專利名稱：基因多態(tài)檢測方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，應(yīng)用于生物科學(xué)研究和臨床分子診斷，具體涉及一種基因多態(tài)檢測方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
基因多態(tài)性是指基因的堿基序列變化，比如一個堿基的插入、缺少或替換，一段 DNA片段的插入、缺少、顛倒、重復(fù)等。單核苷酸多態(tài)性SNP是現(xiàn)在公認的第三代遺傳標(biāo)記， HAPMAP等生物信息數(shù)據(jù)庫顯示和預(yù)測人類基因組序列中每300個堿基序列中有一個SNP， 單個核苷酸的變化如插入、缺失或替換可能會改變目標(biāo)基因的正常功能從而導(dǎo)致相關(guān)疾病發(fā)生或相關(guān)表型的變化，因此基因多態(tài)性尤其是SNP的快速而準確的檢測將有助于相關(guān)疾病的臨床分子診斷或相關(guān)基因的科學(xué)研究。從檢測基因位點數(shù)目上，基因位點的具體檢測方法可以分為三大類，一是全基因組水平上的高密度SNP高通量檢測，二是對目標(biāo)區(qū)域多個基因的SNP進行中通量的檢測。第三類是少量或者單個基因的少量SNP位點的低通量檢測。前者包括SNPkan、全基因組SNP 芯片雜交等技術(shù)對成千上萬甚至幾百萬個SNP位點進行檢測(Sun M et al. ,2009 ；HUGO Pan-Asian SNP Consortium et al. ,2009 Jian-ffen Han et al.，2009)，這些技術(shù)主要研究基因組的代謝通路及基因家族相關(guān)的SNP全掃，用于發(fā)現(xiàn)有意義的新功能基因位點，但普遍存在檢測周期長以及檢測成本昂貴等缺點；中通量的SNP檢測主要針對有限目標(biāo)區(qū)段多個基因中幾十個甚至幾百個SNP的檢測，包括微小測序技術(shù)、高溫連接酶檢測技術(shù)(LDR) (zhao zhang, et al，2009)、多重連接依賴探針擴增(MLPA) (Schouten et al.，2002)以及 MassArray SNP檢測技術(shù)(kquenom Inc. , San Diego, CA)；低通量的SNP檢測主要是針對感興趣的幾個目的基因的少量幾個關(guān)鍵的SNP進行檢測，包括直接測序SNP分型技術(shù)、 taqMan探針、限制性內(nèi)切酶反應(yīng)(RFLP)、高分辨率融解曲線反應(yīng)(HRM)。但是，現(xiàn)有的低通量SNP分型技術(shù)都有其局限性，比如直接測序SNP分型技術(shù)，準確性高，如果檢測的幾個SNP位點正好在一個測序單元內(nèi)(長度小于600bp)，則檢測方案相對可行，如果檢測位點位置相差較遠則其檢測成本太高。TaqMan技術(shù)主要是基于特異性熒光探針，目的基因的檢測序列與探針完全配對，則探針上的熒光基團淬滅發(fā)出相應(yīng)的熒光信號，根據(jù)收集到的不同熒光信號確定基因的SNP類型，其每次實驗只能檢測一個基因位點，而且熒光信號成本昂貴。RFLP是基于將目的基因位點的特異性序列，采用限制性內(nèi)切酶酶切，酶切產(chǎn)物跑瓊脂糖膠電泳來區(qū)分不同長度片段，從而確定基因位點的單倍型。此方法每次實驗也只能檢測少量幾個位點，而且跑瓊脂糖膠電泳很難區(qū)分長度相近的酶切片段，并且電泳出來的膠圖不精確，更重要的是有時候限制性內(nèi)切酶的酶切效果不佳，難以區(qū)分酶能切動的純合子和雜合子兩種單倍型。高分辨率融解曲線反應(yīng)(HRM)基于DNA不同堿基序列其融解溫度不同，經(jīng)過每0. 1 °C的升高，不同堿基序列的DNA雙鏈在不同的溫度下解鏈，在每個DNA擴增產(chǎn)物中嵌入熒光信號，收集解鏈時釋放的熒光信號來確定基因的單倍型。