專利名稱：小蔓長春花細胞大規(guī)模培養(yǎng)生成長春胺的方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物工程技術領域，涉及一種小蔓長春花細胞大規(guī)模培養(yǎng)生成長春胺的方法。
背景技術：
小蔓長春花(Vinca minor Linn.)夾竹桃科多年生草本。以全草入藥。分布于歐洲東南部、中部和中亞地區(qū)。1978年從南斯拉夫引進，先后在北京、浙江溫州及山東濰坊等地引種成功。對腦血管引起的各種癥狀如偏癱、失語癥、老年性腦退化等都有治療作用。長春胺是由夾竹桃科植物小蔓性長春花中提得的一種生物堿，為一種腦血管擴張劑，適用于腦血管障礙、腦栓塞、腦血栓形成及出血后遺癥等。對腦動脈硬化癥的療效比氫麥角堿和罌粟堿強。長春西汀為腦血管擴張藥，對大腦血管有選擇性作用，能改善大腦氧的供給。并有改善記憶力、視力和老年聽力等作用。然而目前我國長春胺原料全部依賴進口、并已持續(xù)多年，一旦國內(nèi)解決了提取長春胺的植物來源問題，長春胺產(chǎn)品市場將迎來高速增長。如果能夠使長春胺的生產(chǎn)擺脫對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的依賴，避免從天然小蔓長春花中提取這一過程的局限，同時又保持其產(chǎn)品的天然產(chǎn)物特性，占用相比于大田種植極小的土地及空間，實現(xiàn)對該類生物堿集約型的工廠化生物生產(chǎn)，對促進該類生物堿在醫(yī)藥、保健等領域的開發(fā)與應用，將會具有重大的現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術中存在的問題，利用植物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)技術，提供一種小蔓長春花細胞大規(guī)模培養(yǎng)生成長春胺的方法。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的一種小蔓長春花細胞大規(guī)模培養(yǎng)生成長春胺的方法，其特征在于包括如下步驟
1)分別制備固體生長培養(yǎng)基、液體生長培養(yǎng)基取MS基本培養(yǎng)基，以每升加入 0. 00Γ0. 002克萘乙酸和6 7克瓊脂粉為單位，得固體生長培養(yǎng)基備用；另取MS基本培養(yǎng)基，以每升加入0.00Γ0. 002克萘乙酸為單位，得液體生長培養(yǎng)基備用；
2)小蔓長春花細胞系的制備以長春花葉片為外植體，將其用濃度為709Γ75%醫(yī)用乙醇浸泡30秒，隨后轉移至濃度為109Γ12%的次氯酸鈉水溶液中進行表面消毒；將消毒后的外植體播種于固體生長培養(yǎng)基中，在溫度為25+l°C下，經(jīng)4周飛周暗培養(yǎng)后，外植體的切口處形成愈傷組織；將得到的愈傷組織繼續(xù)在所述固體生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 25+l0C，3周、周繼代一次，培養(yǎng)10代后，得松軟愈傷組織；將所述松軟愈傷組織繼續(xù)繼代培養(yǎng)纊10代，得細胞系；
