專利名稱：一種產(chǎn)生穩(wěn)定濃度梯度的微流控芯片及細(xì)胞共培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于將微流控芯片技術(shù)應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域，具體涉及一種產(chǎn)生穩(wěn)定濃度梯度的微流控芯片及細(xì)胞共培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞生物學(xué)研究正在 從對單種細(xì)胞的觀察和研究，發(fā)展到對兩種甚至多種細(xì)胞相互作用的觀察和研究。對于復(fù)雜的生物學(xué)體系，多種細(xì)胞同時(shí)存在的體系才能更好的模擬真實(shí)存在的細(xì)胞微環(huán)境，從而更全面深入的探索細(xì)胞之間的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)以及介導(dǎo)它們之間相互作用的信號(hào)通路等，對于研究機(jī)體發(fā)育、炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)，器官的功能以及腫瘤發(fā)生機(jī)制均有十分重要的意義。細(xì)胞共培養(yǎng)是目前研究細(xì)胞-細(xì)胞之間相互作用比較常用的方法。傳統(tǒng)上研究細(xì)胞共培養(yǎng)方法一般分為三類:混合共培養(yǎng)、微載體共培養(yǎng)和bodyen小室共培養(yǎng)?；旌瞎才囵B(yǎng)就是將兩種及以上的細(xì)胞混合后在孔板內(nèi)進(jìn)行共培養(yǎng)，細(xì)胞共用培養(yǎng)液，通過分泌到培養(yǎng)液中的細(xì)胞因子進(jìn)行細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用，從而影響細(xì)胞的形態(tài)、增值或者其他行為；微載體共培養(yǎng)即將一種細(xì)胞培養(yǎng)在微載體上，另一種細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)皿中，隨后將徽載體細(xì)胞電加~培養(yǎng)皿中.過一定時(shí)間即可觀察兩種細(xì)胞相互作用，但這種方法一般應(yīng)小于4小時(shí)，防止細(xì)胞從微載體遷移至培養(yǎng)皿中；bodyen小室共培養(yǎng)是一種底部由有機(jī)材料的微孔膜制成的培養(yǎng)套皿，因?yàn)榭扇苄晕镔|(zhì)可以自由通過，培養(yǎng)在套皿中的細(xì)胞可通過膜與培養(yǎng)在培養(yǎng)皿中的細(xì)胞發(fā)生相互作用。以上三種方法均存在試劑消耗量大，細(xì)胞用量多，不能方便的實(shí)現(xiàn)流體控制等諸多缺點(diǎn)。同時(shí)比較難以模擬生物體內(nèi)復(fù)雜的微環(huán)境，對于實(shí)驗(yàn)結(jié)果難以實(shí)時(shí)追蹤，只能獲得最終結(jié)果，有可能缺失重要的生物學(xué)信息。而微流控芯片技術(shù)其特有的微尺寸特征與細(xì)胞大小正好匹配，通過對芯片功能的要求自行靈活設(shè)計(jì)，在一定程度上實(shí)現(xiàn)集成特征，非常適合進(jìn)行細(xì)胞功能和細(xì)胞微環(huán)境相互作用的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種產(chǎn)生穩(wěn)定濃度梯度的微流控芯片及細(xì)胞共培養(yǎng)方法，本發(fā)明具有操作簡單、制作簡單和樣品用量少等特點(diǎn)。本發(fā)明提供了一種產(chǎn)生穩(wěn)定濃度梯度的微流控芯片，該微流控芯片由灌流通道、入口池、培養(yǎng)小室、廢液池和微通道組成；其中:灌流通道包括灌流通道A (I)、灌流通道B
(2);入口池包括樣品入口池A (3)、樣品入口池B (4)、灌流通道A入口池(5)、灌流通道B入口池(6);廢液池包括灌流通道A廢液池(7)，灌流通道B廢液池(8);培養(yǎng)小室包括培養(yǎng)小室A (9)和培養(yǎng)小室B (10);培養(yǎng)小室A和培養(yǎng)小室B左右相連形成一個(gè)細(xì)胞共培養(yǎng)單元；培養(yǎng)小室的上端與樣品入口池相連，下端連接廢液池，灌流通道與培養(yǎng)小室通過微通道相連。本發(fā)明提供的微流控芯片，所述微流控芯片由上下兩層不可逆封接而成，上層材料為PDMS聚合物，下層材料為玻璃。
