專(zhuān)利名稱(chēng)：一種芒屬植物Genic-SSR標(biāo)記的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種芒屬植物GeniC-SSR標(biāo)記的制備方法，同時(shí)還涉及一種芒屬植物Genic-SSR標(biāo)記的用途。
背景技術(shù)：
芒屬植物屬于禾本科C4多年生草本植物，主要包括芒、五節(jié)芒、荻、南荻、奇崗，集中分布在亞洲東部及東南部。芒屬植物具有生命力強(qiáng)、光合利用效率高、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)， 可用于制藥、造紙、水土保持和生態(tài)修復(fù)等。隨著人類(lèi)對(duì)能源需求的不斷提高，全球能源儲(chǔ)量的不斷減少，芒屬植物作為一種潛在的能源植物越來(lái)越受到人們的高度關(guān)注。目前，在歐美實(shí)現(xiàn)廣泛種植的奇崗，年產(chǎn)可達(dá)每年10 40噸/公頃，被用于火力發(fā)電和燃料乙醇生產(chǎn)。隨著芒屬植物的遺傳多樣性研究、遺傳選育改良及遺傳圖譜繪制等工作的不斷深入，對(duì)芒屬植物分子標(biāo)記的需求也越來(lái)越大。通過(guò)遺傳改良或重要基因的挖掘可有效提高芒屬能源植物的產(chǎn)量、抗逆性、廣適性。因此，挖掘芒屬植物的分子遺傳標(biāo)記，對(duì)芒屬植物研究意義重大。簡(jiǎn)單序列重復(fù)(simple sequence repeat, SSR)是一類(lèi)l_6bp核苷酸基序構(gòu)成的重復(fù)序列，廣泛分布于真核生物基因組的編碼區(qū)、非編碼區(qū)，SSR標(biāo)記利用簡(jiǎn)單序列重復(fù)的側(cè)翼保守序列設(shè)計(jì)引物，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增，根據(jù)條帶的大小來(lái)反映DNA序列的多態(tài)性。與其它分子標(biāo)記如RFLP、AFLP, ISSR等相比，SSR標(biāo)記具有多態(tài)性高、共顯性遺傳、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，近年來(lái)成為遺傳多樣性研究、遺傳作圖、重要功能基因定位、分子輔助育種等領(lǐng)域應(yīng)用最多的一種標(biāo)記。傳統(tǒng)SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)，一般使用文庫(kù)篩選法、磁珠富集法以及利用NCBI中已有EST數(shù)據(jù)庫(kù)信息挖掘等。其中，前兩種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力、開(kāi)發(fā)成本高，第三種方法又依賴(lài)于現(xiàn)有NCBI中EST數(shù)據(jù)，對(duì)于EST測(cè)序少的物種其應(yīng)用很有限。截止到2011年11月21日，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中可以檢索到的芒屬植物EST序列僅有5條，難以滿(mǎn)足開(kāi)發(fā)EST-SSR標(biāo)記的需要；而現(xiàn)有研究中，芒屬植物分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)只局限在利用磁珠法或建立文庫(kù)挖掘，無(wú)法滿(mǎn)足現(xiàn)今芒屬植物研究需求，因此，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得大量EST序列信息，利用生物信息學(xué)挖掘SSR標(biāo)記成為了一種高效的技術(shù)手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種芒屬植物Genic-SSR標(biāo)記的制備方法，方法易行，操作簡(jiǎn)便，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得EST序列，挖掘SSR位點(diǎn)信息、設(shè)計(jì)引物，構(gòu)建芒屬植物特異性Genic-SSR標(biāo)記體系，為重要能源植物芒草的遺傳學(xué)研究及分子改良等奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種芒屬植物Genic-SSR標(biāo)記在芒屬植物遺傳多樣性研究中的應(yīng)用，由于Genic-SSR標(biāo)記的數(shù)量多且穩(wěn)定性好，分析結(jié)果準(zhǔn)確可靠。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種芒屬植物Genic-SSR標(biāo)記的制備方法，其步驟是1)、芒屬植物轉(zhuǎn)錄組序列的獲得
