專利名稱：一種檢測大熊貓糞樣中西氏貝蛔蟲蟲卵的pcr法的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種西氏貝蛔蟲蟲卵檢測的方法，具體涉及一種使用PCR擴增手段檢測西氏貝蛔蟲蟲卵的方法。
背景技術：
大熊貓是我國的國寶。西氏貝蛔蟲(Baylisascaris schroederi)是野生和圈養(yǎng)大熊貓較為常見的一種腸道寄生蟲，成蟲通常寄生于大熊貓的小腸，以粘膜表面物質(zhì)及半消化的食物為食，不僅直接奪取大量的營養(yǎng)，而且嚴重影響蛋白質(zhì)、脂肪、糖類及維生素的吸收，引起大熊貓營養(yǎng)不良、貧血等癥狀。大量蟲體的寄生將導致腸梗阻、腸穿孔或腸套疊， 有時也可鉆入胰管和膽管內(nèi)，引起阻塞及炎癥，嚴重時極易導致死亡。西氏貝蛔蟲卵的受精蟲卵在顯微鏡下呈深褐色橢圓形，兩極極圓，邊緣不規(guī)則，有乳頭狀突起，為蛋白質(zhì)膜。蟲卵蛋白質(zhì)膜特別厚，使蟲卵對各種理化物質(zhì)和不良的外界環(huán)境具有很強的抵抗力。大熊貓蛔蟲病的臨床癥狀不具備特異性，到目前為止，對大熊貓蛔西氏貝蛔蟲病的診斷仍以漂浮法檢查糞便中的蟲卵。但由于大熊貓以竹子為主食且日食量大，使得每天的排糞量達到10-13kg，由此糞便中的蟲卵密度較低，同時大熊貓糞便中的植物纖維含量很高對蛔蟲卵的檢查有很大的干擾，因此大熊貓蛔蟲卵在采用常規(guī)糞便檢查中較難檢出，因而檢測結(jié)果的準確率較低。在生產(chǎn)中，常出現(xiàn)糞便檢查蛔蟲卵為陰性的大熊貓，也可能會突然嘔吐出大量的蛔蟲。因此，建立一種準確、靈敏的檢測方法是大熊貓蛔蟲病防治工作中的關鍵。對于任何一種PCR方法，DNA模板的質(zhì)量的高低是決定DNA擴增是否成功的關鍵因素之一，西氏貝蛔蟲的蟲卵與別的蟲卵不同之處在于該蛔蟲的蟲卵有一層堅硬、質(zhì)密的蛋白質(zhì)外殼和抗?jié)B透性脂質(zhì)層，因此給蟲卵提取DNA造成了一定的影響。同時，貝蛔蟲蟲卵 DNA含量少，抽提DNA的難度非常大。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明目的在于提供一種準確、靈敏的大熊貓糞樣中西氏貝蛔蟲蟲卵檢測方法。為解決以上技術問題，本發(fā)明提供的技術方案是，提供一種檢測大熊貓糞樣中西氏貝蛔蟲蟲卵的PCR法，包括設計上游引物和下游引物、提取蟲卵DNA、PCR擴增和結(jié)果檢查四個步驟步驟a)引物設計根據(jù)大熊貓西氏貝蛔蟲線粒體1 基因的全序列進行有檢測價值的基因片段的篩選并設計引物，用ft~imer5. 0分析軟件分析其可行性，設計上下游引物上游引物5，-TTTTACCTTGGCATTTTGTC-3，，下游引物5，-CTCTCAATTACTACTCAACCTCC-3，，檢測目的基因片段長度為^lbp，該片段的基因序列如表1 :1 擴增目的片段序
步驟b):提取蟲卵DNA將大熊貓的糞樣用濾糞網(wǎng)過濾后的糞液取出Iml于離心管中，12000r/min離心 5min，倒掉上清液，再從糞樣中取500 μ 1于離心管中，再次12000r/min離心5min，倒掉上清液，如此反復，直到離心管中的糞渣占離心管總體積的1/5 ；將離心管于100°C沸水和液氮中交替放置lmin，經(jīng)過10次的反復充分凍融后，在漩渦震蕩儀上震蕩lOmin，用常規(guī)酚氯仿法提取DNA ；步驟c) :PCR擴增糞樣DNA為PCR模板，以線粒體1 基因序列設計的特異性引物擴增^lbp的目的片段，從而探索PCR對糞樣中大熊貓西氏貝蛔蟲蟲卵1 基因的PCR擴增產(chǎn)物，為了減少糞便中PCR抑制物對PCR的影響，加入0.4%的N，O-雙三甲硅基乙酰胺；PCR體系糞樣DNA為模板1. 5μ 1，上下游引物各1. 5μ l，2XTaq PCR Master混合制劑12. 5 μ 1，滅菌雙蒸水8 μ 1，0.4% N，O-雙三甲硅基乙酰胺；所述2 X I1aqPCR Master混合制劑成分主要有0. IU Taq Polymerase/ul, 500uM DNTP each,20mM Tris-HCL/PH 8.3， IOOmM KCL,3mM MgCL2。PCR程序95°C變性5min后進入循環(huán)；變性溫度95°C，時間30s ；退火溫度50°C， 時間30s ；延伸溫度72°C，時間30s ；重復35個循環(huán)后72°C最后延伸lOmin?；蛘?5°C變性 5min后進入循環(huán)；變性溫度95°C，時間30s ；退火溫度50°C，時間30s ；延伸溫度72°C，時間 30s ；重復35個循環(huán)后72°C最后延伸lOmin。步驟d):結(jié)果檢查PCR產(chǎn)物通過常規(guī)方法進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，用紫外透射儀觀察結(jié)果，觀察到特異性條帶即表明糞便中存在西氏貝蛔蟲蟲卵。