3)長春胺的制備將步驟2所得細胞系作為種源，接種于液體生長培養(yǎng)基中擴增，培養(yǎng)條件為溫度25+l°C、暗培養(yǎng)、搖床轉速15(Γ170轉/分鐘或螺旋葉輪轉速100轉/分鐘、培養(yǎng)8天 10天，得種子細胞；將所得種子細胞在所述液體生長培養(yǎng)基中接種，接種量為6 15%W/ V，繼續(xù)培養(yǎng)7天 12天，培養(yǎng)條件為溫度25+1V、暗培養(yǎng)、搖床轉速150轉/分鐘 170轉/ 分鐘或螺旋葉輪轉速100轉/分鐘；隨后從所得培養(yǎng)液中提取獲得生物堿長春胺。將步驟1中所述固體生長培養(yǎng)基、液體生長培養(yǎng)基分別經(jīng)高壓滅菌后，調(diào)節(jié)pH值至 5. 7 5. 8。將步驟1中所述固體基本培養(yǎng)基、液體生長培養(yǎng)基分別經(jīng)高壓滅菌后，用HCl或 NaOH或兩者結合調(diào)節(jié)固體生長培養(yǎng)基、液體生長培養(yǎng)基的pH值至5. 7 5. 8。將步驟1中所述固體生長培養(yǎng)基、液體生長培養(yǎng)基分別分裝于反應器中備用。所述反應器的容積為0. 2升 1000升，所述反應器中固體生長培養(yǎng)基、液體生長培養(yǎng)基的體積分別占反應器容積的259Γ80%。本發(fā)明的有益效果是(一)生產(chǎn)過程完全可控，不受自然環(huán)境的影響；(二)無農(nóng)藥及重金屬殘留；(三)提取工藝簡單；(四)低成本，節(jié)約大量耕地。本發(fā)明以小蔓長春花葉片為原始材料，對外植體進行誘導培養(yǎng)，建立并篩選出了適合通過二步細胞培養(yǎng)法生產(chǎn)長春胺，并建立了懸浮培養(yǎng)系。該方法有培養(yǎng)周期短、產(chǎn)率高、對環(huán)境無污染等特點。小蔓長春花通過反應器生產(chǎn)長春胺現(xiàn)在沒有先例，通過本發(fā)明方法實現(xiàn)了將小蔓長春花通過反應器生產(chǎn)長春胺，解決了我國長春胺原料全部依賴進口的現(xiàn)狀。
具體實施例方式本發(fā)明一種小蔓長春花細胞大規(guī)模培養(yǎng)生成長春胺的方法，包括如下步驟
1)分別制備固體生長培養(yǎng)基、液體生長培養(yǎng)基取MS基本培養(yǎng)基，以每升加入 0.00廣0.002克萘乙酸和6 7克瓊脂粉為單位，得固體生長培養(yǎng)基備用；另取MS基本培養(yǎng)基，以每升加入0. 00Γ0. 002克萘乙酸為單位，得液體生長培養(yǎng)基備用；
2)小蔓長春花細胞系的制備以長春花葉片為外植體，將其用濃度為709Γ75%醫(yī)用乙醇浸泡30秒，隨后轉移至濃度為109Γ12%的次氯酸鈉水溶液中進行表面消毒；將消毒后的外植體播種于固體生長培養(yǎng)基中，在溫度為25+l°C下，經(jīng)4周飛周暗培養(yǎng)后，外植體的切口處形成愈傷組織；將得到的愈傷組織繼續(xù)在所述固體生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 25+l0C，3周、周繼代一次，培養(yǎng)10代后，得松軟愈傷組織；將所述松軟愈傷組織繼續(xù)繼代培養(yǎng)纊10代，得細胞系；
3)長春胺的制備將步驟2所得細胞系作為種源，接種于液體生長培養(yǎng)基中擴增，培養(yǎng)條件為溫度25+l°C、暗培養(yǎng)、搖床轉速15(Γ170轉/分鐘或螺旋葉輪轉速100轉/分鐘、培養(yǎng) 8天 10天，得種子細胞；將所得種子細胞在所述液體生長培養(yǎng)基中接種，接種量為6 15%W/ V，繼續(xù)培養(yǎng)7天 12天，培養(yǎng)條件為溫度25+1V、暗培養(yǎng)、搖床轉速150轉/分鐘 170轉/ 分鐘或螺旋葉輪轉速100轉/分鐘；隨后從所得培養(yǎng)液中提取獲得生物堿長春胺。將步驟1中所述固體生長培養(yǎng)基、液體生長培養(yǎng)基分別經(jīng)高壓滅菌后，調(diào)節(jié)pH值至 5. 