專利名稱：微生物混合發(fā)酵提高漆酶產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及提高漆酶產(chǎn)量的發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
田彥六郎(1883)在漆樹的樹液中發(fā)現(xiàn)能使“樹漆”氧化硬化的酶，后來貝特蘭德 (G. E. Bertrand, 1894)詳細地研究了東南亞產(chǎn)的漆中的酶，命名為漆酶。漆酶分布于微生物、菌類中，是一種銅蛋白質(zhì)，藍色，分子量約12萬，含4原子銅，因此漆酶是一種含有銅的多酚氧化酶。漆酶在堿性環(huán)境中不穩(wěn)定、易失活。漆酶可降解多種難降解的有機污染物和一些有毒物質(zhì)，能在體外氧化PAH;而且，漆酶可存活于空氣中，發(fā)生反應(yīng)后唯一的產(chǎn)物就是水， 因此本質(zhì)上是一種環(huán)保型酵素。隨著環(huán)保意識逐漸被人所重視，因此近年來漆酶也成為眾多學者的研究對象。利用白腐菌微生物混合培養(yǎng)產(chǎn)漆酶存在很大的隨機性和不確定性，所以，目前都是采用單一白腐菌“強化”的方法提高其漆酶的產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決目前都是采用單一白腐菌“強化”的方法提高其漆酶的產(chǎn)量，而利用白腐菌微生物混合培養(yǎng)產(chǎn)漆酶存在很大的隨機性和不確定性的問題，而提供的微生物混合發(fā)酵提高漆酶產(chǎn)量的方法。本發(fā)明第一種微生物混合發(fā)酵提高漆酶產(chǎn)量的方法按以下步驟實施一、混合發(fā)酵微生物菌株活化，混合發(fā)酵的微生物為青頂擬多孔菌和靈芝菌；二、將活化的青頂擬多孔菌和靈芝菌接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后在溫度為28士 1°C、搖床轉(zhuǎn)速為120士 lOr/min 條件下發(fā)酵培養(yǎng)10天；三、分離純化漆酶，即完成提高漆酶產(chǎn)量的微生物混合發(fā)酵；步驟二中青頂擬多孔菌的接種量為每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基接種0. 0225 0. 027g ； 步驟二中靈芝菌的接種量為每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基接種0. 0225 0. 027g ；步驟二中液體發(fā)酵培養(yǎng)基每 1 升由 20g麩皮、0. 44g 氯化銨、0. 2g KH2PO4、0.05g MgS04、0. Olg CaCl2、l. Og 吐溫80、ImL無機溶液、0. 5mL維生素溶液和余量的蒸餾水組成。本發(fā)明第二種微生物混合發(fā)酵提高漆酶產(chǎn)量的方法按以下步驟實施一、混合發(fā)酵微生物菌株活化，混合發(fā)酵的微生物為青頂擬多孔菌和糙皮側(cè)耳菌；二、將活化的青頂擬多孔菌和糙皮側(cè)耳菌接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后在溫度為28士 1°C、搖床轉(zhuǎn)速為 120士 lOr/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)20天；三、分離純化漆酶，即完成提高漆酶產(chǎn)量的微生物混合發(fā)酵；步驟二中青頂擬多孔菌的接種量為每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基接種0. 0225 0. 027g ； 步驟二中糙皮側(cè)耳菌的接種量為每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基接種0. 0225 0. 027g ；步驟二中液體發(fā)酵培養(yǎng)基每 1 升由 20g 麩皮、0. 44g 氯化銨、0. 2g ΚΗ2Ρ04、0· 05g MgS04、0· Olg CaCl2, 1. Og吐溫80、ImL無機溶液、0. 5mL維生素溶液和余量的蒸餾水組成。