HRM的缺點也在于每次反應(yīng)只能檢測一個樣本的一個基因位點，而且通過融解曲線來判定基因型的準確度隨溫度梯度的分辨高低差異比較大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決目前SNP分型方法精確度差、效率低、成本貴的技術(shù)問題，提供一種基因多態(tài)檢測方法，該方法可以在一個反應(yīng)體系中快速、準確地同時檢測多個樣本的多個目標(biāo)基因的遺傳多態(tài)性。此外，還需要提供一種基因多態(tài)檢測試劑盒。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)在本發(fā)明的一個方面，提供了一種基因多態(tài)檢測方法，包括以下步驟針對一個或多個目標(biāo)基因設(shè)計多重PCR引物，每個目標(biāo)基因包含限制性內(nèi)切酶序列，每對引物中的一條具有信號標(biāo)記；針對每個目標(biāo)基因包含的限制性內(nèi)切酶序列，設(shè)計內(nèi)對照DNA片段，該內(nèi)對照DNA 片段包含所述目標(biāo)基因的限制性內(nèi)切酶序列；用所述PCR引物對待測樣本進行多重PCR擴增；將待測樣本的PCR擴增產(chǎn)物和內(nèi)對照DNA片段混勻，用所述限制性內(nèi)切酶序列對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進行酶切；酶切產(chǎn)物經(jīng)變性后，通過毛細管電泳將不同長度的片段分開，收集每個條帶的位置信息以及信號強度；計算樣本每個目標(biāo)基因片段酶切前后的峰高或面積比、以及內(nèi)對照DNA片段的酶切前后的峰高或面積比，將每個目標(biāo)基因片段酶切前后的峰高或面積比值分別參照內(nèi)對照 DNA片段酶切前后的峰高或面積比值，獲得待測樣本目標(biāo)基因片段的遺傳多態(tài)性。所述多重PCR引物中，各信號標(biāo)記引物具有相同或不同的信號標(biāo)記；相同信號標(biāo)記的引物對應(yīng)的擴增產(chǎn)物長度有至少Ibp的差別。所述信號標(biāo)記包括熒光標(biāo)記。所述內(nèi)對照DNA片段通過化學(xué)合成或PCR擴增制得。在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種基因多態(tài)檢測試劑盒，主要包括有(A)針對一個或多個目標(biāo)基因設(shè)計的多重PCR引物，每個目標(biāo)基因包含限制性內(nèi)切酶序列，每對引物中的一條具有信號標(biāo)記；(B)針對每個目標(biāo)基因包含的限制性內(nèi)切酶序列設(shè)計的內(nèi)對照DNA片段，該內(nèi)對照DNA片段包含所述目標(biāo)基因的限制性內(nèi)切酶序列； (C)所述限制性內(nèi)切酶序列對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶。本發(fā)明是在認真總結(jié)現(xiàn)有各種低通量SNP檢測技術(shù)的優(yōu)缺點的基礎(chǔ)上再經(jīng)過自主創(chuàng)新后開發(fā)成功，它綜合了多重PCR、毛細管電泳精確分析DNA片段特征、混合不同樣本相同基因位點PCR擴增不同長度片段一起酶切，以及引入限制性內(nèi)切酶特異序列的內(nèi)對照 DNA片段來精確判斷限制性內(nèi)切酶的酶切效果，是一種簡單快速、低成本、高精確的SNP檢測方法，在未來臨床疾病致病基因研究以及臨床基因檢測領(lǐng)域?qū)袕V泛的應(yīng)用前景。本發(fā)明基因多態(tài)檢測方法，主要具有以下優(yōu)點1、多個樣本多個基因位點同時檢測由于相同的基因位點擴增不同的DNA片段， 混合均勻后一起酶切、毛細管電泳。