7 5. 8。將步驟1中所述固體基本培養(yǎng)基、液體生長培養(yǎng)基分別經(jīng)高壓滅菌后，用HCl或 NaOH或兩者結合調(diào)節(jié)固體生長培養(yǎng)基、液體生長培養(yǎng)基的pH值至5. 7 5. 8。將步驟1中所述固體生長培養(yǎng)基、液體生長培養(yǎng)基分別分裝于反應器中備用。所述反應器的容積為0. 2升 1000升，所述反應器中固體生長培養(yǎng)基、液體生長培養(yǎng)基的體積分別占反應器容積的259Γ80%。下面就具體實施例對本發(fā)明作進一步闡述。實施例一
本實施例包括如下步驟。1)分別制備固體生長培養(yǎng)基、液體生長培養(yǎng)基取MS基本培養(yǎng)基，以每升加入 0. 001克萘乙酸和6克瓊脂粉為單位，得固體生長培養(yǎng)基備用；另取MS基本培養(yǎng)基，以每升加入0. 001克萘乙酸為單位，得液體生長培養(yǎng)基備用。生長培養(yǎng)基調(diào)ρΗ值用ρΗ計測定固體生長培養(yǎng)基、液體生長培養(yǎng)基ρΗ值，并用 HCl和NaOH分別調(diào)節(jié)固體生長培養(yǎng)基和液體生長培養(yǎng)基的ρΗ值到5. 8。然后以三角瓶作為反應器，將固體生長培養(yǎng)基、液體生長培養(yǎng)基分別分裝于容積為0. 2升的三角瓶中，每瓶裝0. 05升生長培養(yǎng)基，即生長培養(yǎng)基的體積占反應器容積的25%，用棉花和紙封口后，進行高壓滅菌，壓力為1. 0 1. 2Kg/cm2,時間為20分鐘，備用。以下不同步驟中所提到的生長培養(yǎng)基，分別取自上述步驟1中分裝于三角瓶的生長培養(yǎng)基。2)小蔓長春花細胞系的制備
以長春花葉片為外植體，將其用濃度為70%醫(yī)用乙醇浸泡30秒，隨后轉移至濃度為10% 的次氯酸鈉水溶液中進行表面消毒；
將消毒后的外植體播種于固體生長培養(yǎng)基中，在溫度為25°C下，經(jīng)4周暗培養(yǎng)后，外植體的切口處形成愈傷組織；
將得到的愈傷組織繼續(xù)在固體生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25°C，3周繼代一次，培養(yǎng)10代后，得松軟愈傷組織；
將所得松軟愈傷組織繼續(xù)繼代培養(yǎng)8代，得細胞系；
3)長春胺的制備將步驟2所得細胞系作為種源，在超凈工作臺中接種于上述步驟1 中的液體生長培養(yǎng)基中擴增，培養(yǎng)條件為溫度25°C、暗培養(yǎng)、搖床轉速150轉/分鐘、培養(yǎng) 9天，得種子細胞；將所得種子細胞在液體生長培養(yǎng)基中接種，接種量(以細胞鮮重計)為 6%ff/V,繼續(xù)培養(yǎng)7天，培養(yǎng)條件為溫度25°C、暗培養(yǎng)、搖床轉速150轉/分鐘；隨后從所得培養(yǎng)液中提取獲得生物堿長春胺。實施例二
本實施例包括如下步驟。1)分別制備固體生長培養(yǎng)基、液體生長培養(yǎng)基取MS基本培養(yǎng)基，以每升加入 0. 002克萘乙酸和7克瓊脂粉為單位，得固體生長培養(yǎng)基備用；另取MS基本培養(yǎng)基，以每升加入0. 002克萘乙酸為單位，得液體生長培養(yǎng)基備用。生長培養(yǎng)基調(diào)ρΗ值用ρΗ計測定固體生長培養(yǎng)基、液體生長培養(yǎng)基ρΗ值，并用 HCl調(diào)節(jié)生長培養(yǎng)基ρΗ值到5. 8。然后以三角瓶作為反應器，將固體生長培養(yǎng)基、液體生長培養(yǎng)基分別分裝于容積為0. 5升的三角瓶中，每瓶裝0. 2升，即生長培養(yǎng)基的體積占反應器容積的40%，用棉花和紙封口后，進行高壓滅菌，壓力為1. 0 1. 2Kg/cm2,時間為20分鐘， 備用。以下不同步驟中所提到的生長培養(yǎng)基，分別取自上述步驟1中分裝于三角瓶的生長培養(yǎng)基。2)小蔓長春花細胞系的制備