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本發(fā)明第三種微生物混合發(fā)酵提高漆酶產(chǎn)量的方法按以下步驟實施一、混合發(fā)酵微生物菌株活化，混合發(fā)酵的微生物為青頂擬多孔菌、糙皮側(cè)耳菌和偏腫擬栓菌；二、將活化的青頂擬多孔菌、糙皮側(cè)耳菌和偏腫擬栓菌接種于同一液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后在溫度為28士 1°C、搖床轉(zhuǎn)速為120士 lOr/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)14天；三、分離純化漆酶，即完成提高漆酶產(chǎn)量的微生物混合發(fā)酵；步驟二中青頂擬多孔菌的接種量為每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基接種0. 015 0. OlSg ；步驟二中糙皮側(cè)耳菌的接種量為每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基接種0. 015 0. OlSg ；步驟二中偏腫擬栓菌的接種量為每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基接種0. 015 0. OlSg ；步驟二中液體發(fā)酵培養(yǎng)基每1 升由 20g 麩皮、0. 44g 氯化銨、0. 2g KH2PO4、0.05g MgS04、0. Olg CaCl2、1. Og 吐溫 80、ImL 無機溶液、0. 5mL維生素溶液和余量的蒸餾水組成。本發(fā)明三種方法步驟二液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的無機溶液都是按以下比例配制的每升無機溶液由 3. Og MgSO4 · 7Η20、0· 5g MnSO4U. Og NaCl、0. Ig FeSO4 · 7Η20、0· Ig CoSO4, 0. 082gCaCl2、0. Ig ZnSO4,0. Olg CuSO4 · 5Η20、0· Olg KAl (SO4) 2、0· Olg Η3Β03、0· Olg NaMoO4 和余量的去離子水組成。本發(fā)明三種方法步驟二液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的維生素溶液都是按以下比例配制的每升維生素溶液由 0. 005g VBUO. 005g VB2、0. 002g 生物素、0. 002g 葉酸、0. Olg VB6、 0. 005g煙酸和和余量的蒸餾水組成。本發(fā)明中所用的靈芝菌(Ganoderma lucidum)為靈芝科靈芝屬(Ganoderma Karst)真菌。本發(fā)明第一種微生物混合發(fā)酵提高漆酶產(chǎn)量的方法步驟二發(fā)酵培養(yǎng)10天漆酶產(chǎn)量達到峰值，漆酶產(chǎn)量為42. 89U/mL。本發(fā)明第二種微生物混合發(fā)酵提高漆酶產(chǎn)量的方法步驟二發(fā)酵培養(yǎng)20天漆酶產(chǎn)量達到峰值，漆酶產(chǎn)量為50. 45U/mL。本發(fā)明第三種微生物混合發(fā)酵提高漆酶產(chǎn)量的方法步驟二發(fā)酵培養(yǎng)14天漆酶產(chǎn)量達到峰值，漆酶產(chǎn)量為75. 98U/mL。活化后采用本發(fā)明步驟二的發(fā)酵培養(yǎng)條件，單獨培養(yǎng)發(fā)酵青頂擬多孔菌，發(fā)酵培養(yǎng)14天漆酶產(chǎn)量達到峰值，漆酶產(chǎn)量為24. 49U/mL?；罨蟛捎帽景l(fā)明步驟二的發(fā)酵培養(yǎng)條件，單獨培養(yǎng)發(fā)酵靈芝菌，發(fā)酵培養(yǎng)6天漆酶產(chǎn)量達到峰值，漆酶產(chǎn)量為10. 72U/mL?；罨蟛捎帽景l(fā)明步驟二的發(fā)酵培養(yǎng)條件，單獨培養(yǎng)發(fā)酵糙皮側(cè)耳菌，發(fā)酵培養(yǎng)4 天漆酶產(chǎn)量達到峰值，漆酶產(chǎn)量為8. 01U/mL?；罨蟛捎帽景l(fā)明步驟二的發(fā)酵培養(yǎng)條件，單獨培養(yǎng)發(fā)酵偏腫擬栓菌，發(fā)酵培養(yǎng) 10天漆酶產(chǎn)量達到峰值，漆酶產(chǎn)量為20. 98U/mL。活化后采用本發(fā)明步驟二的發(fā)酵培養(yǎng)條件，培養(yǎng)發(fā)酵青頂擬多孔菌和偏腫擬栓菌 (青頂擬多孔菌和偏腫擬栓菌的接種量都為每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基接種0. 0225 0. 027g)， 發(fā)酵培養(yǎng)8天漆酶產(chǎn)量達到峰值，漆酶產(chǎn)量為16. 42U/mL?；罨蟛捎帽景l(fā)明步驟二的發(fā)酵培養(yǎng)條件，培養(yǎng)發(fā)酵青頂擬多孔菌、糙皮側(cè)耳菌和靈芝菌(青頂擬多孔菌、糙皮側(cè)耳菌和靈芝菌的接種量都為每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基接種 0. 015 0. 018g)，發(fā)酵培養(yǎng)10天漆酶產(chǎn)量達到峰值，漆酶產(chǎn)量為35. 94U/mL。