本發(fā)明還提供了基于上述微流控芯片的細(xì)胞共培養(yǎng)方法，利用該芯片可以產(chǎn)生穩(wěn)定的濃度梯度，進(jìn)而進(jìn)行細(xì)胞接觸式共培養(yǎng)和/或細(xì)胞混合式共培養(yǎng)；具體步驟如下:(I)濃度梯度表征:用移液器取一定量的三維基質(zhì)膠matrigel，通過樣品入口池B和A順序加入培養(yǎng)小室B和A，將其放入37°C培養(yǎng)箱孵育20-30min，待膠凝后，向灌流通道A和B分別加入含有異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的熒光染料的培養(yǎng)液和不含有熒光染料的培養(yǎng)液，并保證以0.4 μ Ι/min流速持續(xù)灌流；(2)細(xì)胞接觸式共培養(yǎng):通過樣品入口池B將涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞(ACCM)和matrigel的混合物加入培養(yǎng)小室B，放置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)；待膠凝20-30min后，通過樣品入口池A將間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)加入培養(yǎng)小室A，放置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)；待膠凝20-30min后，灌流通道A和B中加入細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)液每天更換一次；(3)細(xì)胞混合式共培養(yǎng):將涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞(ACCM)和間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)以10:1的比例混合在matrigel中，通過樣品入口池B加入細(xì)胞混合物和matrigel,放置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，待膠凝20-30 min后,通過樣品入口池A加入不含任何細(xì)胞的matrigel,待膠凝20-30 min后，形成膠與細(xì)胞的清晰界面，然后在灌流通道A和B分別加入含有細(xì)胞趨化因子的培養(yǎng)液和不含有細(xì)胞趨化因子的培養(yǎng)液。本發(fā)明提供的 細(xì)胞共培養(yǎng)方法，所述三維基質(zhì)膠matrigel為小鼠癌組織中提取的基底膜樣物質(zhì)，低溫(0_4°C)時(shí)為液態(tài)，室溫時(shí)凝固成膠態(tài)；所述細(xì)胞趨化因子為基質(zhì)細(xì)胞衍生因子CXCL12 ;所述濃度梯度表征中，細(xì)胞共培養(yǎng)單元橫向的濃度梯度用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的右旋糖酐(FIEC-dextran,分子量為10000 Da)分子表征?？傊景l(fā)明可在一塊幾平方厘米的芯片上進(jìn)行細(xì)胞接觸式共培養(yǎng)和混合式共培養(yǎng)，同時(shí)能夠維持穩(wěn)定的細(xì)胞趨化因子的濃度梯度，從而在體外構(gòu)建腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境，有效的模擬生物體內(nèi)細(xì)胞與細(xì)胞因子，細(xì)胞與基質(zhì)、細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用。本發(fā)明具有操作簡單、制作簡單和樣品用量少等特點(diǎn)，具有重要的生物醫(yī)學(xué)研究價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。


圖1本發(fā)明微流控芯片整體結(jié)構(gòu)示意圖，其中:(1)灌流通道A，(2)灌流通道B，
(3)樣品入口池A，(4)樣品入口池B，(5)灌流通道A入口池，(6)灌流通道B入口池，(7)灌流通道A廢液池，(8)灌流通道B廢液池，(9)培養(yǎng)小室A，( 10)培養(yǎng)小室B ；
圖2顯示相鄰的兩個(gè)培養(yǎng)小室在不同灌流時(shí)刻的實(shí)際拍攝熒光圖片，其中:(a)0h;(b) 5h ; (c) 24h ；
圖3相鄰培養(yǎng)小室5 h時(shí)產(chǎn)生穩(wěn)定熒光濃度梯度及熒光強(qiáng)度分布 圖4相鄰培養(yǎng)小室24 h時(shí)能夠維持穩(wěn)定熒光濃度梯度及熒光強(qiáng)度分布 圖5芯片上細(xì)胞接觸式共培養(yǎng):兩種細(xì)胞在不同的培養(yǎng)小室中，膠凝后，兩側(cè)灌流通道均加入細(xì)胞培養(yǎng)液；
圖6芯片上細(xì)胞混合式共培養(yǎng):一側(cè)培養(yǎng)小室無細(xì)胞，一側(cè)培養(yǎng)小室加入兩種細(xì)胞混合物，形成細(xì)胞混合式共培養(yǎng)，兩側(cè)灌流通道分別加入含有細(xì)胞趨化因子的培養(yǎng)液和不含有細(xì)胞趨化因子的培養(yǎng)液；