以小蔓長春花葉片為外植體，將其用濃度為75%醫(yī)用乙醇浸泡30秒，隨后轉移至濃度為11 %的次氯酸鈉水溶液中進行表面消毒；
將消毒后的外植體播種于固體生長培養(yǎng)基中，在溫度為下，經(jīng)4周暗培養(yǎng)后，外植體的切口處形成愈傷組織；
將得到的愈傷組織繼續(xù)在固體生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為M°C，4周繼代一次，培養(yǎng)10代后，得松軟愈傷組織；
將所得松軟愈傷組織繼續(xù)繼代培養(yǎng)10代，得細胞系；
3)長春胺的制備將步驟2所得細胞系作為種源，在超凈工作臺中接種于上述步驟1 中的液體生長培養(yǎng)基中擴增，培養(yǎng)條件為溫度M°C、暗培養(yǎng)、搖床轉速160轉/分鐘、培養(yǎng) 8天，得種子細胞；將所得種子細胞在液體生長培養(yǎng)基中接種，接種量(以細胞鮮重計)為 10%W/V，繼續(xù)培養(yǎng)7天，培養(yǎng)條件為溫度M°C、暗培養(yǎng)、搖床轉速170轉/分鐘；隨后從所得培養(yǎng)液中提取獲得生物堿長春胺。實施例三
本實施例包括如下步驟。1)分別制備固體生長培養(yǎng)基、液體生長培養(yǎng)基取MS基本培養(yǎng)基，以每升加入 0. 0015克萘乙酸和6克瓊脂粉為單位，得固體生長培養(yǎng)基備用；另取MS基本培養(yǎng)基，以每升加入0. 0015克萘乙酸為單位，得液體生長培養(yǎng)基備用。生長培養(yǎng)基調(diào)pH值用pH計測定固體生長培養(yǎng)基、液體生長培養(yǎng)基pH值，并用 NaOH調(diào)節(jié)生長培養(yǎng)基pH值到5. 7。然后以三角瓶作為反應器，將固體生長培養(yǎng)基、液體生長培養(yǎng)基分別分裝于容積為3升的三角瓶中，每瓶裝0. 8升，即生長培養(yǎng)基的體積占反應器容積的沈.7%，用棉花和紙封口后，進行高壓滅菌，壓力為1. 0 1. Ig/cm2，時間為20分鐘， 備用。以下不同步驟中所提到的生長培養(yǎng)基，分別取自上述準備工作中分裝于三角瓶的生長培養(yǎng)基。2)小蔓長春花細胞系的制備
以長春花葉片為外植體，將其用濃度為73%醫(yī)用乙醇浸泡30秒，隨后轉移至濃度為1 的次氯酸鈉水溶液中進行表面消毒；
將消毒后的外植體播種于固體生長培養(yǎng)基中，在溫度為^TC下，經(jīng)5周暗培養(yǎng)后，外植體的切口處形成愈傷組織；
將得到的愈傷組織繼續(xù)在固體生長培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為26°C，4周繼代一次，培養(yǎng) 10代后，得松軟愈傷組織；
將所得松軟愈傷組織繼續(xù)繼代培養(yǎng)9代，得細胞系；