本發(fā)明的三種微生物混合發(fā)酵方法可以顯著的提高漆酶的產(chǎn)量。本發(fā)明中漆酶活性的測定方法①利用Lac氧化ABTS，用紫外-可見分光光度計測定420nm處0-210s內(nèi)吸光度值隨時間的變化，從而得知酶反應(yīng)速率，進而推算酶活。具體用等體積5mmol/LABTS溶液和酶液反應(yīng)，測定反應(yīng)前210s內(nèi)420nm處吸光值的增加。定義每Imin氧化1 μ mol ABTS所需的酶量為1個酶活單位。②酶活測定所需試劑5mmol/L ABTS ；0. 2mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH = 5.0)以及一定量的粗酶液(9000r/min離心5min，上清液即為粗酶液)。③酶活測定步驟空白樣(4mL):2mL0. 2mol/L 緩沖液 _0· 4mLABTS_l. 6mL 去離子水樣品(4mL):2mL0. 2mol/L 緩沖液-0. 4mLABTS_l. 2mL 去離子水 _0· 4mL 酶液用紫外-可見分光光度計檢測420nm處吸收值變化，30s間隔讀數(shù)，記錄210s內(nèi)吸
收值變化。
AA V0 1 — g m AA 1④酶活計算公式為 ..v.
Lac 酶活(U/mL)=若測得酶活較小，則可采用U/L為單位。
AA v 1At
艮口 · ^^}舌(U/L)- it Ayisk "V [
式中根據(jù)測得的吸收值變化即可繪制吸收值 時間關(guān)系曲線，即為斜率 V0為測定酶活的反應(yīng)混合物的總體積，4mL ； ε為反應(yīng)產(chǎn)物的吸光介質(zhì)常數(shù)，θβΟΟπιοΓ^πΓ1 ； b為比色皿的厚度，Icm;
V為測定酶活的反應(yīng)混合物中粗酶液的體積，單位為HlL ； 6. 667為公式推導(dǎo)計算出來的系數(shù)。
具體實施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式微生物混合發(fā)酵提高漆酶產(chǎn)量的方法按以下步驟實施一、混合發(fā)酵微生物菌株活化，混合發(fā)酵的微生物為青頂擬多孔菌和靈芝菌；二、將活化的青頂擬多孔菌和靈芝菌接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后在溫度為28士 1°C、搖床轉(zhuǎn)速為 120士 lOr/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)10天；三、分離純化漆酶，即完成提高漆酶產(chǎn)量的微生物混合發(fā)酵；步驟二中青頂擬多孔菌的接種量為每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基接種0. 0225 0. 027g ； 步驟二中靈芝菌的接種量為每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基接種0. 0225 0. 027g ；步驟二中液體發(fā)酵培養(yǎng)基每1升由20g麩皮、0.44g氯化銨、0. 2g KH2P04、0. 05g MgS04、0. Olg CaCl2U. Og吐溫80、ImL無機溶液、0. 5mL維生素溶液和余量的蒸餾水組成。本實施方式步驟二液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的無機溶液是按以下比例配制的每升無機