圖7芯片上接觸式共培養(yǎng)涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞ACCM與間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs ；
圖8間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs在涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞ACCM的誘導(dǎo)作用下發(fā)生的遷移距離隨著共培養(yǎng)時(shí)間的變化柱狀圖；圖9細(xì)胞趨化因子存在的條件下，涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞ACCM的定向遷移；
圖10細(xì)胞趨化因子存在的條件下，間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs促進(jìn)涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞ACCM的定向遷移。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí) 施例將對本發(fā)明予以進(jìn)一步的說明，但并不因此而限制本發(fā)明。實(shí)施例1
所用微流控芯片為本實(shí)驗(yàn)室自行設(shè)計(jì)及制備。芯片由上下兩層不可逆封接而成，上層材料為PDMS聚合物，下層材料為玻璃。如圖1所示，灌流通道尺寸為長10 mm，寬500 μ m，高200-300 μ m (圖中黑色區(qū)域)，培養(yǎng)小室A的尺寸為直徑I mm，高120 μπι (圖中灰色區(qū)域)，培養(yǎng)小室B的尺寸為直徑I mm，高50 μπι (圖中淺灰色區(qū)域)。用移液器取5μ I的三維基質(zhì)膠Matrigel，通過樣品入口池順序加入培養(yǎng)小室B和Α，并將其放入37°C培養(yǎng)箱孵育20-30 min。待膠凝后，向灌流通道A和B分別加入含有FITC_dextran的培養(yǎng)液和不含有熒光染料的培養(yǎng)液，并保證以0.4 μ Ι/min的流速持續(xù)灌流。結(jié)果顯不在O h時(shí)在相鄰的兩個(gè)培養(yǎng)小室中未發(fā)現(xiàn)有滅光物質(zhì)存在,此時(shí)定乂為最初的起始點(diǎn)，隨著灌流通道A和B中培養(yǎng)液的引入和持續(xù)灌流；在5 h時(shí),在相鄰的兩個(gè)培養(yǎng)小室的橫向方向上形成了 FITC-dextran的濃度梯度(圖2)，其熒光強(qiáng)度的分布圖見圖3 ;在24 h時(shí)，在相鄰的兩個(gè)培養(yǎng)小室的橫向方向上依然可以穩(wěn)定的保持著FITC-dextran的濃度梯度(圖2)，其熒光強(qiáng)度的分布圖見圖4。在持續(xù)灌流的條件下，該芯片可以產(chǎn)生穩(wěn)定的濃度梯度，能夠保證下一步實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生細(xì)胞趨化因子的穩(wěn)定濃度梯度的需要。實(shí)施例2
細(xì)胞接觸式共培養(yǎng):包括細(xì)胞活體標(biāo)記、細(xì)胞加樣、細(xì)胞芯片共培養(yǎng)和拍照檢測四部分。首先，利用CellTracker Red和CellTracker Green分別對涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞ACCM和間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs進(jìn)行活體細(xì)胞染色，終濃度均采用5 μ M0染色完成后，進(jìn)行細(xì)胞消化，通過樣品入口池B將涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞ACCM和matrigel的混合物加入培養(yǎng)小室B，放置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)；待膠凝20-30 min后，通過樣品入口池A將間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs加入培養(yǎng)小室A ;放置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)；待膠凝20-30 min后，灌流通道A和B中加入細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)液每天更換一次。在O h，24 h, 48 h分別進(jìn)行拍照記錄細(xì)胞所處位置，將最初兩種細(xì)胞的相交面作為細(xì)胞遷移的起始位置。從圖片中可以看出隨著共培養(yǎng)時(shí)間的加長，間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs定向的朝著涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞ACCM所處的位置發(fā)生移動(dòng)，箭頭處明顯可見(圖7)。數(shù)據(jù)分析圖也顯示了相同的結(jié)果(圖8)。實(shí)施例3