如上所述，步驟a)中引物根據(jù)大熊貓西氏貝蛔蟲的線粒體細胞色素氧化酶2基因的全序列進行有檢測價值的基因片段的篩選，并應用I^rimer Premier 5. O軟件，設計上下游引物上游引物5，-GAGTAAGAAGGTTGAGTATCAGTTT-3，，下游引物5，-ATGAATAACATCCCCAGAAGTA-3，，檢測目的片段長度為331bp，該片段的基因序列如表2 :cox2擴增目的片段序列所示。本發(fā)明以犬鉤口線蟲蟲卵DNA作為對照模板，使用相同的擴展體系，未觀察到特異性條帶，由此可知，本發(fā)明PCR法有著較高的特異性。作為對本發(fā)明PCR法的靈敏性效果的對比，對取自成都大熊貓研究基地的50只圈養(yǎng)大熊貓新鮮糞樣，每份樣品500-600g，分別用漂浮法和本發(fā)明的方法檢測西氏貝蛔蟲蟲卵。在50份圈養(yǎng)大熊貓新鮮糞樣中，飽和硫酸鎂漂浮法總檢出率，包括初次檢測和重復檢測結(jié)果為56%。當PCR擴增使用上游引物為5’ -TTTTACCTTGGCATTTTGTC-3’，下游引物為 5’ -CTCTCAATTACTACTCAACCTCC-3’時，按照本發(fā)明所述擴增方法，對同樣的50份糞樣進行 PCR法檢測，44份樣品PCR產(chǎn)物在電泳后可觀察到較為清晰的特異性條帶，可確定為陽性，6份無任何條帶，可確定為陰性。PCR法檢測大熊貓西氏貝蛔蟲檢出率為88%。由此可見PCR 檢測法的檢出率明顯高于飽和硫酸鎂漂浮法。表1 50份大熊貓糞樣經(jīng)漂浮法后鏡檢結(jié)果及PCR檢測結(jié)果
權利要求
1.一種檢測大熊貓糞樣中西氏貝蛔蟲蟲卵的PCR法，包括設計上游引物和下游引物、 提取蟲卵DNA、PCR擴增和結(jié)果檢查四個步驟，其特征在于步驟a)所述上游引物是5，-TTTTACCTTGGCATTTTGTC-3，，下游引物是 5’ -CTCTCAATTACTACTCAACCTCC-3’，檢測基因片段長度為 291bp ；步驟b)定量糞樣用濾糞網(wǎng)過濾后取出Iml于離心管中，離心后倒掉上清液，再從糞樣中取500μ 1于離心管中，再次離心后倒掉上清液，如此反復直到離心管中的糞渣占離心管總體積的1/5 ；將離心管于沸水和液氮中交替放置lmin，經(jīng)過數(shù)次的反復充分凍融，用常規(guī)酚氯仿法提取DNA ；步驟c)利用步驟a)所述的引物擴增步驟b)提取的DNA ；步驟d) :PCR產(chǎn)物通過常規(guī)方法進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，用紫外透射儀觀察結(jié)果。
2.根據(jù)權利要求1所述的檢測大熊貓糞樣中西氏貝蛔蟲蟲卵的PCR法，其特征在于 步驟c)中PCR擴增體系為糞樣DNA模板1. 5μ 1，上下游引物各1. 5μ l，2XTaq PCR Master 混合制劑12. 5μ 1，滅菌雙蒸水8μ 1，0. 4% N, 0-雙三甲硅基乙酰胺；并按照以下程序進行 PCR擴增94-95°C變性5min后進入循環(huán)；變性溫度94_95°C，時間30s ；退火溫度48_50°C， 時間30s ；延伸溫度72°C，時間30s ；重復；35個循環(huán)后72°C最后延伸lOmin。
3.根據(jù)權利要求1-2任一權利要求所述的檢測大熊貓糞樣中西氏貝蛔蟲蟲卵的 PCR法，其特征在于，步驟a)中所述的上下游引物用以下上下游引物代替，上游引物是 5，-GAGTAAGAAGGTTGAGTATCAGTTT-3，，下游引物是 5，-ATGAATAACATCCCCAGAAGTA-3，，檢測基因片段長度為331bp。
全文摘要
本發(fā)明公開一種檢測大熊貓糞樣中西氏貝蛔蟲蟲卵的PCR法，包括設計上游引物和下游引物、提取蟲卵DNA、PCR擴增和結(jié)果檢查四個步驟。本方法在DNA抽提前處理蟲卵，以100℃沸水和液氮反復凍融的方式代替通常的研磨，可在顯微鏡下可觀察到蟲卵蛋白質(zhì)外殼破裂，使DNA暴露出來，便于抽提，盡可能減少DNA在抽提過程中的損耗。同時，本發(fā)明提供了兩種PCR擴增引物。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明方法的檢測準確性和靈敏度大大提高，其檢出率較常規(guī)方法(漂浮法)高32％-47.83％，更能準確地判斷大熊貓蛔蟲病感染情況，對于大熊貓蛔蟲病的診斷及防控均有重要意義。
文檔編號C12Q1/68GK102392079SQ20111039047
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月30日 優(yōu)先權日2011年11月30日
發(fā)明者古小彬, 周旋, 彭雪蓉, 楊光友, 王凝, 王淑賢 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學