專利名稱：高密度微生物混合發(fā)酵在磷限制下合成含苯聚羥基烷酸酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種高密度微生物混合發(fā)酵在磷限制下合成含苯聚羥基烷酸酯的方法。
背景技術(shù)：
伴隨石油化工的發(fā)展，合成塑料已成為人們生活和生產(chǎn)密不可分的エ業(yè)產(chǎn)品。但是大量不可降解塑料的廢棄已造成愈來愈嚴重的“白色汚染”，日益威脅著人類賴以生存的環(huán)境，因此開發(fā)可生物降解的塑料已成為當務(wù)之急。目前采用生物技術(shù)生產(chǎn)的生物可完全降解的塑料中，研究得比較多的有兩類聚乳酸和聚羥基烷酸酯。尤其后者的物化性能與聚丙烯相近，還具有生物相容性、光學活性、壓電效應、低透氧性、抗紫外線和抗凝血性等許多獨特的優(yōu)點，在醫(yī)用產(chǎn)品領(lǐng)域也有廣泛的用途。臨床醫(yī)學研究表明含苯基功能團的有機物苯乙酸和苯丁酸等具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛和化學預防治療等功能。如果將苯基功能團引入生物高分子聚合材料一一聚羥基烷酸酯中，合成出具有優(yōu)良物理化學和機械性能的含苯聚羥基烷酸酯(PHPhA)，利用它在降解過程中緩慢釋放出含苯基功能團的有機酸如苯乙酸、苯丁酸等的特點，從而使生物可降解醫(yī)用材料聚羥基烷酸酯在使用過程中具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛等新的醫(yī)學作用，可為擴大該類生物高分子材料在醫(yī)學方面的應用奠定良好的基礎(chǔ)。不含苯基功能團的聚羥基烷酸酯的生物合成技術(shù)已經(jīng)基本成熟，如利用發(fā)酵法合成聚羥基丁酸酯(PHB)的濃度可達到每升140克，合成的羥基丁酸和羥基戊酸共聚物的濃度能達到每升50 90克左右，這使它們的生產(chǎn)成本大幅度降低，具備了エ業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)的條件。但是利用微生物以含苯有機物(如苯戊酸、苯乳酸等)為碳源合成含有苯基功能團的聚羥基烷酸酯吋，由于通常微生物代謝含苯有機物的速率較低，而且有機物碳源對細胞生長有明顯抑制作用等原因，使得最終得到的細胞濃度和產(chǎn)物濃度都較低。近期報道的兩段流加式高密度發(fā)酵合成聚羥基苯烷酸酯的方法，可有效地降低有機物碳源對細胞生長抑制作用，從而使得發(fā)酵果汁最終得到的細胞濃度可以達到35. 3克/升，產(chǎn)物聚羥基苯烷酸酯的濃度達到12. 3克/升。但發(fā)酵過程分為兩段，兩段之間要調(diào)換不同的調(diào)節(jié)pH值所用的堿液，同時兩段發(fā)酵過程中補給的料液也不同，使得發(fā)酵過程操作、控制較為復雜。再加之發(fā)酵過程中僅僅利用単一菌種如heudomonas putida發(fā)酵合成的含苯羥基烷酸酯共聚物中、單體絕大部分都是中長鏈(六個碳或以上)烷酸酯単體，短鏈G個碳或以下，或5個碳)烷酸酯単體含量低，導致其材料難于加工成型，大大地限制了它的應用范圍。此外，利用単一菌種微生物發(fā)酵合成聚羥基烷酸酯吋，因微生物特性所定，其代謝產(chǎn)物聚羥基烷酸酯往往主要由短鏈單體組成，或者主要由中長鏈單體組成，很難調(diào)節(jié)和控制聚羥基烷酸酯產(chǎn)物中短鏈單體和中長鏈單體的比例，以使其產(chǎn)物的物理化學性能難以調(diào)控，大大地限制了它的使用范圍。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供ー種利用微生物混合發(fā)酵、多種碳源分段補給來合成既含有短鏈單體又含有中長鏈單體的含苯聚羥基烷酸酷，井能有效地大范圍調(diào)控其產(chǎn)物組成、而且操控過程簡單的高密度微生物混合發(fā)酵在磷限制下合成含苯聚羥基烷酸酯的方法。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案為高密度微生物混合發(fā)酵在磷限制下合成含苯聚羥基烷酸酯的方法，合成方法包括(1)在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入磷酸鹽作為微生物生長代謝所必須的磷營養(yǎng)元素的供體，同時在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入含苯有機物和糖作為碳源，然后將兩種或兩種以上的微生物接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中于發(fā)酵罐內(nèi)進行混合發(fā)酵培養(yǎng)；(2)以Iwm的流量將無菌空氣或富氧氣體(如エ業(yè)級的氧氣)連續(xù)通入步驟(1) 