3)長春胺的制備將步驟2所得細胞系作為種源，在超凈工作臺中接種于上述步驟1 中的液體生長培養(yǎng)基中擴增，培養(yǎng)條件為溫度^rc、暗培養(yǎng)、搖床轉速170轉/分鐘、培養(yǎng) ο天，得種子細胞；將所得種子細胞在液體生長培養(yǎng)基中接種，接種量(以細胞鮮重計)為 8%ff/V,繼續(xù)培養(yǎng)10天，培養(yǎng)條件為溫度、暗培養(yǎng)、搖床轉速150轉/分鐘；隨后從所得培養(yǎng)液中提取獲得生物堿長春胺。本發(fā)明最終大規(guī)模培養(yǎng)反應器的培養(yǎng)灌超過10升時，必須具備補料灌(大規(guī)模培養(yǎng)反應器包括培養(yǎng)灌和補料灌)，補料灌為反應器總容量的259Γ80%，連續(xù)放大培養(yǎng)需按照 4飛倍體積遞增，即10升-50升-250升-1000升(10升-50升，為5倍；50升-250升，為 5倍；250升-1000升，為4倍)。在培養(yǎng)的最終一級如1000升，要配備800升的補料灌以備加入生產(chǎn)培養(yǎng)基之需。生產(chǎn)培養(yǎng)一般只在最終培養(yǎng)的一級進行。實施例四
本實施例包括如下步驟。1)分別制備固體生長培養(yǎng)基、液體生長培養(yǎng)基取MS基本培養(yǎng)基，以每升加入 0. 0015克萘乙酸和6克瓊脂粉為單位，得固體生長培養(yǎng)基備用；另取MS基本培養(yǎng)基，以每升加入0. 0015克萘乙酸為單位，得液體生長培養(yǎng)基備用。生長培養(yǎng)基調(diào)pH值用pH計測定固體生長培養(yǎng)基、液體生長培養(yǎng)基pH值，并用 NaOH調(diào)節(jié)生長培養(yǎng)基pH值到5. 7。分別將5L生長培養(yǎng)基置于IOL規(guī)格培養(yǎng)罐和8L規(guī)格補料灌中滅菌，滅菌結束后，調(diào)節(jié)罐體即培養(yǎng)灌及補料灌的出氣閥，以保證罐及管路中的氣體正壓。2)小蔓長春花細胞系的制備
以長春花葉片為外植體，將其用濃度為73%醫(yī)用乙醇浸泡30秒，隨后轉移至濃度為1 的次氯酸鈉水溶液中進行表面消毒；
將消毒后的外植體播種于固體生長培養(yǎng)基中，在溫度為^TC下，經(jīng)5周暗培養(yǎng)后，外植體的切口處形成愈傷組織；
將得到的愈傷組織繼續(xù)在固體生長培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為26°C，4周繼代一次，培養(yǎng) 10代后，得松軟愈傷組織；
將所得松軟愈傷組織繼續(xù)繼代培養(yǎng)9代，得細胞系；
3)長春胺的制備將步驟2所得細胞系作為種源，在上述步驟1中的液體生長培養(yǎng)基中擴增，得種子細胞，將所得種子細胞在液體生長培養(yǎng)基中接種，接種量為15% W/V，進行培養(yǎng)，溫度26°C，通氣速率0. 5vvm，攪拌速度(螺旋葉輪)100轉/分鐘，黑暗，培養(yǎng)12天， 當PCV達到75%以上，細胞生長達到指數(shù)末期時取樣，提取生物堿。實施例五
本實施例包括如下步驟。1)分別制備固體生長培養(yǎng)基、液體生長培養(yǎng)基取MS基本培養(yǎng)基，以每升加入 0. 002克萘乙酸和7克瓊脂粉為單位，得固體生長培養(yǎng)基備用；另取MS基本培養(yǎng)基，以每升加入0. 002克萘乙酸為單位，得液體生長培養(yǎng)基備用。生長培養(yǎng)基調(diào)pH值用pH計測定固體生長培養(yǎng)基、液體生長培養(yǎng)基pH值，并用 NaOH和HCl調(diào)節(jié)生長培養(yǎng)基pH值到5. 8。分別將300L生長培養(yǎng)基置于500L規(guī)格培養(yǎng)罐和200L培養(yǎng)基置于300L規(guī)格補料灌中滅菌，滅菌結束后，調(diào)節(jié)罐體(即培養(yǎng)灌及補料灌)出氣閥，以保證罐及管路中的氣體正壓。2)小蔓長春花細胞系的制備