腫瘤細(xì)胞的定向遷移:包括細(xì)胞活體標(biāo)記、細(xì)胞加樣、細(xì)胞芯片培養(yǎng)、細(xì)胞趨化因子濃度梯度生成、細(xì)胞拍照。首先，利用CellTracker Red對涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞ACCM進(jìn)行活體細(xì)胞染色，終濃度均采用5 μ M0染色完成后，進(jìn)行細(xì)胞消化。將涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞ACCM混在matrigel三維基質(zhì)膠中，通過樣品入口池B加入細(xì)胞和matrigel的混合物,放置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，待膠凝20-30 min后，通過樣品入口池A加入不含任何細(xì)胞的matrigel，待膠凝20-30 min后，可以形成膠與細(xì)胞的清晰界面，隨后通過注射泵在灌流通道A和B分別引入含有有細(xì)胞趨化因子的培養(yǎng)液和不含有細(xì)胞趨化因子的培養(yǎng)液，并保證0.4 μ 1/min的流速持續(xù)灌流?？梢钥吹诫S著培養(yǎng)時(shí)間的加長，ACCM細(xì)胞在細(xì)胞趨化因子CXCL12的作用下，發(fā)生了定向移動(dòng)。(圖9)
實(shí)施例4
細(xì)胞混合式共培養(yǎng):包括細(xì) 胞活體標(biāo)記、細(xì)胞加樣、細(xì)胞芯片共培養(yǎng)和拍照檢測四部分。首先，利用CellTracker Red和CellTracker Green分別對涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞ACCM和間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs進(jìn)行活體細(xì)胞染色，終濃度均采用5 μ M0染色完成后，進(jìn)行細(xì)胞消化。將涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞ACCM和間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs混合在matrigel三維基質(zhì)膠中，通過樣品入口池B加入細(xì)胞混合物和matrigel，放置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，待膠凝20-30 min后，通過樣品入口池A加入不含任何細(xì)胞的matrigel,待膠凝20-30 min后，可以形成膠與細(xì)胞的清晰界面，隨后通過注射泵在灌流通道A和B分別引入含有細(xì)胞趨化因子的培養(yǎng)液和不含有細(xì)胞趨化因子的培養(yǎng)液，并保證0.4 μ Ι/min的流速持續(xù)灌流?？梢钥吹?，同單獨(dú)只有細(xì)胞趨化因子CXCL12的情況下相比，涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞ACCM的遷移距離得到了較大的增加，這說明在這種共培養(yǎng)條件下，間充質(zhì)干細(xì)胞MSCs具有促進(jìn)ACCM細(xì)胞遷移能力提高的作用(圖10)。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生穩(wěn)定濃度梯度的微流控芯片，其特征在于:該微流控芯片由灌流通道、入口池、培養(yǎng)小室、廢液池和微通道組成； 其中:灌流通道包括灌流通道A (I)、灌流通道B (2)； 入口池包括樣品入口池A (3)、樣品入口池B (4)、灌流通道A入口池(5)、灌流通道B入口池(6)； 廢液池包括灌流通道A廢液池(7 )，灌流通道B廢液池(8 ); 培養(yǎng)小室包括培養(yǎng)小室A (9)和培養(yǎng)小室B (10)； 培養(yǎng)小室A和培養(yǎng)小室B左右相連形成一個(gè)細(xì)胞共培養(yǎng)單元；培養(yǎng)小室的上端與樣品入口池相連，灌流通道與培養(yǎng)小室通過微通道相連。
2.按照權(quán)利要求1所述產(chǎn)生穩(wěn)定濃度梯度的微流控芯片，其特征在于:所述微流控芯片由上下兩層不可逆封接而成，上層材料為PDMS聚合物，下層材料為玻璃。