6溶液由 3. Og MgSO4 · 7Η20、0· 5g MnSO4U. Og NaCl、0. Ig FeSO4 · 7Η20、0· Ig CoS04、0. 082g CaCl2,0. Ig ZnSO4,0. Olg CuSO4 · 5Η20、0· Olg KAl (SO4) 2、0· Olg Η3Β03、0· Olg NaMoO4 和余量的去離子水組成。本實施方式步驟二液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的維生素溶液是按以下比例配制的每升維生素溶液由 0. 005g VBUO. 005g VB2、0. 002g 生物素、0. 002g 葉酸、0. Olg VB6、0. 005g 煙酸和和余量的蒸餾水組成。保持本實施方式步驟二中液體發(fā)酵培養(yǎng)基的自然pH，不必調(diào)節(jié)液體發(fā)酵培養(yǎng)基的 pH。本實施方式的青頂擬多孔菌購買得到，本實施方式的靈芝菌購買得到。本實施方式中所用的靈芝(Ganoderma lucidum)為靈芝科靈芝屬(Ganoderma Karst)真菌。本實施方式步驟三采用硫酸銨鹽析、DEAE Sepharose Fast Flow柱層析和 Sephadex GlOO凝膠柱層析對漆酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基進行分離純化，得到電泳純漆酶(“靈芝TR6號漆酶的分離純化及性質(zhì)研究”，韓君莉，郭麗瓊，鄭曉冰等，應(yīng)用與環(huán)境生物學報，2008 (1) 99-103)，本實施方式步驟二發(fā)酵培養(yǎng)10天漆酶產(chǎn)量達到峰值，漆酶產(chǎn)量為 42. 89U/mL。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一的不同點是步驟一中混合發(fā)酵微生物菌株的活化按以下步驟進行將混合發(fā)酵微生物菌株分別接種于固體培養(yǎng)基后放入28°C環(huán)境中活化3天；然后再分別接種于擴大固體培養(yǎng)基，25°C環(huán)境中培養(yǎng)7天，即完成混合發(fā)酵微生物菌株的活化；固體培養(yǎng)基每1升由200 300g 土豆浸出液、20g葡萄糖、20g瓊脂、3. Og KH2PO4, 1. 5gMgS04和余量的蒸餾水組成；擴大固體培養(yǎng)基每1升由200 30(^土豆浸出液、2(^葡萄糖、2(^瓊脂、3.(^ KH2PO4U. 5g MgSO4和余量的蒸餾水組成。其它步驟及參數(shù)與實施方式一相同。本實施方式中的土豆浸出液由200g 土豆和800mL蒸餾水煮制30min獲得。
具體實施方式
三本實施方式微生物混合發(fā)酵提高漆酶產(chǎn)量的方法按以下步驟實施一、混合發(fā)酵微生物菌株活化，混合發(fā)酵的微生物為青頂擬多孔菌和糙皮側(cè)耳菌；二、 將活化的青頂擬多孔菌和糙皮側(cè)耳菌接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后在溫度為28士 1°C、搖床轉(zhuǎn)速為120士 lOr/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)20天；三、分離純化漆酶，即完成提高漆酶產(chǎn)量的微生物混合發(fā)酵；步驟二中青頂擬多孔菌的接種量為每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基接種0. 0225 0. 027g ； 步驟二中糙皮側(cè)耳菌的接種量為每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基接種0. 0225 0. 027g ；步驟二中液體發(fā)酵培養(yǎng)基每1升由20g麩皮、0.44g氯化銨、0. 2g KH2P04、0. 05g MgS04、0. Olg CaCl2U. Og吐溫80、ImL無機溶液、0. 5mL維生素溶液和余量的蒸餾水組成。本實施方式步驟二液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的無機溶液是按以下比例配制的每升無機溶液由 3. Og MgSO4 · 7Η20、0· 5g MnSO4U. Og NaCl、0. Ig FeSO4 · 7Η20、0· Ig CoS04、0. 082g CaCl2,0. Ig ZnSO4,0. Olg CuSO4 · 5Η20、0· Olg KAl (SO4) 2、0· Olg Η3Β03、0· Olg NaMoO4 和余量的去離子水組成。本實施方式步驟二液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的維生素溶液是按以下比例配制的每升維生素溶液由 0. 005g VBUO. 005g VB2、0. 002g 生物素、0. 002g 葉酸、0. Olg VB6、0. 005g 煙酸