以長春花葉片為外植體，將其用濃度為75%醫(yī)用乙醇浸泡30秒，隨后轉移至濃度為11% 的次氯酸鈉水溶液中進行表面消毒；
將消毒后的外植體播種于固體生長培養(yǎng)基中，在溫度為下，經(jīng)4. 5周暗培養(yǎng)后，外植體的切口處形成愈傷組織；
將得到的愈傷組織繼續(xù)在固體生長培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為M°C，3. 5周繼代一次，培養(yǎng)10代后，得松軟愈傷組織；
將所得松軟愈傷組織繼續(xù)繼代培養(yǎng)10代，得細胞系；3)長春胺的制備將步驟2所得細胞系作為種源，在上述步驟1中的液體生長培養(yǎng)基中擴增，得種子細胞，將所得種子細胞在液體生長培養(yǎng)基中接種，接種量為14% W/V，進行培養(yǎng)，溫度M°C，通氣速率0. 5vvm，攪拌速度(螺旋葉輪)100轉/分鐘，黑暗，培養(yǎng)11天， 當PCV達到75%以上，細胞生長達到指數(shù)末期時取樣，提取生物堿。實施例六
本實施例包括如下步驟。1)分別制備固體生長培養(yǎng)基、液體生長培養(yǎng)基取MS基本培養(yǎng)基，以每升加入 0. 002克萘乙酸和7克瓊脂粉為單位，得固體生長培養(yǎng)基備用；另取MS基本培養(yǎng)基，以每升加入0. 002克萘乙酸為單位，得液體生長培養(yǎng)基備用。生長培養(yǎng)基調(diào)pH值用pH計測定固體生長培養(yǎng)基、液體生長培養(yǎng)基pH值，并用 HCl調(diào)節(jié)生長培養(yǎng)基pH值到5. 8。分別將550L生長培養(yǎng)基置于1000L規(guī)格培養(yǎng)罐和450L 培養(yǎng)基置于500L規(guī)格補料灌中滅菌，滅菌結束后，調(diào)節(jié)罐體(即培養(yǎng)灌及補料灌)出氣閥，以保證罐及管路中的氣體正壓。2)小蔓長春花細胞系的制備
以長春花葉片為外植體，將其用濃度為74%醫(yī)用乙醇浸泡30秒，隨后轉移至濃度為1 的次氯酸鈉水溶液中進行表面消毒；
將消毒后的外植體播種于固體生長培養(yǎng)基中，在溫度為^TC下，經(jīng)4周暗培養(yǎng)后，外植體的切口處形成愈傷組織；
將得到的愈傷組織繼續(xù)在固體生長培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為26°C，4周繼代一次，培養(yǎng) 10代后，得松軟愈傷組織；
將所得松軟愈傷組織繼續(xù)繼代培養(yǎng)8代，得細胞系；
3)長春胺的制備將步驟2所得細胞系作為種源，在上述步驟1中的液體生長培養(yǎng)基中擴增，得種子細胞，將所得種子細胞在液體生長培養(yǎng)基中接種，接種量為13% W/V，進行培養(yǎng)，溫度M°C，通氣速率0. 5vvm，攪拌速度(螺旋葉輪)100轉/分鐘，黑暗，培養(yǎng)10天， 當PCV達到75%以上，細胞生長達到指數(shù)末期時取樣，提取生物堿。
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權利要求
