專利名稱：副溶血弧菌的鏈置換恒溫?cái)U(kuò)增(sda)快速檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及恒溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)副溶血性弧菌的試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)是一種嗜鹽性細(xì)菌。副溶血性弧菌食物中毒，是進(jìn)食含有該菌的食物所致，主要來(lái)自海產(chǎn)品，如墨魚、海魚、海蝦、海蟹、海蜇，以及含鹽分較高的腌制食品，如咸菜、腌肉等。本菌存活能力強(qiáng)，在抹布和砧板上能生存1個(gè)月以上，海水中可存活47天。臨床上以急性起病、腹痛、嘔吐、腹瀉及水樣便為主要癥狀。本病多在夏秋季發(fā)生于沿海地區(qū)，常造成集體發(fā)病。近年來(lái)由于海鮮空運(yùn)，內(nèi)地城市病例也漸
J·日夕O副溶血性弧菌現(xiàn)有的檢測(cè)方法主要有常規(guī)分離鑒定法、普通PCR檢測(cè)法、熒光定量PCR檢測(cè)法、膠體金免疫層析試驗(yàn)法等。目前尚未見(jiàn)用鏈置換(SDA)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速、 準(zhǔn)確地檢測(cè)上述菌株的試劑盒及其檢測(cè)方法的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種副溶血性弧菌的恒溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。本發(fā)明的另一目的是提供一種副溶血性弧菌的快速檢測(cè)方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，從而為食品安全提供科學(xué)的依據(jù)和指導(dǎo)作用。本發(fā)明提供的副溶血性弧菌的恒溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)試劑盒，包括(1)模板預(yù)處理反應(yīng)液IXNEB buffer 2，1. 0 μ M上游內(nèi)引物Sl、l. 0 μ M下游內(nèi)引物S2、3% (V/V) 二甲基亞砜、和ddH20。所述IXNEB buffer 2 為50mM NaClUOmM Tris-HClUOmM MgCl2、ImM 二硫蘇糖醇、和 ddH20，pH 7. 9。所述引物Sl和S2分別如SEQ ID NO :1和2所示。(2)鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)液I :3% (V/V) 二甲基亞砜，0. lmg/mL牛血清白蛋白，濃度分別為 0. 2mM 的 dATP、dGTP 和 dTTP，1. OmM dCTP α S，1 XNEB buffer 2，和 ddH20。(3) BstDNA 聚合酶；(4)限制性內(nèi)切酶BsoBI。使用上述試劑盒檢測(cè)副溶血性弧菌的方法，包括步驟(1)待檢樣品或細(xì)菌DNA的提取提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA 0D26Q/0D28Q在1.6-2.0范圍內(nèi)，濃度在 IO-IOOng/μ L 范圍內(nèi)。(2)模板預(yù)處理程序
取模板預(yù)處理反應(yīng)液23 μ L，加入待檢DNA 2 μ L，放入94°C水浴5min后迅速放入 590C的水浴中4 ；然后94°C水浴2 和59°C水浴4 過(guò)程反復(fù)進(jìn)行6個(gè)以上循環(huán)；產(chǎn)物用作SDA模板。(3) SDA擴(kuò)增將上述預(yù)處理的25 μ L模板溶液加入24. 2 μ L鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)液 I中，95°C水浴加熱5min，溫度迅速冷卻到0°C，然后加入0. 4yL Bst DNA Polymerase與 0. 4yL BsoBI，置于59 °C水浴反應(yīng)Ih。(4)核酸凝膠電泳檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)管中加入6XLoading buffer (組分30mM EDTA ；36% (ν/ν) Glycerol ；0. 05% (w/v)Xylene Cyanol FF ；0. 05% (w/v)Bromophenol Blue),自然冷卻至室溫，用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物，IOOV電泳40分鐘，電泳成像系統(tǒng)拍照。電泳板上出現(xiàn)SObp的核酸擴(kuò)增條帶，說(shuō)明待檢樣品為陽(yáng)性，否則為陰性。本發(fā)明的試劑盒根據(jù)目標(biāo)菌株的保守基因序列設(shè)計(jì)引物，保證檢測(cè)方法的特異性。本發(fā)明采用改進(jìn)的鏈置換擴(kuò)增技術(shù)(SDA)技術(shù)，特異性強(qiáng)，具有與PCR檢測(cè)方法相似靈敏度，但不需要昂貴的PCR儀，只需普通的水浴鍋即可，檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、快速，特別適用于基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)及食品公司與相關(guān)檢測(cè)部門。


