專利名稱：紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因及其編碼的蛋白和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因，還涉及由該基因編碼的蛋白，以及含有所述紫花苜蓿抗旱相關(guān)基因的表達載體和細胞，同時還涉及一種培育抗旱紫花苜蓿的方法，以及紫花苜蓿抗旱相關(guān)基因及其編碼的蛋白和含有該基因的表達載體及細胞在培育抗旱能力提高的植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
紫花苜蓿是我國乃至世界上最重要的豆科牧草，被譽為“牧草之王”。紫花苜蓿在中國西北地區(qū)種植較多，而西北地區(qū)干旱、少雨的氣候特點，對作物的正常生長發(fā)育非常不利，嚴重制約了農(nóng)牧業(yè)的發(fā)展。因此，深入研究紫花苜蓿的抗旱性，對于克服該地區(qū)干旱、風(fēng)蝕等自然條件對苜蓿栽培的制約，擴大其種植范圍，提高生產(chǎn)力，具有舉足輕重的意義。在過去的幾十年里對紫花苜蓿的抗旱性研究逐步從抗旱性的鑒定方面的研究轉(zhuǎn)移到提高紫花苜蓿自身抗旱性的研究上來，尤其在近幾年或是近十幾年中的研究，紫花苜蓿的抗旱性育種以及品種改良方面的研究工作尤為突出。目前最為有效的和常用的方法還是傳統(tǒng)的輪回選擇法，即通過在原始群體中選株產(chǎn)生后代，對后代進行鑒定，再用優(yōu)良的后代重組形成新的群體以提高群體的平均表現(xiàn)。然后可以利用系譜法對新的群體選擇自交系。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，生物技術(shù)在育種中得到了廣泛地應(yīng)用。但與其他作物(如玉米、高粱等)中的研究相比，在紫花苜蓿抗旱育種中的研究還相對較少。因此，紫花苜?？购迪嚓P(guān)的分子生物學(xué)機制還有待于進一歩的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于對紫花苜?？购迪嚓P(guān)的分子生物學(xué)機制的研究，一方面提供了紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因及該基因編碼的蛋白，另ー方面還提供了含有所述紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因的表達載體和細胞，以及培育抗旱紫花苜蓿的方法，還提供了它們的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因編碼的蛋白，其中，該蛋白具有SEQ IDNo :2所示的氨基酸序列，或者該蛋白具有將SEQ ID No :2所示的氨基酸序列經(jīng)過ー個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加后仍具有抗旱活性的氨基酸序列。本發(fā)明還提供了一種紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因，其中，該基因具有SEQ IDNo 1所示的核苷酸序列，或者該基因具有編碼SEQ ID No :2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了ー種表達載體，其中，該表達載體含有本發(fā)明提供的紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因。本發(fā)明還提供了ー種轉(zhuǎn)基因細胞，其中，該轉(zhuǎn)基因細胞含有本發(fā)明提供的紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因。本發(fā)明還提供了一種培育抗旱紫花苜蓿的方法，其中，該方法包括將本發(fā)明提供的紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因?qū)氲阶匣ㄜ俎＜毎校玫娇购的芰μ岣叩淖匣ㄜ俎＜毎稗D(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明還提供了本發(fā)明提供的紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因、及其編碼的蛋白、含有所述基因的表達載體、含有所述基因的轉(zhuǎn)基因細胞在培育抗旱能力提高的植物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因(bZIP)在紫花苜蓿中被干旱逆境誘導(dǎo)表達，進而本發(fā)明的發(fā)明人通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因(bZIP)導(dǎo)入到紫花苜蓿中，結(jié)果表明紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因(bZIP)在紫花苜蓿中的表達可以顯著增強紫花苜蓿的抗旱性能。本發(fā)明從紫花苜蓿中克隆的抗旱基因為主要農(nóng)作物(特別是紫花苜蓿)的抗旱研究提供了基因資源，在基因工程改良植物的抗旱性能研究中將發(fā)揮重要作用。