1.一種小蔓長春花細胞大規(guī)模培養(yǎng)生成長春胺的方法，其特征在于包括如下步驟1)分別制備固體生長培養(yǎng)基、液體生長培養(yǎng)基取MS基本培養(yǎng)基，以每升加入 0. 00Γ0. 002克萘乙酸和6 7克瓊脂粉為單位，得固體生長培養(yǎng)基備用；另取MS基本培養(yǎng)基，以每升加入0.00Γ0. 002克萘乙酸為單位，得液體生長培養(yǎng)基備用；2)小蔓長春花細胞系的制備以長春花葉片為外植體，將其用濃度為709Γ75%醫(yī)用乙醇浸泡30秒，隨后轉移至濃度為109Γ12%的次氯酸鈉水溶液中進行表面消毒；將消毒后的外植體播種于固體生長培養(yǎng)基中，在溫度為25+l°C下，經(jīng)4周 5周暗培養(yǎng)后，外植體的切口處形成愈傷組織；將得到的愈傷組織繼續(xù)在所述固體生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 25+l0C，3周、周繼代一次，培養(yǎng)10代后，得松軟愈傷組織；將所述松軟愈傷組織繼續(xù)繼代培養(yǎng)纊10代，得細胞系；3)長春胺的制備將步驟2所得細胞系作為種源，接種于液體生長培養(yǎng)基中擴增，培養(yǎng)條件為溫度25+l°C、暗培養(yǎng)、搖床轉速15(Γ170轉/分鐘或螺旋葉輪轉速100轉/分鐘、培養(yǎng) 8天 10天，得種子細胞；將所得種子細胞在所述液體生長培養(yǎng)基中接種，接種量為6 15%W/ V，繼續(xù)培養(yǎng)7天 12天，培養(yǎng)條件為溫度25+1V、暗培養(yǎng)、搖床轉速150轉/分鐘 170轉/ 分鐘或螺旋葉輪轉速100轉/分鐘；隨后從所得培養(yǎng)液中提取獲得生物堿長春胺。
2.根據(jù)權利要求1所述的小蔓長春花細胞大規(guī)模培養(yǎng)生成長春胺的方法，其特征在于將步驟1中所述固體生長培養(yǎng)基、液體生長培養(yǎng)基分別經(jīng)高壓滅菌后，調(diào)節(jié)PH值至 5. 7 5. 8。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的小蔓長春花細胞大規(guī)模培養(yǎng)生成長春胺的方法，其特征在于將步驟1中所述固體基本培養(yǎng)基、液體生長培養(yǎng)基分別經(jīng)高壓滅菌后，用HCl或NaOH 或兩者結合調(diào)節(jié)固體生長培養(yǎng)基、液體生長培養(yǎng)基的PH值至5. 7 5. 8。
4.根據(jù)權利要求1所述的小蔓長春花細胞大規(guī)模培養(yǎng)生成長春胺的方法，其特征在于將步驟1中所述固體生長培養(yǎng)基、液體生長培養(yǎng)基分別分裝于反應器中備用。
5.根據(jù)權利要求4所述的小蔓長春花細胞大規(guī)模培養(yǎng)生成長春胺的方法，其特征在于所述反應器的容積為0. 2升 1000升，所述反應器中固體生長培養(yǎng)基、液體生長培養(yǎng)基的體積分別占反應器容積的259Γ80%。
全文摘要
本發(fā)明為一種小蔓長春花細胞大規(guī)模培養(yǎng)生成長春胺的方法。本發(fā)明以野生小蔓長春花葉片為原始材料誘導出愈傷組織，經(jīng)過多代定向誘導馴化，建立了適合大規(guī)模培養(yǎng)細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，該培養(yǎng)物和小蔓長春花葉片中長春胺含量相當。本發(fā)明的優(yōu)點是(一)生產(chǎn)過程完全可控，不受自然環(huán)境的影響；(二)無農(nóng)藥及重金屬殘留；(三)提取工藝簡單；(四)低成本，節(jié)約大量耕地。
文檔編號C12P17/18GK102367460SQ20111021458
公開日2012年3月7日 申請日期2011年7月29日 優(yōu)先權日2011年7月29日
發(fā)明者倪新忠, 倪迪安 申請人:無錫維開敏生物科技有限公司