圖1:其中，1陰性對(duì)照2副溶血性弧菌樣品3副溶血性弧菌陽(yáng)性對(duì)照4 DNA Marker
具體實(shí)施例方式SDA(Strand displacement amplification)反應(yīng)是一種恒溫、酶控的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，主要依據(jù)限制性內(nèi)切酶識(shí)別并切割半硫代磷酸化DNA的未修飾鏈以形成一個(gè)切口，在具有鏈置換能力的DNA聚合酶的作用下從切口處聚合延伸并取代下游DNA鏈。被置換下的單鏈DNA再與引物結(jié)合并由DNA聚合酶延伸成雙鏈DNA。這種“切口一擴(kuò)增一置換” 不斷循環(huán)往復(fù)達(dá)到靶序列高效擴(kuò)增的目的?；谏鲜鲈?，本發(fā)明提供的副溶血性弧菌的恒溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)試劑盒，包括(1)模板預(yù)處理反應(yīng)液(所列試劑均為在模板預(yù)處理反應(yīng)液中的濃度)包括 IXNEB buffer 2，1.0μΜ 上游內(nèi)引物(Si)、1. O μ M 下游內(nèi)引物(S2)、體積比 3% DMSO(二甲基亞砜)、和ddH20。所述IXNEB buffer 2 反應(yīng)緩沖液成分為50mM NaClUOmM Tris-HClUOmM MgCl2UmM Dithiothreitol (二硫蘇糖醇)、和 ddH20、pH 7.9。副溶血性弧菌引物Sl 5' -CGACGAAGATGGTAGCTAC- CrCGGG-ATTGACGGCTACTGGTGG "3' (SEQ ID NO 1)S2 5，-GTTCGCGAAATCTAATGTT- CrCGGG-CAACGCTGACGGATAACG _3，(SEQ IDNO 2)(注其中黑體部分為與副溶血性弧菌tlh基因片段匹配的序列)(2)鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)液I 體積比3. O % DMSO, 0. lmg/mL BSA (牛血清白蛋白)，濃度分別為 0. 2mM 的 dATP、dGTP 和 dTTP，1. OmM dCTP α S (購(gòu)自 BIOLOG 公司(德國(guó))、2，_de oxyeytidine-5' -0-(1-thiotriphosphate)), 1 XNEB buffer 2, ddH20o(3) Bst DNA Polymerase (購(gòu)自 NewEnglandBiolabsLTD、鏈延伸 DNA 聚合酶、 8000U/mL)(4) BsoBI (購(gòu)自 NewEnglandBiolabsLTD、限制性內(nèi)切酶 BsoBI、10000U/mL)使用上述試劑盒檢測(cè)副溶血性弧菌的方法，包括步驟(1)待檢樣品或細(xì)菌DNA的提取提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA OD260/OD280在1. 6-2. O范圍內(nèi)，濃度在 IO-IOOng/μ L 范圍內(nèi)。(2)模板預(yù)處理程序取模板預(yù)處理反應(yīng)液23 μ L，加入待檢DNA 2 μ L，放入94°C水浴5min后迅速放入 590C的水浴中4 ；然后94°C水浴2 和59°C水浴4 過(guò)程反復(fù)進(jìn)行6個(gè)以上循環(huán)；產(chǎn)物用作SDA模板。(3) SDA擴(kuò)增將上述預(yù)處理的25 μ L模板溶液加入24. 2 μ L鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)液 I中，95°C水浴加熱5min，溫度迅速冷卻到0°C，然后加入0. 4yL Bst DNA Polymerase與 0. 4yL BsoBI，置于59 °C水浴反應(yīng)Ih。(4)核酸凝膠電泳檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)管中加入6XLoading buffer (組分30mM EDTA ；36% (ν/ν) Glycerol ；0. 05% (w/v)Xylene Cyanol FF ；0. 05% (w/v)Bromophenol Blue),自然冷卻至室溫，用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物，IOOV電泳40分鐘，電泳成像系統(tǒng)拍照。電泳板上出現(xiàn)SObp的核酸擴(kuò)增條帶，說(shuō)明待檢樣品為陽(yáng)性，否則為陰性。下列實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不應(yīng)當(dāng)作為本發(fā)明的限制。實(shí)施例(副溶血性弧菌的檢測(cè))(1)待檢樣品或細(xì)菌DNA的提取提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA OD260/OD280在1. 6-2. O范圍內(nèi)，濃度在 IO-IOOng/μ L 范圍內(nèi)。(2)模板預(yù)處理程序取模板預(yù)處理反應(yīng)液23 μ L，加入待檢樣品DNA 2 μ L，放入94°C水浴5min后迅速放入59°C的水浴中4 ；然后94°C水浴2 和59°C水浴4 過(guò)程反復(fù)進(jìn)行6個(gè)以上循環(huán)； 產(chǎn)物用作SDA模板。