中的發(fā)酵罐內(nèi)，控制發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn)速為150 800轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵溫度為微生物生長的適宜溫度，發(fā)酵液中溶解氧濃度高于微生物生長代謝的需求值；并利用氨水調(diào)節(jié)PH為微生物生長的適宜PH值(如果不用氨水而用氫氧化鈉溶液來調(diào)節(jié)pH值時，在發(fā)酵過程中需要補給一定量的氮源如硫酸銨，以保證發(fā)酵過程中微生物對氮的需求量)；(3)發(fā)酵過程中利用在線信號(如溶氧濃度、PH、在線糖濃度分析儀等)判斷發(fā)酵過程中碳源(糖和含苯有機物等)的消耗量，適時流加碳源以保證微生物的生長所需碳源， 使發(fā)酵罐內(nèi)含苯有機物的濃度在0. 5克/升以下，不對微生物生長造成抑制作用；糖的濃度不大于20克/升；隨著發(fā)酵的進行，發(fā)酵液中營養(yǎng)元素磷的濃度不斷降低，當發(fā)酵液中的磷濃度逐漸降低至0. 1克/升吋，造成發(fā)酵液中磷源的供給不足，實現(xiàn)了磷限制；此吋，流加到發(fā)酵罐內(nèi)的含苯有機物和糖通過微生物代謝合成轉(zhuǎn)化為聚羥基苯烷酸酯(是指磷限制之后再流加的含苯有機物和糖)。在出現(xiàn)磷限制以后，若要提高產(chǎn)物中苯戊酸単體的含量，可適當提高發(fā)酵罐內(nèi)含苯有機物的濃度，但為了防止含苯有機物對微生物生長代謝產(chǎn)生的抑制作用，其濃度不得高于1.5克/升。本發(fā)明上述的兩種或兩種以上的微生物菌種為有能力將碳源轉(zhuǎn)化為含苯聚羥基燒酸酉旨的微生物，如Pseudomonas oleovorans (食油假單胞菌)，Pseudomonas putida(惡臭イ131 單胞囷ノ，Pseuaomonas hydrogenovora, Caldimonas taiwanensi, Ralstonia eutropha(真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌)等中的兩種或兩種以上。本發(fā)明上述步驟(2)中所述的“微生物生長的適宜溫度”和“微生物生長的適宜pH 值”，因為適宜溫度和PH與菌種種類有關(guān)，根據(jù)具體采用的菌種種類可以給出適宜的溫和 PH值，如本發(fā)明采用的適宜溫度可以為28 38°C，如以惡臭假單胞菌I^seudomonas putida KT2442和真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌fellstonia eutropha混合培養(yǎng)為例，適宜pH值為7. O士2。上述所述的含苯有機物為苯乙酸、苯己酸、苯戊酸、苯乳酸中的ー種或ー種以上的混合物。上述所述的糖為葡萄糖、蔗糖、木糖等中的ー種或ー種以上的混合。本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果如下1.不同的微生物可將碳源轉(zhuǎn)化為不同的聚羥基烷酸酷，如Ralstonia eutropha 可將葡萄糖轉(zhuǎn)化為聚羥基丁酸酯(屬于短鏈聚羥基烷酸酷，比較脆、硬)，而heudomonasPUtida可將葡萄糖轉(zhuǎn)化為聚羥基癸酸-月桂酸酯共聚物(屬于中長鏈聚羥基烷酸酷，比較柔、有弾性)。本發(fā)明利用不同微生物的混合發(fā)酵，可以合成出既含有短鏈也含有中長鏈的聚羥基烷酸酯；同時通過混合碳源補給，利用不同微生物在不同碳源環(huán)境下生長代謝的差異性，可實現(xiàn)大范圍調(diào)控產(chǎn)物中短鏈和中長鏈單體的比例，達到調(diào)控產(chǎn)物組成的目的，從而改善產(chǎn)物的物理化學性能，擴大產(chǎn)物的應用范圍。2.本發(fā)明采用在磷限制的情況下高效合成含苯聚羥基苯烷酸酷，發(fā)酵過程不需要分為兩個階段，也避免了氮限制的情況下發(fā)酵過程中間需要調(diào)換調(diào)控PH的堿性溶液，使得發(fā)酵過程簡單，易于操控。另外，采用磷限制進行發(fā)酵時，發(fā)酵結(jié)束時的細胞濃度與初始發(fā)酵液中加入的磷元素濃度有關(guān)，一般初始磷元素濃度越高，發(fā)酵結(jié)束時細胞濃度越高，通過控制初始發(fā)酵液中磷元素的濃度，從而可實現(xiàn)調(diào)控發(fā)酵結(jié)束時的細胞濃度。采用這ー技術(shù) エ藝，可以實現(xiàn)高密度發(fā)酵合成聚羥基苯烷酸酯的目的，最終發(fā)酵液中干細胞濃度最高可以達到53. 2g/L，產(chǎn)物聚羥基苯烷酸酯的含量達到40. 2%。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發(fā)明作進ー步詳細說明，但本發(fā)明不僅僅局限于以下實施例惡臭イ叚單胞菌Pseudomonas putida KT2442禾ロ真養(yǎng)產(chǎn)喊桿菌Ralstonia eutropha 都具有將碳源(糖類)轉(zhuǎn)化為含苯聚羥基烷酸酯的能力，在此以惡臭假單胞菌I3Seudomonas putida KTM42和真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌Ralstonia eutropha的高密度微生物混合發(fā)酵在磷限制條件下高效合成含苯聚羥基烷酸和KH2PO4作為磷元素的供體為例，說明本發(fā)明的具體實施方式