圖1顯示了 bZIP基因(SEQ ID NO 1)的實時定量PCR的分析結(jié)果，結(jié)果顯示bZIP基因的表達水平能夠被干旱脅迫所誘導(dǎo)提高。圖2顯示了實施例2中進行細胞定位所用的插入有bZIP基因的pCAMBIA1302載體的結(jié)構(gòu)。圖3為將不含有目的bZIP基因的空表達載體轉(zhuǎn)入到洋蔥表皮細胞中，觀察到的亞細胞定位圖。圖4為將含有ZIP基因(SEQ ID NO 1)的表達載體轉(zhuǎn)入到洋蔥表皮細胞中，觀察到的亞細胞定位圖。 圖5顯示了實施例3中對紫花苜蓿植株進行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的bZIP基因轉(zhuǎn)化所用的插入有bZIP基因的pCAMBIA1302載體的結(jié)構(gòu)。
具體實施例方式本發(fā)明提供了一種由紫花苜蓿抗旱相關(guān)基因編碼的蛋白，其中，該蛋白具有SEQID No :2所示的氨基酸序列，或者該蛋白具有將SEQ ID No :2所示的氨基酸序列經(jīng)過ー個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加后仍具有抗旱活性的氨基酸序列。優(yōu)選情況下，該蛋白具有SEQ ID No 2所不的氣基酸序列。相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了一種紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因(bZIP)，其中，該基因具有SEQ ID No :1所示的核苷酸序列，或者該基因具有編碼SEQ IDNo :2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。優(yōu)選地，該基因具有SEQ ID No :1所示的核苷酸序列。本發(fā)明提供的紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因(bZIP)是發(fā)明人通過構(gòu)建紫花苜蓿干旱脅迫下特異表達的cDNA文庫，并從該cDNA文庫中篩選得到的。所述cDNA文庫的構(gòu)建方法包括利用30% (w/v)PEG8000對紫花苜蓿(Medicagosativa L. cv.保定苜蓿，北京中畜東方草業(yè)科技有限責(zé)任公司)進行模擬干旱處理12個小時，收獲植株，放于_80°C作為實驗組。沒有經(jīng)過干旱處理的植株為對照組。利用PCR-Selected cDNA Subtraction Kit (Clontech, Mountain View, CA, USA)構(gòu)建了紫花苜蓿干旱脅迫下特異表達的cDNA文庫。在文庫的構(gòu)建過程中，獲得了 525個單菌落并全部進行測序。經(jīng)過去除載體序列和冗余序列，最終獲得了 130條EST序列。這些序列的大小從250bp到lOOObp。其中，長度為567bp的EST序列引起了實驗者的關(guān)注，并對利用SMARTer RACE cDNA AmplificationKit(Clontech，USA)分別對該EST序列進行了 5’ RACE和3’ RACE克隆，最后獲得了該基因全長序列(SEQ IDNO :2)。其中，基因克隆的方法為分子生物學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)實驗操作，具體方法如下A.準(zhǔn)備基本液體2· Ομ I 5Χ 第一鏈緩沖液，1·0μ I DTT (20mM),1. O μ IdNTPMix(IOmM)；B.制備用于 5’ RACE 的 cDNA:2.75yl RNA,1. O μ I 5’ -CDS 弓丨物A (ACGCGACGGTTTCAACATCCCTCTC)；制備用于3’ RACE 的 cDNA:3.75yl RNA,1. O μ I 3’ -CDS 弓丨物A(GAGCTGATGCTGTGGCTGCTGGTTG)；C.將準(zhǔn)備好的液體放于72°C 3分鐘，再放于42°C冷卻2分鐘。D.向 B 中 5’ RACE 的 cDNA 中加入 I μ I 的 SMARTer IIA oligo。E.制備5’ RACE和3’ RACE的cDNA反應(yīng)液4. O μ I的步驟A得到的緩沖液，0. 25 μ IRNA 酶抑制劑(40U/ μ I)，1. O μ I SMARTScribe 逆轉(zhuǎn)錄酶(100U)。F.將步驟E中的液體加入到步驟C中，完成3’ RACE的cDNA合成反應(yīng)液的制備；將步驟E中的液體加入到步驟D中，完成5’ RACE的cDNA合成反應(yīng)液的制備。G.將制備好的反應(yīng)液放于42°C中90分鐘，最后70°C中10分鐘，完成cDNA的合成。其中，3’ RACE反應(yīng)體系為94°C 30秒，68°C 30秒，72°C 3分鐘，共30個循環(huán)。5’ RACE反應(yīng)體系為94°C 30秒，65°C 30秒，72°C 3分鐘，共40個循環(huán)。
`