一次酶切通常可以同時混合2-50個樣本的PCR擴增產(chǎn)物；由于采用了多重PCR體系，一個PCR擴增反應(yīng)通?？梢酝瑫r擴增1-50個位點，也就意味著如果選用4個以上的基因位點，每個基因位點設(shè)計4個不同擴增長度，那么意味著一次反應(yīng)可以同時檢測16個以上目標(biāo)基因位點；2、高精確性由于酶切底物中加入含有限制性內(nèi)切酶的特異酶切位點的內(nèi)對照 DNA片段，解決了有些限制性內(nèi)切酶酶切不完全的情況；3、操作簡單只要將樣本DNA進行多重PCR，之后將不同樣本PCR產(chǎn)物混勻特異性酶切后直接跑毛細管電泳儀(如ABI測序儀)即可，整個實驗過程僅需要一步PCR循環(huán)、一步酶切和一步毛細管電泳。


下面結(jié)合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細的說明。圖1是本發(fā)明同時檢測一個遺傳多態(tài)位點在多個樣本中基因分型原理圖；圖2是本發(fā)明同時檢測一個樣本中多個遺傳多態(tài)位點基因分型原理圖；圖3是本發(fā)明同時檢測多個遺傳多態(tài)位點在多個樣本基因分型原理圖；圖4是本發(fā)明實施例1檢測四個樣本同一個基因多態(tài)位點的毛細管電泳圖；圖5是本發(fā)明實施例2三個樣本中四個基因多態(tài)位點同時檢測結(jié)果圖。
具體實施例方式本發(fā)明的基因多態(tài)檢測方法是基于限制性酶切RFLP原理并結(jié)合多重?zé)晒釶CR擴增以及毛細管電泳長度差異片段分離技術(shù)對一個或多個樣本的一個或多個目標(biāo)基因同時進行檢測，并利用參照酶切序列對檢測結(jié)果進行校正后獲取目標(biāo)基因的正確遺傳多態(tài)性的檢測方法，其主要檢測過程如下(檢測原理圖參見圖1-3)1)針對一個或多個目標(biāo)基因以及參照酶切序列進行多重PCR引物設(shè)計，每對引物中的一條標(biāo)上信號標(biāo)記，該信號標(biāo)記通常采用熒光標(biāo)記，多重PCR引物中各熒光標(biāo)記引物具有相同或不同的熒光，同種熒光引物對應(yīng)的擴增產(chǎn)物長度必須有至少Ibp以上的差別。2)針對每種限制性內(nèi)切酶的特異序列，設(shè)計內(nèi)對照DNA片段，該內(nèi)對照DNA片段包含目標(biāo)基因的限制性內(nèi)切酶序列，并通過化學(xué)合成或PCR擴增的方式制備該內(nèi)對照DNA片段。3)用上述設(shè)計的引物對待測樣本進行多重?zé)晒釶CR擴增。4)將不同樣本的PCR擴增產(chǎn)物和內(nèi)對照DNA片段混勻，在限制性內(nèi)切酶的最適條件下酶切。5)酶切產(chǎn)物通過變性、毛細管電泳將不同長度的片段分開，收集每個條帶的位置信息以及熒光強度，這一步通常在測序儀上完成如美國應(yīng)用生物公司的測序儀ABI3130以及 ABI3730 等。6)由于不同基因的擴增產(chǎn)物在長度以及熒光標(biāo)記上不同，而且同一基因位點上樣本DNA以及內(nèi)對照DNA擴增產(chǎn)物長度也不同，因此根據(jù)毛細管電泳峰形圖可以明確每個基因位點上樣本DNA以及內(nèi)對照DNA各自酶切效果。由于內(nèi)對照DNA片段含有樣本DNA在每個目標(biāo)基因位點上限制性內(nèi)切酶的特異序列，因此樣本DNA目標(biāo)基因的酶切效率可以通過內(nèi)對照DNA的酶切效率對比估算。分別計算樣本DNA每個目標(biāo)基因片段的酶切前后的峰高或面積比(U/C1)與內(nèi)對照DNA片段的酶切前后的峰高或面積比(U/C2)。7)將每個目標(biāo)基因片段酶切前后的U/C1比值分別參照內(nèi)對照DNA片段的U/C2比 值，然后確定目標(biāo)基因片段的遺傳多態(tài)性。