取2份23 μ L的模板預(yù)處理反應(yīng)液，分別加入2 μ L ddH20和副溶血性弧菌DNA，重復(fù)上述步驟，產(chǎn)物用作SDA模板，作為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照；(3) SDA擴(kuò)增將上述預(yù)處理的25 μ L模板溶液加入24. 2 μ L鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)液 I中，95°C水浴加熱5min，溫度迅速冷卻到0°C，然后加入0. 4yL Bst DNA Polymerase與 0. 4yL BsoBI，置于59 °C水浴反應(yīng)Ih。(4)核酸凝膠電泳檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)管中加入6XL0ading buffer，自然冷卻至室溫，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物，電泳40分鐘，電泳成像系統(tǒng)拍照。結(jié)果如圖1所示。說(shuō)明此檢測(cè)方法特異性強(qiáng)，快速可靠，具有簡(jiǎn)單快速的特點(diǎn)。
權(quán)利要求
1.一種副溶血性弧菌的恒溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括(1)模板預(yù)處理反應(yīng)液1XNEBbuffer 2，1. 0 μ M上游內(nèi)引物Sl、l. 0 μ M下游內(nèi)引物 S2,3% (V/V) 二甲基亞砜、和 ddH20 ；所述 IXNEB buffer 2 為50mM NaClUOmM Tris-HClUOmM MgCl2、ImM二硫蘇糖醇、和 ddH20, pH 7. 9 ；所述引物Sl和S2分別如SEQ ID NO :1和2所示；(2)鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)液I:3% (V/V) 二甲基亞砜，0. lmg/mL牛血清白蛋白，濃度分別為 0. 2mM 的 dATP、dGTP 和 dTTP，1. OmM dCTP α S，1 XNEB buffer 2，和 ddH20 ；(3)Bst DNA 聚合酶；(4)限制性內(nèi)切酶BsoBI。
2.使用權(quán)利要求1所述的試劑盒檢測(cè)副溶血性弧菌的方法，其特征在于包括步驟(1)待檢樣品或細(xì)菌DNA的提取提取待檢樣品核酸，其中提取的樣品DNA OD26tZOD28tl在1. 6-2. 0范圍內(nèi)，濃度在 IO-IOOng/μ L 范圍內(nèi)；(2)模板預(yù)處理程序取模板預(yù)處理反應(yīng)液23 μ L，加入待檢DNA 2 μ L，放入94°C水浴5min后迅速放入59°C 的水浴中4 ；然后94°C水浴2 和59°C水浴4 過(guò)程反復(fù)進(jìn)行6個(gè)以上循環(huán)；產(chǎn)物用作 SDA模板；(3)SDA擴(kuò)增將上述預(yù)處理的25μ L模板溶液加入Μ.2μ L鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)液I中， 95°C水浴加熱5min，溫度迅速冷卻到0°C，然后加入0.4yL Bst DNA聚合酶與0.4yL BsoBI，置于59°C水浴反應(yīng)Ih ；(4)核酸凝膠電泳檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束后，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；電泳板上出現(xiàn)80bp的核酸擴(kuò)增條帶，說(shuō)明待檢樣品為陽(yáng)性，否則為陰性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用依賴于鏈置換擴(kuò)增技術(shù)的副溶血弧菌恒溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。該試劑盒內(nèi)有模板預(yù)處理反應(yīng)液、鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)液Ⅰ、Bst DNA Polymerase，BsoBI。檢測(cè)副溶血弧菌的方法包括細(xì)菌DNA的提取、模板預(yù)處理、SDA鏈置換恒溫?cái)U(kuò)增、核酸檢測(cè)。其優(yōu)點(diǎn)是快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高而且成本低。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102382883SQ20111034509
公開(kāi)日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2011年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月4日
發(fā)明者宋濤, 尼秀媚, 布巖, 張京宣, 張成標(biāo), 彭青, 李偉濤, 畢建秀, 雷質(zhì)文, 魏曉棠 申請(qǐng)人:山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心