。上述的惡臭假單胞菌I^seudomonas putida KTM42來源于韓國科學技術(shù)院生物化學工程實驗室，真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌Ralstonia eutropha購于英國菌種保藏中心。實施例1以表2中所述的實施方案1實施，即初始發(fā)酵培養(yǎng)基中KH2PO4的初始濃度為1. 5 克/升。具體過程如下配制1. 5L發(fā)酵培養(yǎng)基(其組成見表1，其中KH2PO4中的磷作為“磷營養(yǎng)元素供體”)，裝入5L發(fā)酵罐(發(fā)酵罐Model :KF-5, K0BI0TECH CO.，LTD韓國生物技術(shù)有限公司， 型號KF-5)中并滅菌，滅菌后分別接入IOOmL惡臭假單胞菌的種子液和IOOmL真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌的種子液(液體種子發(fā)酵培養(yǎng)基中蔗糖濃度為5g/L，其它成分的濃度與基本發(fā)酵培養(yǎng)基的相同，見表1，種子液按照常規(guī)技術(shù)制備)。在30°C、初始攪拌轉(zhuǎn)速220轉(zhuǎn)/分鐘下開始發(fā)酵培養(yǎng)，再以Ivvm的流量通入無菌空氣或富氧氣體，保持發(fā)酵液中溶氧濃度高于20% (通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速或氣體中氧氣的濃度使溶解氧濃度高于20%，以同溫同壓下空氣中的氧在發(fā)酵液中的飽和溶解度值為100%為參照)；用36%氨水調(diào)節(jié)pH為7. O。在線監(jiān)測發(fā)酵罐中PH和溶解氧濃度的變化，當二者同時迅速上升時，說明培養(yǎng)基中碳源耗盡，需要流加碳源(補料I+IV)，使發(fā)酵罐中蔗糖濃度保持在10 15克/升之間，使苯戊酸的濃度小于0. 5 克/升；隨著發(fā)酵過程的進行，當磷元素的濃度降低到0. 1克/升吋，在補充蔗糖的同時補充苯戊酸，使發(fā)酵液中苯戊酸的濃度在0. 5 1克/升之間，這樣可以提高含苯聚羥基苯烷酸酯中苯戊酸単體的比例，直至發(fā)酵結(jié)束。
實施例2以表2中所述的實施方案2實施，即初始發(fā)酵培養(yǎng)基中KH2PO4的初始濃度為2. 5 克/升，補充的碳源為補料II+IV。其他過程同實施例1。實施例3以表2中所述的實施方案3實施，即初始發(fā)酵培養(yǎng)基中KH2PO4的初始濃度為3. 5 克/升，補充的碳源為補料II+IV。其他過程同實施例1。利用上述發(fā)酵方法，發(fā)酵終了時細胞濃度、產(chǎn)物聚羥基苯烷酸酯在細胞中的含量、 發(fā)酵總時間在表4中給出。表1發(fā)酵培養(yǎng)基及微量元素溶液的組成
權(quán)利要求
1.一種高密度微生物混合發(fā)酵在磷限制下合成含苯聚羥基烷酸酯的方法，其特征在于合成方法包括(1)在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入磷酸鹽作為微生物生長代謝所必須的磷營養(yǎng)元素的供體，同時在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入含苯有機物和糖作為碳源，然后將兩種或兩種以上的微生物接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中于發(fā)酵罐內(nèi)進行混合發(fā)酵培養(yǎng)；(2)以Ivvm的流量將無菌空氣或富氧氣體連續(xù)通入步驟(1)中的發(fā)酵罐內(nèi)，控制發(fā)酵罐的攪拌轉(zhuǎn)速為150 800轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵溫度為微生物生長的適宜溫度，發(fā)酵液中溶解氧濃度高于微生物生長代謝的需求值；并利用氨水調(diào)節(jié)PH為微生物生長的適宜pH值；(3)發(fā)酵過程中利用在線信號判斷發(fā)酵過程中碳源的消耗量，適時流加碳源以保證微生物的生長所需碳源，使發(fā)酵罐內(nèi)含苯有機物的濃度在0. 