專利名稱：一種用于診斷遲發(fā)性耳聾的GJB2基因p.V37I突變診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體地說，是一種用于診斷遲發(fā)性耳聾的GJB2基因 P.V37I突變診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
聽力是語言發(fā)育過程中不可缺少的因素之一。對患有兒童永久性聽力損失 (Permanent Childhood Hearing Impairment，PCHI)的患兒進(jìn)行早期的預(yù)防和干預(yù)可取得良好的言語和認(rèn)知發(fā)育。目前，普遍性新生兒聽力篩查(Universal Newborn Hearing Screening, UNHS)可早期發(fā)現(xiàn)新生兒期的聽力損失，但對于發(fā)生于新生兒期以后的遲發(fā)性耳聾(發(fā)病率在9歲兒童中約為0. 25%。-0. 99%。)，由于缺乏有效的風(fēng)險因素評估和早期識別標(biāo)識，尚缺乏有效的早期發(fā)現(xiàn)手段。新生兒聽力篩查技術(shù)在世界各國廣泛開展，可通過此篩查早期發(fā)現(xiàn)新生兒期聽力損失并進(jìn)行早期干預(yù)，以避免新生聾兒由聽力障礙而帶來的言語、語言等發(fā)育障礙。但發(fā)生于新生兒期以后的遲發(fā)性耳聾不能被新生兒聽力篩查所發(fā)現(xiàn)，目前尚缺乏能夠早期預(yù)警或早期發(fā)現(xiàn)的有效手段。遲發(fā)型耳聾的最初發(fā)現(xiàn)目前主要依靠家長對患兒聽力狀況的觀測或患者自我檢測，發(fā)現(xiàn)時間較晚，容易因為聽力損失影響言語、語言等學(xué)習(xí)交流能力的正常發(fā)展。耳聾基因檢測技術(shù)近十年來已在國內(nèi)外得到廣泛應(yīng)用，可對遺傳性耳聾進(jìn)行有效檢測和診斷。遲發(fā)性耳聾基因檢測原理上可對存在遲發(fā)性耳聾遺傳風(fēng)險的患兒進(jìn)行早期預(yù)警，結(jié)合聽力篩查以達(dá)到早期檢測、干預(yù)和康復(fù)的目的。但此方法的瓶頸在于目前尚不知曉明確的可導(dǎo)致常見遲發(fā)性耳聾遺傳易感性的早期分子標(biāo)識(基因突變)，因此無法有針對性的開展遲發(fā)性耳聾基因檢測。GJB2基因為中國人群常見聾病基因，其基因突變可導(dǎo)致隱性遺傳性耳聾。在GJB2 基因眾多突變中，P. V37I突變較為常見，帶有p. V37I排它性突變(包括p. V37I純合，以及 P.V37I與另外一個功能喪失突變的復(fù)合雜合兩種基因型)的個體易出現(xiàn)輕中度耳聾。中國專利文獻(xiàn)CN101363054A公開了一種體外檢測遺傳性耳聾相關(guān)縫隙連接蛋白 26基因GJB2突變的方法及檢測用試劑盒，通過進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，對GJB2基因基礎(chǔ)啟動區(qū)、外顯子1、外顯子2及剪切區(qū)域進(jìn)行完整擴(kuò)增，然后進(jìn)行DNA序列測定，檢測GJB2基因突變的存在，能提高GJB2基因突變的檢出率和GJB2基因相關(guān)性遺傳性耳聾的診斷率。中國專利文獻(xiàn)CN1873027A公開了一種用于體外診斷非綜合征性常染色體隱性遺傳耳聾基因GJB2 突變的引物及其應(yīng)用，提供用于體外診斷非綜合征性常染色體隱性遺傳耳聾基因GJB2基因全編碼區(qū)突變及233-235delC熱點突變的引物，可一次性完成GJB2全編碼區(qū)和兩側(cè)重要剪切序列的擴(kuò)增，該發(fā)明還提供含有該引物和ApaI內(nèi)切酶的試劑盒或類似產(chǎn)品，適用于對非綜合征性常染色體隱性遺傳耳聾基因GJB2基因突變進(jìn)行大規(guī)模的篩查及診斷、遺傳咨詢。李景之等運用PCR直接測序的方法對139例無親緣關(guān)系的NSHL患者進(jìn)行突變篩查，將兩種突變P. F115C和p. V37I構(gòu)建到pEGFP表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，研究其細(xì)胞表達(dá)和定位情況(詳見非綜合征性耳聾(NSHL)患者Cx26基因突變分析及兩種突變體的亞細(xì)胞定位.遺傳，2009，31 (7): 705-712.)。但是國際、國內(nèi)尚無關(guān)于p. V37I排它性突變與遲發(fā)性耳聾相互關(guān)聯(lián)的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種GJB2基因p. V37I突變的應(yīng)用。