和和余量的蒸餾水組成。保持本實施方式步驟二中液體發(fā)酵培養(yǎng)基的自然pH，不必調(diào)節(jié)液體發(fā)酵培養(yǎng)基的 pH。本實施方式的青頂擬多孔菌和糙皮側(cè)耳菌購買得到。本實施方式步驟三采用硫酸銨鹽析、DEAE Sepharose Fast Flow柱層析和 Sephadex GlOO凝膠柱層析對漆酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基進行分離純化，得到電泳純漆酶，本實施方式步驟二發(fā)酵培養(yǎng)20天漆酶產(chǎn)量達到峰值，漆酶產(chǎn)量為50. 45U/mL。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
三的不同點是步驟一中混合發(fā)酵微生物菌株的活化按以下步驟進行將混合發(fā)酵微生物菌株分別接種于固體培養(yǎng)基后放入28°C環(huán)境中活化3天；然后再分別接種于擴大固體培養(yǎng)基，25°C環(huán)境中培養(yǎng)7天，即完成混合發(fā)酵微生物菌株的活化；固體培養(yǎng)基每1升由200 300g 土豆浸出液、20g葡萄糖、20g瓊脂、3. Og KH2PO4, 1. 5gMgS04和余量的蒸餾水組成；擴大固體培養(yǎng)基每1升由200 30(^土豆浸出液、2(^葡萄糖、2(^瓊脂、3.(^ KH2PO4U. 5g MgSO4和余量的蒸餾水組成。其它步驟及參數(shù)與實施方式三相同。本實施方式中的土豆浸出液由200g 土豆和800mL蒸餾水煮制30min獲得。
具體實施方式
五本實施方式微生物混合發(fā)酵提高漆酶產(chǎn)量的方法按以下步驟實施一、混合發(fā)酵微生物菌株活化，混合發(fā)酵的微生物為青頂擬多孔菌、糙皮側(cè)耳菌和偏腫擬栓菌；二、將活化的青頂擬多孔菌、糙皮側(cè)耳菌和偏腫擬栓菌接種于同一液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后在溫度為28士 1°C、搖床轉(zhuǎn)速為120士 lOr/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)14天；三、分離純化漆酶，即完成提高漆酶產(chǎn)量的微生物混合發(fā)酵；步驟二中青頂擬多孔菌的接種量為每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基接種0. 015 0. OlSg ；步驟二中糙皮側(cè)耳菌的接種量為每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基接種0. 015 0. OlSg ；步驟二中偏腫擬栓菌的接種量為每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基接種0. 015 0. OlSg ；步驟二中液體發(fā)酵培養(yǎng)基每1升由20g麩皮、0.44g氯化銨、0. 2g KH2P04、0. 05g MgS04、0. Olg CaCl2U. Og吐溫80、ImL無機溶液、0. 5mL維生素溶液和余量的蒸餾水組成。本實施方式步驟二液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的無機溶液是按以下比例配制的每升無機溶液由 3. Og MgSO4 · 7Η20、0· 5g MnSO4U. Og NaCl、0. Ig FeSO4 · 7Η20、0· Ig CoS04、0. 082g CaCl2,0. Ig ZnSO4,0. Olg CuSO4 · 5Η20、0· Olg KAl (SO4) 2、0· Olg Η3Β03、0· Olg NaMoO4 和余量的去離子水組成。本實施方式步驟二液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的維生素溶液是按以下比例配制的每升維生素溶液由 0. 005g VBUO. 005g VB2、0. 002g 生物素、0. 002g 葉酸、0. Olg VB6、0. 005g 煙酸和和余量的蒸餾水組成。保持本實施方式步驟二中液體發(fā)酵培養(yǎng)基的自然pH，不必調(diào)節(jié)液體發(fā)酵培養(yǎng)基的 pH。本實施方式的青頂擬多孔菌、糙皮側(cè)耳菌和偏腫擬栓菌購買得到。本實施方式步驟三采用硫酸銨鹽析、DEAE Sepharose Fast Flow柱層析和 Sephadex GlOO凝膠柱層析對漆酶液體發(fā)酵培養(yǎng)基進行分離純化，得到電泳純漆酶，本實施方式步驟二發(fā)酵培養(yǎng)14天漆酶產(chǎn)量達到峰值，漆酶產(chǎn)量為75. 98U/mL。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