取PCR產(chǎn)物于1. O (W/V) %的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，回收目的條帶，連接回收產(chǎn)物與PEGM T-Easy載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，提取質(zhì)粒并測序，測序結(jié)果顯示該基因具有SEQ ID =No 1所示的核苷酸序列(1781bp)。本發(fā)明還提供了一種表達載體，其中，該表達載體含有具有以下核苷酸序列的基因SEQ ID No :1所示的核苷酸序列，或者編碼SEQ ID No :2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。本發(fā)明提供的基因可以通過現(xiàn)有的方法構(gòu)建到表達載體中，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強啟動子或誘導(dǎo)型啟動子。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入植物選擇性標(biāo)記(如BAR基因、GUS基因、熒光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標(biāo)記物(如潮霉素、卡那霉素等)。本發(fā)明還提供了一種轉(zhuǎn)基因細胞，其中，該轉(zhuǎn)基因細胞含有具有以下核苷酸序列的基因SEQ ID No :1所示的核苷酸序列，或者編碼SEQ ID No :2所示的氨基酸序列的核苷酸序列。所述細胞可以為單子葉植物的細胞，也可以為雙子葉植物的細胞，如水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄或苜蓿等的細胞。優(yōu)選為苜蓿細胞，更優(yōu)選為紫花苜蓿細胞。本發(fā)明還提供了一種培育抗旱紫花苜蓿的方法，其中，該方法包括將具有SEQ IDNo 1所示的核苷酸的基導(dǎo)入到紫花苜蓿細胞中，得到抗旱能力提高的紫花苜蓿細胞及轉(zhuǎn)基因植株。根據(jù)本發(fā)明所述將有本發(fā)明提供的基因?qū)氲阶匣ㄜ俎＜毎械姆椒榛蚬こ填I(lǐng)域常規(guī)的方法，例如可以通過Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細胞或組織，之后將轉(zhuǎn)化的植物細胞培育成植株。本發(fā)明還提供了本發(fā)明提供的紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因、及其編碼的蛋白、含有所述基因的表達載體、含有所述基因的轉(zhuǎn)基因細胞在培育抗旱能力提高的植物中的應(yīng)用。優(yōu)選地，所述植物為紫花苜蓿。實施例1bZIP基因的實時定量PCR分析為了進一步研究從抑制差減雜交文庫中獲得的bZIP基因(SEQ ID NO :1所示的基因)的表達情況，利用實時定量PCR的方法進行了分析，具體步驟如下以50天大小的紫花苜猜植株(Medicago sativa L. cv.保定苜猜，北京中畜東方草業(yè)科技有限責(zé)任公司)為實驗材料，分別用30% (w/v)PEG 8000處理0、15、30分鐘和1、6、12、24小時，提取總RNA。5μ g的總RNA被用于第一鏈cDNA的制備，具體步驟如下首先加入 O. 5 μ I 50 μ M oligo (dT) (Invitrogen) > I μ I IOmM dNTP Mix 和 5 μ IDEPC-treated water,65°C熱激5分鐘，放于冰上冷卻I分鐘；其次，加入4 μ I 5XFirstStrand Buffer>2 μ I 0.1M dithiothreitol(DTT)、I μ I 40U/μ I RNaseOUT(Invitrogen)和 200USuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen),放于 25°C 5 分鐘、5CTC 60分鐘和70°C 15分鐘。合成的cDNA放于_20°C保存。用于 實時定量PCR的引物為引物1:5，-3，ACCAAGACTGAAAAGCCTTC引物2 :5，-3，TTCTCCATCAGTGGTCGGTG。A SYBR green reporter assay kit 被用于實時定量 PCR 反應(yīng)。Medicagotruncatula的18S rRNA被用于內(nèi)標(biāo)。對于每個基因做3次重復(fù)實驗。反應(yīng)體系如下2μ I10 X PCR buffer, 2 μ I 25mM Mg2+, 0. 5 μ I 25mM dNTP, 0. 5 μ I 10 μ M forward primer,0.5 μ I 10 μ M reverse primer,I μ I 20 X SYBR Green Master Mix (Invitrogen), 0. 2 μ I5U/y I Taq(Invitrogen, 11304-029), I μ I cDNA，最后用超純水將總體積補到 20 μ I。反應(yīng)條件如下95°C溶解DNA 2分鐘，然后進行40個循環(huán)的擴增反應(yīng)，95°C 10秒鐘，60°C 30秒鐘，70°C45秒鐘。最后用2_Λ 統(tǒng)計方法對PCR結(jié)果進行分析。結(jié)果如圖1所示。