8)如果檢測的目標(biāo)基因片段酶切效率高，限制性內(nèi)切酶酶切完全，可獲取更準確 的結(jié)果。實施例1利用本發(fā)明方法對ー個基因多態(tài)位點多個樣本同時檢測G蛋白0 3亞 單位基因C825T(chrl2 rs5443)基因分型。檢測樣本4個樣本分折rs5443SNP位點前后500bp的序列特征，設(shè)定其限制性內(nèi)切酶為 BseDKfermentas公司提供)，酶切序列為丨.'；；'； .: rsM43附近堿基序列TGTGGGCTGCCCAGGTCTGATCCCTGACCCACTTGCCACCCGTGCCCTCAGTTCTTCCCCAATGGAGAG GCCATCTGCACGGGCTCGGATGACGCTTCCTGCCGCTTGTTTGACCTGCGGGCAGACCAGGAGCTGATCTGCTTCTC CCACGAGAGCATCATCTGCGGCATCACGTCYGTGGCCTTCTCCCTCAGTGGCCGCCTACTATTCGCTGGCTACGACG ACTTCAACTGCAATGTCTGGGACTCCATGAAGTCTGAGCGTGTGGGTAAGGGCCAGCCCTGGCTGCTGCTTCCTCAG CTGGAAGGACCCTCCCCAGCCCTCCCTCCCCAT(SEQ ID NO 1)引物序列其中，[FAM]表示為熒光標(biāo)記。rs5443Fl [FAM]CACCCGTGCCCTCAGTTCTT(SEQ ID NO 2)rs5443F2 [FAM]tttttCACCCGTGCCCTCAGTTCTT(SEQ ID NO 3)rs5443F3 [FAM]ttttttttttCACCCGTGCCCTCAGTTCTT(SEQ ID NO 4)rs5443F4 [FAM]tttttttttttttttCACCCGTGCCCTCAGTTCTT(SEQ ID NO 5)rs5443R :GCCCTTACCCACACGCTCAG(SEQ ID NO :6)實驗體系及步驟(1)將樣本大概定量，然后稀釋至約IOng/ U 1作為待測DNA樣本待用。(2)配置PCR引物混合液，分別配置4對PCR引物rs5443Fl/R、rs5443F2/R、 rs5443F3/R 和 rs5443F4/R，每條引物濃度各 1 P M。(3)含限制性內(nèi)切酶酶切特異序列的內(nèi)對照DNA (標(biāo)為iDNA)。(4)多重PCR體系(20 U 1)配置
IOxBuffer(Qiagen) 2u 1 PCR引物混合液2 ill
MgC12(25mM)0. 8 u 1
dNTP(IOmM)0.4u 1
樣本DNA1 u 1
HotstarTaq(5U/U 1，Qiagen) 0. 2 U 1 ddH2013. 6 illPCR 程序
權(quán)利要求
1.一種基因多態(tài)檢測方法，其特征在于，包括以下步驟針對一個或多個目標(biāo)基因設(shè)計多重PCR引物，每個目標(biāo)基因包含限制性內(nèi)切酶序列， 每對引物中的一條具有信號標(biāo)記；針對每個目標(biāo)基因包含的限制性內(nèi)切酶序列，設(shè)計內(nèi)對照DNA片段，該內(nèi)對照DNA片段包含所述目標(biāo)基因的限制性內(nèi)切酶序列；用所述PCR引物對待測樣本進行多重PCR擴增；將待測樣本的PCR擴增產(chǎn)物和內(nèi)對照DNA片段混勻，用所述限制性內(nèi)切酶序列對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進行酶切；酶切產(chǎn)物經(jīng)變性后，通過毛細管電泳將不同長度的片段分開，收集每個條帶的位置信息以及信號強度；計算樣本每個目標(biāo)基因片段酶切前后的峰高或面積比、以及內(nèi)對照DNA片段的酶切前后的峰高或面積比，將每個目標(biāo)基因片段酶切前后的峰高或面積比值分別參照內(nèi)對照DNA 片段酶切前后的峰高或面積比值，獲得待測樣本目標(biāo)基因片段的遺傳多態(tài)性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因多態(tài)檢測方法，其特征在于，所述多重PCR引物中，各信號標(biāo)記引物具有相同或不同的信號標(biāo)記。