)基因文庫已經(jīng)展現(xiàn)出所需勞動力少，貯存所需的空間小，但從陽性克隆混合體中獲取其所需個體較為復(fù)雜。雖然已有人進(jìn)行過BAC文庫的篩選，但是程序復(fù)雜，且操作規(guī)程不明確。目前的常規(guī)方法是將混合樣品涂布平板后，待菌落生長后，轉(zhuǎn)移到纖維素膜上，進(jìn)行有關(guān)雜交，來鑒定相應(yīng)的陽性克隆。由于DNA雜交技術(shù)程序復(fù)雜，花費(fèi)時長，還存在假陽性等問題，特別是難以獲得單個陽性克隆。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的是為了解決現(xiàn)有無網(wǎng)格BAC文庫陽性克隆技術(shù)中DNA雜交技術(shù)程序復(fù)雜，花費(fèi)時長，存在假陽性，而且難以獲得單個陽性克隆的問題，而提供的一種無網(wǎng)格BAC 文庫的建立方法及該無網(wǎng)格BAC文庫陽性克隆的篩選方法。本發(fā)明無網(wǎng)格BAC文庫按以下步驟建立一、BAC克隆載體的制備；二、大片段DNA的制備；三、連接及轉(zhuǎn)化，然后選擇含BAC克隆1000 3000個的培養(yǎng)皿，用LB液體培養(yǎng)基或SOB液體培養(yǎng)基進(jìn)行洗脫，均制成BAC克隆的懸浮液，混合均勻后都等分為2管，一組管為DNA提取篩選管，另一組管為無網(wǎng)格BAC文庫管，即實現(xiàn)無網(wǎng)格BAC文庫的建立。按以下步驟篩選上述無網(wǎng)格BAC文庫以獲取陽性克隆一、用待篩選序列的特異性引物對BAC文庫中的DNA提取篩選管進(jìn)行PCR，取陽性 pool所對應(yīng)的無網(wǎng)格BAC文庫管，并吸取200 μ L菌液，進(jìn)行梯度稀釋；二、將步驟一制備的梯度稀釋液振蕩培養(yǎng)；三、將步驟二振蕩培養(yǎng)的菌液取出一部分進(jìn)行離心，棄去上清液后用沉淀的菌體離心進(jìn)行PCR，選取滴度最大的菌液進(jìn)行涂板，然后，一次用牙簽鈍端挑取8 15個克隆放入96孔板或384孔板中振蕩培養(yǎng)，取少量振蕩培養(yǎng)物再次進(jìn)行PCR反應(yīng)，將陽性克隆pool 進(jìn)行再次涂板，選取單個克隆進(jìn)行驗證，即可獲得單個陽性克隆。本發(fā)明無網(wǎng)格BAC文庫的建立方法簡單易行，具有用時短，所需超低溫儲藏空間小的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明無網(wǎng)格BAC文庫陽性克隆的篩選方法巧妙地利用PCR體系，快速簡易地獲得陽性克隆，并且有效的排除了假陽性克隆的干擾。


圖1是具體實施方式
六步驟四中PCR的部分凝膠電泳圖，其中第1泳道和第18泳道標(biāo)樣為DNA對照樣品，其余泳道標(biāo)樣為DNA提取篩選管樣品。圖2是具體實施方式
六步驟六中單個陽性克隆驗證結(jié)果圖。
具體實施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式無網(wǎng)格BAC文庫按以下步驟建立一、BAC克隆載體的制備；二、大片段DNA的制備；三、連接及轉(zhuǎn)化，然后選擇含BAC克隆1000 3000個的培養(yǎng)皿，用LB液體培養(yǎng)基或SOB液體培養(yǎng)基進(jìn)行洗脫，均制成BAC克隆的懸浮液，混合均勻后都等分為2管，一組管為DNA提取篩選管，另一組管為無網(wǎng)格BAC文庫管，即實現(xiàn)無網(wǎng)格BAC文庫的建立。本實施方式BAC克隆的懸浮液中的LB液體培養(yǎng)基或SOB液體培養(yǎng)基(含10%的甘油)可作為冷凍用媒介，將BAC克隆的懸浮液置于_80°C環(huán)境中儲藏。BAC克隆載體的制備及大片段DNA的制備采用現(xiàn)有常規(guī)方法。本實施方式含有陽性克隆1000 3000個的培養(yǎng)皿數(shù)量為50 100皿。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一的不同點(diǎn)是步驟二中大片段 DNA片段的平均長度> 70Kb。其它步驟及參數(shù)與實施方式一相同。
具體實施方式
三本實施方式按以下步驟篩選無網(wǎng)格BAC文庫以獲取陽性克隆一、用待篩選序列的特異性引物對BAC文庫中的DNA提取篩選管進(jìn)行PCR，取陽性 pool所對應(yīng)的無網(wǎng)格BAC文庫管，并吸取200 μ L菌液，進(jìn)行梯度稀釋；二、將步驟一制備的梯度稀釋液振蕩培養(yǎng)；三、將步驟二振蕩培養(yǎng)的菌液取出一部分進(jìn)行離心，棄去上清液后用沉淀的菌體離心進(jìn)行PCR，選取滴度最大的菌液進(jìn)行涂板，然后，一次用牙簽鈍端挑取8 15個克隆放入96孔板或384孔板中振蕩培養(yǎng)，取少量振蕩培養(yǎng)物再次進(jìn)行PCR反應(yīng)，將陽性克隆pool 進(jìn)行再次涂板，選取單個克隆進(jìn)行驗證，即可獲得單個陽性克隆。本實施方式步驟三有效的提高了陽性克隆占總克隆的比率，從理論角度分析將陽性克隆占總克隆的比率提升至最高。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
三的不同點(diǎn)是步驟二中振蕩培養(yǎng)時間為10 12小時。其它步驟及參數(shù)與實施方式三相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