5克/升以下；糖的濃度不大于 20克/升；隨著發(fā)酵的進行，發(fā)酵液中營養(yǎng)元素磷的濃度不斷降低，當發(fā)酵液中的磷濃度逐漸降低至0. 1克/升時，造成發(fā)酵液中磷源的供給不足，實現(xiàn)了磷限制；此時，流加到發(fā)酵罐內(nèi)的含苯有機物和糖通過微生物代謝合成轉(zhuǎn)化為聚羥基苯烷酸酯。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高密度微生物混合發(fā)酵在磷限制下合成含苯聚羥基烷酸酯的方法，其特征在于合成方法還包括為了提高產(chǎn)物中苯戊酸單體的含量，在出現(xiàn)磷限制以后，提高發(fā)酵罐內(nèi)含苯有機物的濃度，但為了防止含苯有機物對微生物生長代謝產(chǎn)生的抑制作用，其濃度不得高于1. 5克/升。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高密度微生物混合發(fā)酵在磷限制下合成含苯聚羥基烷酸酯的方法，其特征在于所述的兩種或兩種以上的微生物為I^seudomonas oleovorans, Pseudomonas putida, Pseudomonas hydrogenovora, Caldimonas taiwanensi, Ralstonia eutropha中的兩種或兩種以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高密度微生物混合發(fā)酵在磷限制下合成含苯聚羥基烷酸酯的方法，其特征在于所述的含苯有機物為苯乙酸、苯己酸、苯戊酸、苯乳酸中的一種或其混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高密度微生物混合發(fā)酵在磷限制下合成含苯聚羥基烷酸酯的方法，其特征在于所述的糖為葡萄糖、蔗糖、木糖中的一種或一種以上的混合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高密度微生物混合發(fā)酵在磷限制下合成含苯聚羥基烷酸酯的方法，其特征在于步驟(2)所述的適宜溫度為28 38°C，適宜pH值為7. O士2。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高密度微生物混合發(fā)酵在磷限制下合成含苯聚羥基烷酸酯的方法，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為組成如下的培養(yǎng)基蔗糖15g/L，KH2PO4L 5 3. 5g/L，(NH4)2SO4 lg/L，MgSO4 ·7Η20 1. 2g/L，檸檬酸 1. 7g/L，苯戊酸 0. lg/L，微量元素溶液 10ml/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的高密度微生物混合發(fā)酵在磷限制下合成含苯聚羥基烷酸酯的方法，其特征在于所述的微量元素溶液，其組成如下FeSO4 ·7Η20 10g/L, CaCl2 2g/ L, ZnSO4 · 7H20 2. 25g/L, MnSO4 · 4H20 0. 35g/L, CuSO4 · 5H20 1. 2g/L, H3BO3 0. 25g/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 12g/L,35% HCl 10ml/L。
全文摘要
本發(fā)明公開一種高密度微生物混合發(fā)酵在磷限制下合成含苯聚羥基烷酸酯的方法，(1)在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入磷酸鹽、作為碳源的苯有機物和糖，然后將兩種或兩種以上的微生物接入進行混合發(fā)酵；(2)將無菌空氣或富氧氣體連續(xù)通入發(fā)酵罐內(nèi)，控制發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)速、溫度、pH值；(3)發(fā)酵罐內(nèi)含苯有機物的濃度在0.5克/升以下；糖的濃度≤20克/升；發(fā)酵液中磷濃度不斷降低，當發(fā)酵液中的磷濃度降至0.1克/升實現(xiàn)磷限制；此時，流加到發(fā)酵罐內(nèi)的碳源轉(zhuǎn)化為聚羥基苯烷酸酯。本發(fā)明具有利用微生物混合發(fā)酵、多種碳源分段補給來合成既含有短鏈單體又含有中長鏈單體的含苯聚羥基烷酸酯，并能有效地大范圍調(diào)控其產(chǎn)物組成、而且操控過程簡單的優(yōu)點。
文檔編號C12P7/62GK102559830SQ20111042224
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者尚龍安, 張艷輝, 江岷, 王曉燕, 金志華, 黃錦標 申請人:浙江大學寧波理工學院