本發(fā)明的再一的目的是，提供一種用于診斷遲發(fā)性耳聾的GJB2基因p. V37I突變診斷試劑盒。本發(fā)明的另一的目的是，提供一種用于診斷遲發(fā)性耳聾的GJB2基因p. V37I突變診斷試劑盒的應(yīng)用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種GJB2基因p. V37I突變在制備診斷遲發(fā)性耳聾產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述的P. V37I突變是p. V37I排他性突變。所述的p. V37I排他性突變是p. V37I純合基因型突變。所述的p. V37I排他性突變是p. V37I與一個功能喪失突變的復(fù)合雜合基因型突變。為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種用于診斷遲發(fā)性耳聾的 GJB2基因p. V37I突變診斷試劑盒，所述的試劑盒含有兩對巢式PCR擴(kuò)增引物，所述的擴(kuò)增引物為
第一輪 PCR 的引物GJB2 FO (SEQ ID N0.3)*GJB2 RO (SEQ ID NO. 4);第二輪 PCR 的引物GJB2 FI (SEQ ID N0.5)fPGJB2 RI (SEQ ID NO. 6)。所述的試劑盒還包括dNTP、DNA聚合酶及其緩沖液。為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是所述的試劑盒在制備診斷遲發(fā)型耳聾產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點在于
1、本發(fā)明于國際、國內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)與遲發(fā)性耳聾高度相關(guān)的常見分子標(biāo)識漢/a 基因 p. V37I排它性突變，并確立了基于該分子標(biāo)識的基因篩查方法及其在新生兒篩查中的優(yōu)先應(yīng)用范圍；
2、通過對遲發(fā)性耳聾常見遺傳易感性早期分子標(biāo)識的發(fā)現(xiàn)和相關(guān)應(yīng)用性研究，可將由￠/ 基因P. V37I排它性突變所引起的遲發(fā)性耳聾預(yù)警時間提前至新生兒期，可廣泛應(yīng)用于遺傳易感性遲發(fā)性耳聾早期檢測、干預(yù)和康復(fù)，聾病基因篩查及診斷、遲發(fā)性耳聾聽力-基因聯(lián)合篩查及相關(guān)研究領(lǐng)域。


附圖1是巢式PCR擴(kuò)增示意圖。附圖2是￠/ 基因所有外顯子PCR擴(kuò)增的條件。附圖3是巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳效果圖。附圖4是GJB2基因p. V37I純合突變。附圖5和附圖6是GJB2基因p. V37I排他性突變。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的具體實施方式
作詳細(xì)說明。實施例1
￠/ 基因為中國人群常見聾病基因，其基因突變可導(dǎo)致隱性遺傳性耳聾。在￠/ 基因眾多突變中，P. V37I突變較為常見，帶有p. V37I排它性突變(包括p. V37I純合，以及 P.V37I與另外一個功能喪失突變的復(fù)合雜合兩種基因型)的個體易出現(xiàn)輕中度耳聾。所述的￠/ 基因的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的p.V37I突變表示GJB2氨基酸序列的第37位由纈氨酸(V)突變?yōu)楫惲涟彼?I)，見SEQ ID NO. 2。p. V37I排他性突變包括p. V37I純合(體細(xì)胞一對基因均攜帶p. V37I突變)，以及 P.V37I與另外一個功能喪失突變的復(fù)合雜合(體細(xì)胞一對基因一個攜帶p. V37I突變，另一個攜帶可導(dǎo)致GJB2基因功能喪失的其它突變)兩種基因型，該基因型特點為所有有功能的 GJB2基因都帶有p. V37I突變，即p. V37I排它性突變。通過超過1000例樣本的研究，本發(fā)明首先發(fā)現(xiàn)p. V37I在中國人群中的攜帶率為 6.1% (ri=3032，見表1)，是目前所發(fā)現(xiàn)的最常見的耳聾基因突變位點。既往研究顯示，當(dāng)個體攜帶￠/ 基因P. V37I排它性突變時，其產(chǎn)生輕中度聽力下降的可能性大大增加，且部分病例表現(xiàn)為進(jìn)行性聽力下降。本發(fā)明研究過程中，假設(shè)并證明了 ￠/ 基因P. V37I排他性突變與遲發(fā)性耳聾相關(guān)，可作為早期分子標(biāo)識來進(jìn)行遲發(fā)性耳聾風(fēng)險評估和基因預(yù)警，過程如下