選取芒屬植物五個(gè)種(芒、五節(jié)芒、荻、南荻、奇崗)的幼嫩葉片，分別提取總RNA， 采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法(Illumina Solexa HiSeq2000)，得到轉(zhuǎn)錄組Reads，去除載體等RNA 序列污染，利用拼接軟件(如S0AP、iASSembler等)完成序列拼接，最終獲得芒屬植物五個(gè)種的非冗余Unigene-EST序列。所述的芒屬植物為芒、五節(jié)芒、荻、南荻、奇崗其中的任意一種。2)、芒屬植物ESR序列中SSR位點(diǎn)的鑒定采用SSR檢索軟件(如可選擇SSR hunter,BatchPrimer3. 0、MISA等)對(duì)上述步驟(1)得到的非冗余Unigene-EST序列進(jìn)行SSR位點(diǎn)查找。檢索的限定條件為重復(fù)基序?yàn)?-6個(gè)堿基，且重復(fù)單元數(shù)依次大于6次，5次，4次，4次，3次；對(duì)于中間被< 50bp的間隔堿基打斷的復(fù)合型SSR計(jì)為一個(gè)SSR位點(diǎn)，從而獲得一系列含有SSR位點(diǎn)信息的Unigene 序列(請(qǐng)見(jiàn)表1)。表1測(cè)序產(chǎn)生的Unigene-EST統(tǒng)計(jì)信息
權(quán)利要求
1. 一種芒屬植物Genic-SSR標(biāo)記的制備方法，其步驟是1)、芒屬植物轉(zhuǎn)錄組序列的獲得選取芒屬植物的幼嫩葉片，分別提取總RNA，采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法，得到轉(zhuǎn)錄組Reads， 去除載體RNA序列污染，利用拼接軟件完成序列拼接，最終獲得芒屬植物五個(gè)種的非冗余 Unigene-EST 序列；2)、芒屬植物ESR序列中SSR位點(diǎn)的鑒定采用SSR檢索軟件對(duì)上述步驟(1)得到的非冗余Unigene-EST序列進(jìn)行SSR位點(diǎn)查找， 檢索的限定條件為重復(fù)基序?yàn)?-6個(gè)堿基，且重復(fù)單元數(shù)依次大于6次，5次，4次，4次，3 次；對(duì)于中間被< 50bp的間隔堿基打斷的復(fù)合型SSR計(jì)為一個(gè)SSR位點(diǎn)，獲得一系列含有 SSR位點(diǎn)信息的Unigene序列；3)、芒屬植物Genic-SSR引物的設(shè)計(jì)依據(jù)上述步驟( 得到的含有SSR位點(diǎn)的Unigene序列，采用引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，獲得一系列Genic-SSR引物，引物設(shè)計(jì)參數(shù)主要包括引物長(zhǎng)度為18_2^p，退火溫度為50-65°C，GC含量為45-65%，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為90_300bp ；4)、芒屬植物Genic-SSR引物的擴(kuò)增與篩選選取用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的五個(gè)材料，用于檢測(cè)芒屬植物Genic-SSR標(biāo)記的擴(kuò)增狀況以及可轉(zhuǎn)移性。選取五個(gè)材料的幼葉50-100mg置于2. Omi離心管中，液氮冷卻后，用研磨棒迅速將樣品碾磨成粉末狀，基因組提取利用TIANGEN植物基因組DNA提取試劑盒，利用質(zhì)量體積比的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DNA的質(zhì)量。采用上述步驟(3)合成的引物，以五個(gè)材料的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，以檢測(cè)引物設(shè)計(jì)的可靠性、擴(kuò)增模式及其通用性。根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果，篩選可有效擴(kuò)增的芒屬Genic-SSR引物。