從圖1的結(jié)果可以看出，bZIP基因(SEQ ID NO 1)的表達水平能夠被干旱脅迫所誘導(dǎo)提聞。實施例2bZIP基因的亞細胞定位植物表達載體的構(gòu)建I) RNA提取(Trizol法提取)，2)反轉(zhuǎn)錄(M-MLV, promega公司)，3) PCR擴增以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用Taq酶做PCR，將設(shè)計好的酶切位點(NcoI和SpeI)連入PCR產(chǎn)物，4) PCR產(chǎn)物和載體進行酶切處理，5)酶切產(chǎn)物連接，載體結(jié)構(gòu)如圖2所示。轉(zhuǎn)化大腸桿菌進行檢測，利用基因槍，將不含有目的bZIP基因的空表達載體轉(zhuǎn)入到洋蔥表皮細胞，觀察其亞細胞定位(如圖3所示)；利用基因槍，將含有目的基因的載體導(dǎo)入到洋蔥表皮細胞中，觀察其亞細胞定位(如圖4所示)。圖3中，通過A和B的比較可以看出，不含有目的bZIP基因的空表達載體在細胞的各部分均有表達；而通過圖4中A和B的比較可以看出，含有ZIP基因(SEQ ID NO 1)的表達載體僅在細胞核中表達。實施例3農(nóng)桿菌介導(dǎo)的bZIP基因轉(zhuǎn)化紫花苜蓿植株一、材料與試劑1、植物材料供試苜猜品種為紫花苜猜(Medicago sativa L. cv.保定苜猜,北京中畜東方草業(yè)科技有限責(zé)任公司)。發(fā)芽7天的無 菌苗子葉為遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料。2、農(nóng)桿菌菌株和質(zhì)粒載體所用的農(nóng)桿菌菌株為根癌農(nóng)桿菌GV3103(北京天恩澤基因科技有限公司)，農(nóng)桿
菌培養(yǎng)基
權(quán)利要求
1.一種由紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因編碼的蛋白，其特征在于，該蛋白具有SEQ ID No2所示的氨基酸序列，或者該蛋白具有將SEQ ID No :2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加后仍具有抗旱活性的氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白，其中，該蛋白具有SEQID No :2所示的氨基酸序列。
3.一種紫花苜蓿抗旱相關(guān)基因，其特征在于，該基因具有SEQ ID No :1所示的核苷酸序列，或者該基因具有編碼SEQ ID No :2所不的氣基酸序列的核昔酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其中，該基因具有SEQID No :1所示的核苷酸序列。
5.—種表達載體,其特征在于,該表達載體含有權(quán)利要求3所述的基因。
6.一種轉(zhuǎn)基因細胞，其特征在于，該轉(zhuǎn)基因細胞含有權(quán)利要求3所述的基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因細胞，其中，所述轉(zhuǎn)基因細胞為紫花苜蓿轉(zhuǎn)基因細胞。
8.一種培育抗旱紫花苜蓿的方法，其特征在于，該方法包括將權(quán)利要求3所述的基因?qū)氲阶匣ㄜ俎＜毎?，得到抗旱能力提高的紫花苜蓿細胞及轉(zhuǎn)基因植株。
9.權(quán)利要求1所述的蛋白、權(quán)利要求3所述的基因、權(quán)利要求5所述的表達載體、權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)基因細胞在培育抗旱能力提高的植物中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中，所述植物為紫花苜蓿。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種由紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因編碼的蛋白，其中，該蛋白具有SEQ ID No2所示的氨基酸序列，或者該蛋白具有將SEQ ID No2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加后仍具有抗旱活性的氨基酸序列。本發(fā)明還涉及該蛋白的編碼基因，以及含有該基因的表達載體和細胞，同時還涉及一種培育抗旱紫花苜蓿的方法和它們的應(yīng)用。本發(fā)明提供的紫花苜?？购迪嚓P(guān)基因(bZIP)在紫花苜蓿中的表達可以顯著增強紫花苜蓿的抗旱性能。該基因的發(fā)現(xiàn)為主要農(nóng)作物的抗旱研究提供了基因資源，在基因工程改良植物的抗旱性能研究中將發(fā)揮重要作用。
文檔編號C12N15/09GK103044534SQ201110310769
公開日2013年4月17日 申請日期2011年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月14日
發(fā)明者王涌鑫, 鄭彥, 劉濤, 張路培, 苗麗宏, 李聰 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所