五的不同點是步驟一中混合發(fā)酵微生物菌株的活化按以下步驟進行將混合發(fā)酵微生物菌株分別接種于固體培養(yǎng)基后放入28°C環(huán)境中活化3天；然后再分別接種于擴大固體培養(yǎng)基，25°C環(huán)境中培養(yǎng)7天，即完成混合發(fā)酵微生物菌株的活化；固體培養(yǎng)基每1升由200 300g 土豆浸出液、20g葡萄糖、20g瓊脂、3. Og KH2PO4, 1. 5g MgSO4和余量的蒸餾水組成；擴大固體培養(yǎng)基每1升由200 30(^土豆浸出液、2(^葡萄糖、2(^瓊脂、3.(^ KH2PO4U. 5g MgSO4和余量的蒸餾水組成。其它步驟及參數(shù)與實施方式五相同。本實施方式中的土豆浸出液由200g 土豆和800mL蒸餾水煮制30min獲得。
9
權(quán)利要求
1.微生物混合發(fā)酵提高漆酶產(chǎn)量的方法，其特征在于微生物混合發(fā)酵提高漆酶產(chǎn)量的方法按以下步驟實施一、混合發(fā)酵微生物菌株活化，混合發(fā)酵的微生物為青頂擬多孔菌和靈芝菌；二、將活化的青頂擬多孔菌和靈芝菌接種于同一液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后在溫度為 28士 1°C、搖床轉(zhuǎn)速為120士 lOr/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)10天；三、分離純化漆酶，即完成提高漆酶產(chǎn)量的微生物混合發(fā)酵；步驟二中青頂擬多孔菌的接種量為每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基接種0. 0225 0. 027g ；步驟二中靈芝菌的接種量為每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基接種0. 0225 0. 027g ；步驟二中液體發(fā)酵培養(yǎng)基每1升由20g麩皮、0.44g氯化銨、0. 2g KH2P04、0.05g MgSO4,0.Olg CaCl2U. Og吐溫80、ImL無機溶液、0. 5mL維生素溶液和余量的蒸餾水組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的微生物混合發(fā)酵提高漆酶產(chǎn)量的方法，其特征在于步驟一中混合發(fā)酵微生物菌株的活化按以下步驟進行將混合發(fā)酵微生物菌株分別接種于固體培養(yǎng)基后放入28°C環(huán)境中活化3天；然后再分別接種于擴大固體培養(yǎng)基，25°C環(huán)境中培養(yǎng)7天，即完成混合發(fā)酵微生物菌株的活化； 固體培養(yǎng)基每1升由200 30(^土豆浸出液、2(^葡萄糖、2(^瓊脂、3.(^ KH2PO4,1.5gMgS04和余量的蒸餾水組成；擴大固體培養(yǎng)基每1升由200 300g 土豆浸出液、20g葡萄糖、20g瓊脂、3. Og KH2PO4, 1. 5g MgSO4和余量的蒸餾水組成。
3.微生物混合發(fā)酵提高漆酶產(chǎn)量的方法，其特征在于微生物混合發(fā)酵提高漆酶產(chǎn)量的方法按以下步驟實施一、混合發(fā)酵微生物菌株活化，混合發(fā)酵的微生物為青頂擬多孔菌和糙皮側(cè)耳菌；二、將活化的青頂擬多孔菌和糙皮側(cè)耳菌接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后在溫度為28士 1°C、搖床轉(zhuǎn)速為120士 lOr/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)20天；三、分離純化漆酶，即完成提高漆酶產(chǎn)量的微生物混合發(fā)酵；步驟二中青頂擬多孔菌的接種量為每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基接種0. 0225 0. 