通過門診和21427例上海地區(qū)幼兒園兒童篩查，共收集45例可疑或確診的中國人群遲發(fā)性耳聾病例。確診病例定義為出生時雙側(cè)耳新生兒聽力篩查通過，在9歲前發(fā)展為雙側(cè)遲發(fā)性耳聾(聽力較好耳PTA在0. 5k、lk、2k以及4 kHz平均聽閾彡40 dBHL)，(n=14，年齡2-9歲，平均發(fā)病年齡5. 0歲);非確診病例組定義為出生時未行新生兒聽力篩查，在5歲或以后出現(xiàn)雙側(cè)PCHI (n=31，平均發(fā)病年齡8歲，年齡5_12歲)。GJB2基因突變檢測通過PCR擴(kuò)增及雙向測序檢測。GJB2基因p. V37I排他性突變在確定病例組發(fā)生率為21. 4% (3/14)，非確診病例組發(fā)生率為19. 4%(6/14)，在對照組中，1516例新生兒中發(fā)生率為0. 4% (6/1516)，詳見下表1。 表1 p. V37I排他性突變在各人群中的攜帶率
權(quán)利要求
1.一種GJB2基因p. V37I突變在制備診斷遲發(fā)性耳聾產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特征在于，所述的p. V37I突變是p. V37I排他性突變。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的p.V37I排他性突變是p. V37I純合基因型突變。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的p.V37I排他性突變是p. V37I與一個功能喪失突變的復(fù)合雜合基因型突變。
4.一種用于診斷遲發(fā)性耳聾的GJB2基因p. V37I突變診斷試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒含有兩對巢式PCR擴(kuò)增引物，所述的擴(kuò)增引物為第一輪 PCR 的引物GJB2 FO (SEQ ID N0.3)*GJB2 RO (SEQ ID NO. 4);第二輪 PCR 的引物GJB2 FI (SEQ ID N0.5)fPGJB2 RI (SEQ ID NO. 6)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括dNTP、DNA聚合酶及其緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求4和5任一所述的試劑盒在制備診斷遲發(fā)型耳聾產(chǎn)品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種GJB2基因p.V37I突變在制備診斷遲發(fā)性耳聾產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述的p.V37I突變是p.V37I排他性突變。本發(fā)明還提供一種用于診斷遲發(fā)性耳聾的GJB2基因p.V37I突變診斷試劑盒及其應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點在于于國際、國內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)與遲發(fā)性耳聾高度相關(guān)的常見分子標(biāo)識GJB2基因p.V37I排它性突變，并確立了基于該分子標(biāo)識的基因篩查方法及其在新生兒篩查中的優(yōu)先應(yīng)用范圍；可將由GJB2基因p.V37I排它性突變所引起的遲發(fā)性耳聾預(yù)警時間提前至新生兒期，廣泛應(yīng)用于遺傳易感性遲發(fā)性耳聾早期檢測、干預(yù)和康復(fù)，聾病基因篩查及診斷、遲發(fā)性耳聾聽力-基因聯(lián)合篩查及相關(guān)研究領(lǐng)域。
文檔編號C12Q1/68GK102304584SQ20111027342
公開日2012年1月4日 申請日期2011年9月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月15日
發(fā)明者吳皓, 楊濤 申請人:上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院