依據(jù)擴(kuò)增結(jié)果，篩選出可以穩(wěn)定擴(kuò)增的Genic-SSR引物60對(duì)，具體如下 ms-It—1FCACCAGTGTTGGATGCTGAC RTGTTGTCTAGCCTCCCGTCT ms-It-2F:ACACTGTCCCAAATCCTTCC R:AAGAAATCTCACTCCTCTCCCC ms-It—3FCTCACAGGACAAGAGAGGGG R:GCATTCCAAAAGCATCCAGT ms-It—4FTGGAGCTGTGATCCTCTTCC RCGGCTCAAAAACCACAAAAT ms-It—5F:TCCAATCTAACCTCGTTGCC RTGAGGTCTCGAACTGCAAAA ms-It—6F:CACCGTCGAGTAGGGTGGR:CTGACGAGGGCACCAGAC ms-It-8F:ACCGGGGTCAGGAAGTAGAA RTGTTCGTCTACAACGCCACT ms-It—9F:CCAGCTTCTCCCACACCC R:CACCGAAGAGCCCCTCTC ms-It-10F :CTTGCAGTGCCTCCGTATG RCCTCATCGTCGACTTCAACA ms-It-12F:AGTGATGGAACTGCTGGAGG R CTTTGAGCGTCGATCCATTT ms-It-13F TGATGGTGTTGGTGATTTGG R :ATTTGCTGTTGCTGCTGTTG ms-It-18FTGGCTCCCACTATCACTTCC RCTTGCTGCAACAGATGGAAA ms-It-19F:CATGGACTCGGATCAGGACT RCGAGGAGGAACTTGGTGGAT ms-It-20F:GCAGGTTGCGATCCTAAGAC R:GATCACCTGAAAAGGCAAGC ms-It-21FCCAAGCTCTAAACAGGCTCG R:GATGGGAGTTTACGTGGGG ms-It-23FCAACCTCCTCTCCCTGATGA R:AGACGGAGATGAATCGTTGG ms-It-24F CATGGTTGAGTTCTACGCCC R:AGAAGAGGATGGTGGGGAAG ms-It-26F:GGTCCATGACGAAGTCGAAG RCCCGGAGTTCTACTGCTACG ms-It-27F :AAACATGCGTGCTTTGACTGR TTGCCTCTTTCGTGCTACCT ms-It-28F:ACCACCAAAACCAAACGAAG RTAGAGGGGAAGAAGGGGAAG ms-It-29F:GGTCTAATCGCCCCGTAGAT RCCCTTTACTCCCGAGGAGAC mf-ts-1F CAGATGAGACCAGCAGTGGA R :ACGCCAGTCAACCATCTCTT mf-ts-2F:ACAGGGAGAGGGGAGAAGAA RTCCATCGTTTTCTGGTGTGA mf-ts-4F:GTGCTCTTCCGCCTGAACTA R TCCTCCTCCTCACCATCATC mf-ts-5FCAAATGGTCGTCCCAAAGAC R:AGAGGAAGAATGGGTGGGAG mf-ts-6F:ATGGCTACCACTCAGTTCGC R :GTCGTCGTCCTCTTCAAGG mf-ts-9F:ACCGTCCATCCATCTGTAGC R:GCTTCCTGGACGACTCTGTT mf-ts-10F CTCGAGCGAGCTGTTCATTT RTGAAGATACCGTGGAGGAGG mf-ts-11F CTTGTCCCTCTTCACCAAGC RCCTTTCTTCCAGTGGCTCAA mf-ts-13FCCAGAGGGATAGGAGGAGGA RCACGTGTAGCAGGTCCTGAA mf-ts-14F:GCTCTCCGAGGTCGTGTC R CCTGTCTGAGGATGGTCCC mf-ts-15F:ACGTCCTTCTTTCTGCTGGARCGTCTCTGCTCCTGGCTTTA mf-ts-16F :GGAACGGGGAAACCTCTG RTCTCTTCTCTTCTCCGTCGC mf-ts-17F:AAAGGGTACGGCACTGAGGT R :GCAACGTGAACTCTGTCTGC mf-ts-18F:GAGGGGATCTAGATGAGGGC R:CCAGCTCGTTTCTTCCTCAG mf-ts-19FCGTCTGCGACACAAGAACAT R :ATGATGTTGCTGGCCTTGAT mf-ts-21F:GGACACCTACACGGTCACCT R:CTGCTGGCTGGTGGTGTT mf-ts-22F CATGGTTGAGTTCTACGCCC R:AGAAGAGGATGGTGGGGAAG