3.關(guān)于權(quán)利要求1所述微流控芯片的細(xì)胞共培養(yǎng)方法，其特征在于:利用該芯片產(chǎn)生穩(wěn)定的濃度梯度，進(jìn)而進(jìn)行細(xì)胞接觸式共培養(yǎng)和/或細(xì)胞混合式共培養(yǎng)；具體步驟如下: (1)濃度梯度表征:用移液器取三維基質(zhì)膠matrigel，通過樣品入口池B和A順序加入培養(yǎng)小室B和A，將其放入37°C培養(yǎng)箱孵育20-30min，待膠凝后，向灌流通道A和B分別加入含有異硫氰酸熒光素FITC標(biāo)記的熒光染料的培養(yǎng)液和不含有熒光染料的培養(yǎng)液，并保證以一定的流速持續(xù)灌流； (2)細(xì)胞接觸式共培養(yǎng):通過樣品入口池B將涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞(ACCM)和matrigel的混合物加入培養(yǎng)小室B，放置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)；待膠凝20-30min后，通過樣品入口池A將間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)加入培養(yǎng)小室A，放置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)；待膠凝20-30min后，灌流通道A和B中加入細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)液每天更換一次； (3)細(xì)胞混合式共培養(yǎng):將涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞(ACCM)和間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)以10:1比例混合在matrigel中，通過樣品入口池B加入細(xì)胞混合物和matrigel,放置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，待膠凝20-30 min后，通過樣品入口池A加入不含任何細(xì)胞的matrigel，待膠凝20-30min后，形成膠與細(xì)胞的清晰界面，然后在灌流通道A和B分別加入含有細(xì)胞趨化因子的培養(yǎng)液和不含有細(xì)胞趨化因子的培養(yǎng)液。
4.按照權(quán)利要求3所述細(xì)胞共培養(yǎng)方法，其特征在于:所述三維基質(zhì)膠matrigel為小鼠癌組織中提取的基底膜樣物質(zhì)，低溫時(shí)為液態(tài)，室溫時(shí)凝固成膠態(tài)。
5.按照權(quán)利要求3所述細(xì)胞共培養(yǎng)方法，其特征在于:所述細(xì)胞趨化因子為基質(zhì)細(xì)胞衍生因子CXCL12。
6.按照權(quán)利要求3所述細(xì)胞共培養(yǎng)方法，其特征在于:所述濃度梯度表征中，細(xì)胞共培養(yǎng)單元橫向的濃度梯度用異硫氰酸熒光素標(biāo)記的右旋糖酐FIEC-dextran分子表征。
7.按照權(quán)利要求3所述細(xì)胞共培養(yǎng)方法，其特征在于:所述步驟(I)中的灌流流速為0.4 μ1/min。
8.按照權(quán)利要求6所述細(xì)胞共培養(yǎng)方法，其特征在于:所述FIEC-dextran分子的分子量為 10000 Da。
全文摘要
本發(fā)明提供一種產(chǎn)生穩(wěn)定濃度梯度的微流控芯片及細(xì)胞共培養(yǎng)方法，該微流控芯片由灌流通道、入口池、培養(yǎng)小室、廢液池和微通道組成，本發(fā)明可在一塊幾平方厘米的芯片上進(jìn)行細(xì)胞接觸式共培養(yǎng)和混合式共培養(yǎng)，同時(shí)能夠維持穩(wěn)定的細(xì)胞趨化因子的濃度梯度，從而在體外構(gòu)建腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境，有效的模擬生物體內(nèi)細(xì)胞與細(xì)胞因子，細(xì)胞與基質(zhì)、細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用，本發(fā)明具有操作簡單、制作簡單和樣品用量少等特點(diǎn)，具有重要的生物醫(yī)學(xué)研究價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N5/0775GK103087912SQ20111033133
公開日2013年5月8日 申請日期2011年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月27日
發(fā)明者秦建華, 馬慧朋 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所