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因多態(tài)檢測方法，其特征在于，所述相同信號標(biāo)記的引物對應(yīng)的擴增產(chǎn)物長度有至少Ibp的差別。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的基因多態(tài)檢測方法，其特征在于，所述信號標(biāo)記包括熒光標(biāo)記。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因多態(tài)檢測方法，其特征在于，所述內(nèi)對照DNA片段通過化學(xué)合成或PCR擴增制得。
6.一種基因多態(tài)檢測試劑盒，其特征在于，主要包括有(A)針對一個或多個目標(biāo)基因設(shè)計的多重PCR引物，每個目標(biāo)基因包含限制性內(nèi)切酶序列，每對引物中的一條具有信號標(biāo)記；(B)針對每個目標(biāo)基因包含的限制性內(nèi)切酶序列設(shè)計的內(nèi)對照DNA片段，該內(nèi)對照DNA 片段包含所述目標(biāo)基因的限制性內(nèi)切酶序列；(C)所述限制性內(nèi)切酶序列對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基因多態(tài)檢測試劑盒，其特征在于，所述多重PCR引物中，各信號標(biāo)記引物具有相同或不同的信號標(biāo)記。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的基因多態(tài)檢測試劑盒，其特征在于，所述相同信號標(biāo)記的引物對應(yīng)的擴增產(chǎn)物長度有至少Ibp的差別。
9.根據(jù)權(quán)利要求6至8中任一項所述的基因多態(tài)檢測試劑盒，其特征在于，還包含有多重PCR反應(yīng)緩沖液及限制性酶切緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明公開一種基因多態(tài)檢測方法，包括以下步驟針對目標(biāo)基因設(shè)計多重PCR引物，每個目標(biāo)基因包含限制性內(nèi)切酶序列；設(shè)計內(nèi)對照DNA片段，該內(nèi)對照DNA片段包含目標(biāo)基因的限制性內(nèi)切酶序列；對待測樣本進行多重PCR擴增；將PCR擴增產(chǎn)物和內(nèi)對照DNA片段混勻，用限制性內(nèi)切酶進行酶切；酶切產(chǎn)物經(jīng)變性后，通過毛細管電泳將不同長度的片段分開，收集每個條帶的位置信息及信號強度；計算樣本每個目標(biāo)基因片段酶切前后的峰高或面積比、以及內(nèi)對照DNA片段酶切前后的峰高或面積比，得待測樣本目標(biāo)基因片段的遺傳多態(tài)性。本發(fā)明還公開了一種基因多態(tài)檢測試劑盒。本發(fā)明基因多態(tài)檢測方法，能在一個反應(yīng)體系中快速、精確地同時檢測多個樣本的多個目標(biāo)基因的遺傳多態(tài)性。
文檔編號C12Q1/68GK102399900SQ20111042619
公開日2012年4月4日 申請日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者姜正文, 孫斯平, 彭冬鉑 申請人:上海天昊生物科技有限公司