mf-ts-23FCGCACAAAAGAATGCATCAC R:GGAACGCCACTTTCTAGCAC mf-ts-24F :ACCAGCACCGTCATCATCAG R :GAACAGGTTGCCGGTGTATC mf-ts-25FCTACGACCGCTGCTGCTAGT RTCTCCATACTGCTCTGGGCT mf-ts-28FTTCCGATCTCAAGGACCAAC R :AACCCTCCTGTCCATGATGA mf-ts-29FCTGCAAGTTTCTTTGCCCTC RTCTGAAAAGTGGTGGTGTGC mg-1F:ATCAGAGAGAGGCACCTGGA R:GAGTGAGGAGATGACCCGAC mg-2F:AGAAACGTGAAACCTGCTGAAR:AAGCTGACAGCACAACAACG mg-5F:GGCGGATAATCAGCAAGTGT R:GAAGAGTGGCTGGGTTGAAG mg-6F:GGAGAGTGAGAGCAGGGTTG R :GTTGCCACAAATCTGGCTG mg-7F:ACCAAGACCAAATCTGCCAC R :ACACAGCTACATCGGGTTCC mg-8F:AACTCTTTTACAACGTCAATTTGC RCAGCCTTTGGTTAGAGCACC mg-17F:AATAGGAGGCTGGCTGGTTT R:GCAATTTGCTCCTGCACATA mg-18F :GCAGCAGAGAGGAGAGGAGA R CCCGTCGTGTTGATGTACTG mg-19F :TCTCCTCCAGGTTCACCATC R:AGGTGCAAATCATCTACCGC mg-21F:ACAGGAACGGAGGAACTTGA R:GATACGCCGTCGCTGAAG mg-22F:GATCGCTCCTTCCATTGTGT R:AATCTCAAGTCCTCCTCCCC mg-23F TGAGATTCCTCCCTCCATTG R:GCGCTCTACTCCAGGAAAAA mg-25F:GCCCCTCAGATGGTTGAATA RTGTGGTACATCTCCCTGCAA mg-26F :GTCACTCTCCCCTCCCATTC RTGCACCCTTTACGAACTCCT mg-27FCCATGGCTAAGCCTCACTTCR:GCGCACACACACACACTACT mg-29F :AGCGTAAGAGGGAGGATGGT R :GGAGCTCCTCCTCGGTGT mg-30FTTGACGGTGACGATGAGGTA RTCAAATCTCATCAGTTCCCAAA所述的芒屬植物為芒、五節(jié)芒、荻、南荻、奇崗其中的任意一種。
2.權(quán)利要求1所述的一種芒屬植物Genic-SSR標(biāo)記在芒屬植物遺傳多樣性分析中的應(yīng)用；所述的芒屬植物為芒、五節(jié)芒、荻、南荻、奇崗、河八王。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種芒屬植物Genic-SSR標(biāo)記的制備方法及應(yīng)用，其步驟是A、芒屬植物轉(zhuǎn)錄組序列的獲得選取芒屬植物的幼嫩葉片，分別提取總RNA，得到轉(zhuǎn)錄組Reads，去除載體RNA序列污染，拼接，獲得芒屬植物轉(zhuǎn)錄組序列；B、芒屬植物ESR序列中SSR位點(diǎn)的鑒定采用SSR檢索軟件對(duì)得到的非冗余Unigene-EST序列進(jìn)行SSR位點(diǎn)查找，重復(fù)基序?yàn)?-6個(gè)堿基，獲得一系列含有SSR位點(diǎn)信息的Unigene序列；C、芒屬植物Genic-SSR引物的設(shè)計(jì)依據(jù)得到的含有SSR位點(diǎn)的Unigene序列，采用引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，獲得一系列Genic-SSR引物。方法簡(jiǎn)單，效率高，操作簡(jiǎn)便，獲得的標(biāo)記數(shù)量巨大，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得EST序列，為重要能源植物芒草的遺傳學(xué)研究及分子改良等奠定基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102424826SQ20111044396
公開(kāi)日2012年4月25日 申請(qǐng)日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月23日
發(fā)明者余作平, 刁英, 游永寧, 胡中立, 胡小虎, 鄭興飛 申請(qǐng)人:湖北光芒能源植物有限公司