三或四的不同點(diǎn)是步驟二中置于轉(zhuǎn)速為200r/min、溫度為37度環(huán)境中振蕩培養(yǎng)。其它步驟及參數(shù)與實施方式三或四相同。
具體實施方式
六本實施方式用來篩選無網(wǎng)格大豆基因組BAC基因文庫以獲得陽性克隆一、BAC克隆載體的制備；二、大片段DNA的制備，片段DNA片段的長度為75Kb ；三、連接及轉(zhuǎn)化，然后選擇含BAC克隆2000 3000個的培養(yǎng)皿(其中白色的陽性克隆占總克隆的95%以上)，用5mL LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行洗脫，均制成BAC克隆的懸浮液，混合均勻后都等分為2管，一組管為DNA提取篩選管，另一組管為無網(wǎng)格BAC文庫管；四、用待篩選序列的特異性引物 Sat_312 (GCGCCTCCCATTACTTCGGATTAGTTA/ GCGAACGCAACAAATAATCAAACATC)對大豆BAC文庫中的DNA提取篩選管進(jìn)行PCR，取陽性 pool (圖1中的第3、9、10、15、16和17泳道為陽性pool)所對應(yīng)的無網(wǎng)格BAC文庫管(本實施方式選取第9泳道所對應(yīng)的無網(wǎng)格BAC文庫管)，并吸取200 μ L菌液，進(jìn)行梯度稀釋；五、將步驟四制備的梯度稀釋液振蕩培養(yǎng)；六、將步驟五振蕩培養(yǎng)的菌液取出一部分進(jìn)行離心，棄去上清液后用沉淀的菌體進(jìn)行PCR，選取滴度最大的原始菌液進(jìn)行涂板，然后，一次用牙簽鈍端挑取約10個左右克隆放入96孔板中振蕩培養(yǎng)，取少量振蕩培養(yǎng)物再次進(jìn)行PCR反應(yīng)，將陽性克隆pool進(jìn)行再次涂板，選取單個克隆進(jìn)行驗證，即可獲得單個陽性克隆。本實施方式所獲得的單個陽性克隆如圖2中箭頭所示。
權(quán)利要求
1.無網(wǎng)格BAC文庫的建立方法，其特征在于無網(wǎng)格BAC文庫按以下步驟建立一、BAC克隆載體的制備；二、大片段DNA的制備；三、連接及轉(zhuǎn)化，然后選擇含BAC克隆1000 3000個的培養(yǎng)皿，用LB液體培養(yǎng)基或 SOB液體培養(yǎng)基進(jìn)行洗脫，均制成BAC克隆的懸浮液，混合均勻后都等分為2管，一組管為 DNA提取篩選管，另一組管為無網(wǎng)格BAC文庫管，即實現(xiàn)無網(wǎng)格BAC文庫的建立。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無網(wǎng)格BAC文庫的建立方法，其特征在于步驟二中大片段 DNA片段的平均長度彡70Kb。
3.如權(quán)利要求1所述無網(wǎng)格BAC文庫陽性克隆的篩選方法，其特征在于按以下步驟篩選無網(wǎng)格BAC文庫以獲取陽性克隆一、用待篩選序列的特異性引物對BAC文庫中的DNA提取篩選管進(jìn)行PCR，取陽性pool 所對應(yīng)的無網(wǎng)格BAC文庫管，并吸取200 μ L菌液，進(jìn)行梯度稀釋；二、將步驟一制備的梯度稀釋液振蕩培養(yǎng)；三、將步驟二振蕩培養(yǎng)的菌液取出一部分進(jìn)行離心，棄去上清液后用沉淀的菌體離心進(jìn)行PCR，選取滴度最大的菌液進(jìn)行涂板，然后，一次用牙簽鈍端挑取8 15個克隆放入96 孔板或384孔板中振蕩培養(yǎng)，取少量振蕩培養(yǎng)物再次進(jìn)行PCR反應(yīng)，將陽性克隆pool進(jìn)行再次涂板，選取單個克隆進(jìn)行驗證，即可獲得單個陽性克隆。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的無網(wǎng)格BAC文庫陽性克隆的篩選方法，其特征在于步驟二中振蕩培養(yǎng)時間為10 12小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的無網(wǎng)格BAC文庫陽性克隆的篩選方法，其特征在于步驟二中置于轉(zhuǎn)速為200r/min、溫度為37度環(huán)境中振蕩培養(yǎng)。
全文摘要
無網(wǎng)格BAC文庫的建立方法及該無網(wǎng)格BAC文庫陽性克隆的篩選方法，它涉及一種簡便基因文庫的建立與篩選。它解決現(xiàn)有無網(wǎng)格BAC文庫陽性克隆技術(shù)中DNA雜交技術(shù)程序復(fù)雜，花費(fèi)時長，存在假陽性，而且難以獲得單個陽性克隆的問題。文庫建立一、BAC克隆載體的制備；二、大片段DNA的制備；三、連接及轉(zhuǎn)化。陽性克隆篩選一、PCR取陽性pool進(jìn)行梯度稀釋；二、振蕩培養(yǎng)；三、用菌體離心PCR，選取滴度最大的菌液進(jìn)行涂板，然后挑取8～15個克隆振蕩培養(yǎng)，進(jìn)行PCR反應(yīng)，將陽性克隆pool進(jìn)行再次涂板，選取單個克隆進(jìn)行驗證，即可獲得單個陽性克隆。本發(fā)明用于BAC文庫的建立和陽性克隆的篩選。
文檔編號C12N15/10GK102560689SQ20111045995
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者吳紅艷, 夏正俊, 翟紅 申請人:中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所