027g ；步驟二中糙皮側(cè)耳菌的接種量為每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基接種0. 0225 0. 027g ；步驟二中液體發(fā)酵培養(yǎng)基每1升由20g麩皮、0.44g氯化銨、0. 2g KH2P04、0.05g MgSO4,0.Olg CaCl2U. Og吐溫80、ImL無機溶液、0. 5mL維生素溶液和余量的蒸餾水組成。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的微生物混合發(fā)酵提高漆酶產(chǎn)量的方法，其特征在于步驟一中混合發(fā)酵微生物菌株的活化按以下步驟進行將混合發(fā)酵微生物菌株分別接種于固體培養(yǎng)基后放入28°C環(huán)境中活化3天；然后再分別接種于擴大固體培養(yǎng)基，25°C環(huán)境中培養(yǎng)7天，即完成混合發(fā)酵微生物菌株的活化； 固體培養(yǎng)基每1升由200 30(^土豆浸出液、2(^葡萄糖、2(^瓊脂、3.(^ KH2PO4,1.5gMgS04和余量的蒸餾水組成；擴大固體培養(yǎng)基每1升由200 300g 土豆浸出液、20g葡萄糖、20g瓊脂、3. Og KH2PO4, 1. 5g MgSO4和余量的蒸餾水組成。
5.微生物混合發(fā)酵提高漆酶產(chǎn)量的方法，其特征在于微生物混合發(fā)酵提高漆酶產(chǎn)量的方法按以下步驟實施一、混合發(fā)酵微生物菌株活化，混合發(fā)酵的微生物為青頂擬多孔菌、 糙皮側(cè)耳菌和偏腫擬栓菌；二、將活化的青頂擬多孔菌、糙皮側(cè)耳菌和偏腫擬栓菌接種于同一液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后在溫度為28士 1°C、搖床轉(zhuǎn)速為120士 lOr/min條件下發(fā)酵培養(yǎng) 14天；三、分離純化漆酶，即完成提高漆酶產(chǎn)量的微生物混合發(fā)酵；步驟二中青頂擬多孔菌的接種量為每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基接種0. 015 0. OlSg ；步驟二中糙皮側(cè)耳菌的接種量為每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基接種0. 015 0. OlSg ；步驟二中偏腫擬栓菌的接種量為每升液體發(fā)酵培養(yǎng)基接種0. 015 0. OlSg ；步驟二中液體發(fā)酵培養(yǎng)基每1升由20g麩皮、0.44g氯化銨、0. 2g KH2P04、0.05g MgSO4,.0.Olg CaCl2U. Og吐溫80、ImL無機溶液、0. 5mL維生素溶液和余量的蒸餾水組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的微生物混合發(fā)酵提高漆酶產(chǎn)量的方法，其特征在于步驟一中混合發(fā)酵微生物菌株的活化按以下步驟進行將混合發(fā)酵微生物菌株分別接種于固體培養(yǎng)基后放入28°C環(huán)境中活化3天；然后再分別接種于擴大固體培養(yǎng)基，25°C環(huán)境中培養(yǎng)7天，即完成混合發(fā)酵微生物菌株的活化；固體培養(yǎng)基每1升由200 300g 土豆浸出液、20g葡萄糖、20g瓊脂、3. Og KH2PO4U. 5g MgSO4和余量的蒸餾水組成；擴大固體培養(yǎng)基每1升由200 300g 土豆浸出液、20g葡萄糖、20g瓊脂、3. Og KH2PO4,.1.5g MgSO4和余量的蒸餾水組成。
全文摘要
微生物混合發(fā)酵提高漆酶產(chǎn)量的方法，它涉及提高漆酶產(chǎn)量的發(fā)酵方法。它要解決目前都是采用單一白腐菌“強化”的方法提高其漆酶的產(chǎn)量，而利用白腐菌微生物混合培養(yǎng)產(chǎn)漆酶存在很大的隨機性和不確定性的問題。方法一、活化；二、發(fā)酵培養(yǎng)；三、分離純化漆酶。本發(fā)明方法可應(yīng)用于微生物發(fā)酵生產(chǎn)漆酶。
文檔編號C12R1/645GK102443575SQ201110409210
公開日2012年5月9日 申請日期2011年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月9日
發(fā)明者孟瑤, 梁紅, 高大文 申請人:東北林業(yè)大學