專利名稱：家蠅對擬除蟲菊酯類殺蟲劑代謝抗性的分子檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及家蠅對擬除蟲菊酯類代謝抗性的分子檢測方法，適合用于家蠅對擬除蟲菊酯類殺蟲劑由CYP6D1V1介導的代謝抗性的快速檢測，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
家蠅(Musca domestica)是一種重要的疾病傳媒,據(jù)報道它可以傳播100多種人畜疾病。家蠅也是重要的畜牧業(yè)害蟲，家蠅的發(fā)生可以導致畜禽產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量的降低。因此家蠅種群的控制對于人類的健康和國民經(jīng)濟的發(fā)展都具有十分重要的意義。家蠅的防治長期以來主要依賴化學農(nóng)藥，抗藥性問題突出?？顾幮詫е職⑾x劑殺蟲效率的下降，由此引發(fā)諸如殺蟲劑使用次數(shù)和劑量增加，蟲媒人畜疾病的流行等問題已給人類帶來巨大損失。擬除蟲菊酯殺蟲劑(如溴氰菊酯)已廣泛用于家蠅的防治，家蠅對這類殺蟲劑普 遍產(chǎn)生了抗性?？顾幮缘臋z測是科學制定有效的防治措施的前提，對減少化學藥劑對環(huán)境的污染和合理制定抗藥性治理具有重要的指導意義。家蠅對擬除蟲菊酯類的抗性的檢測常采用生物測定，這種方法存在如下缺點(I)試驗周期長一般需要24小時以上才能得到結(jié)果；(2)對試蟲的數(shù)量和質(zhì)量要求高為保證生測結(jié)果的準確性，需要使用特定生理狀態(tài)的試蟲；(3)難于檢測早期抗性和預測抗性的發(fā)展趨勢生物測定的方法只能記錄殺蟲劑劑量和試蟲死亡率的信息,而無法測定個體的基因型。近年來，隨著對家蠅抗藥性抗性分子機制的了解，國內(nèi)外開始嘗試家蠅抗性的分子檢測技術(shù)的研究。研究表明，細胞色素P450介導的代謝解毒作用增強是家蠅對擬除蟲菊酯類抗性的主要機制。在高抗性的家蠅品系如美國的LPR品系和中國的BJD品系，抗性都與家蠅的CYP6Dlvl等位基因相關(guān)聯(lián)，CYP6Dlvl抗性等位基因的序列特點是其5’啟動子區(qū)存在一段15bp的插入片段。進一步的研究結(jié)果表明CYP6Dlvl這一等位基因在美國和中國的自然家蠅種群中也普遍存在。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是針對目前家蠅對擬除蟲菊酯類殺蟲劑代謝抗性檢測方法的周期長、對試蟲的數(shù)量和質(zhì)量要求高，難于檢測早期抗性和預測抗性的發(fā)展趨勢的不足，提供一種高效、快速、對材料要求低、需要生物材料少的家蠅由細胞色素P450 CYP6Dlvl介導的對擬除蟲菊酯類殺蟲劑代謝抗性的分子檢測方法，從而能夠有效殺蠅，減少傳染疾病的傳播。針對上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下—方面，本發(fā)明提供一種家蠅對擬除蟲菊酯類殺蟲劑代謝抗性分子檢測方法，該方法包括以下步驟步驟I :單頭豕妮基因組DNA的提取；步驟2 :家蠅CYP6Dlvl抗性等位基因的分子檢測。優(yōu)選地，所述家蠅CYP6Dlvl抗性等位基因的序列如SEQ ID NO : I的序列所示。
優(yōu)選地，所述步驟2中通過PCR擴增進行CYP6Dlvl抗性等位基因分子檢測。優(yōu)選地，所述PCR擴增中所用的特異引物為qxh6dlF 5/ -ATTTGCCCCGTCATTTACAA-3'qxh6dlR 5/ -GCCGGCTTGAAGAACAAATA-3'。另一方面，本發(fā)明提供一種用于家蠅對擬除蟲菊酯類殺蟲劑代謝抗性分子檢測的試劑盒，所述試劑盒包括單頭家蠅基因組DNA提取的試劑；及家蠅CYP6Dlvl抗性等位基因分子檢測的試劑。優(yōu)選地，所述家蠅CYP6Dlvl抗性等位基因的序列如SEQ ID NO : I的序列所示。優(yōu)選地，用于對家蠅CYP6Dlvl抗性等位基因的分子檢測的試劑包括以下特異引物 qxh6dlF 5/ -ATTTGCCCCGTCATTTACAA-3'qxh6dlR 5/ -GCCGGCTTGAAGAACAAATA-3'。再一方面，本發(fā)明提供一種用于家蠅對擬除蟲菊酯類殺蟲劑代謝抗性檢測的試劑盒在家蠅對擬除蟲菊酯類殺蟲劑代謝抗性分子檢測中的應(yīng)用。本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)有如下優(yōu)點本發(fā)明建立的抗性分子檢測技術(shù)與傳統(tǒng)生物測定相比具有如下優(yōu)點⑴需要生物材料少，數(shù)量在50-200頭就可以滿足檢測要求；(2)對材料的要求低可以采用任何蟲態(tài)的試蟲，可以用活體，也可以用保存的樣品，可以用整頭家蠅，也可以用蟲體的某一部位(如雙翅)；(3)可以區(qū)分種群的雜/純合狀態(tài)有利預測種群抗性基因頻率的變化趨勢，便于抗性的早期診斷；(4)快速從DNA的提取到PCR產(chǎn)物的檢測，數(shù)小時就可以完成。本發(fā)明提供了的方法準確性高運用限制性內(nèi)切酶對DNA序列設(shè)計的特異性，結(jié)果的準確性高。


以下，結(jié)合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方案，其中圖I為單頭家蠅PCR擴增的試驗結(jié)果示意圖，圖中1-6為PCR擴增的樣品，M為DNA分子量標記(DNA Marker)；圖2為單頭家蠅CYP6Dlvl抗性等位基因檢測的試驗結(jié)果示意圖，圖中SS為敏感純合子；SR為雜合子；RR為抗性純合子⑷為IOObp DNA分子量標記(DNA Marker)；圖3為北京自然種群家蠅樣品CYP6Dlvl抗性等位基因檢測的試驗結(jié)果示意圖，圖中1-10為樣品，M為IOObp DNA分子量標記(DNA Marker)；圖4為吉林長春自然種群家蠅樣品CYP6Dlvl抗性等位基因檢測的試驗結(jié)果示意圖，圖中1-10為檢測樣品，M為IOObp DNA分子量標記(DNAMarker)；圖5為山東濟南自然種群家蠅樣品CYP6Dlvl抗性等位基因檢測的試驗結(jié)果示意圖，圖中1-15為檢測樣品，M為IOObp DNA分子量標記(DNAMarker)。
具體實施例方式實施例I 單頭家蠅基因組DNA的提取(參考 Rinkevich FD et al. Frequencies of the pyrethroid resistancealleles of Vsscland CYP6Dlin house flies from the eastern United States. InsectMolecular Biology (2006)，15 (2)，157-167)本發(fā)明所用家蠅分別為實驗室保存的擬除蟲菊酯類殺蟲劑敏感純合品系(SS)、抗性純合品系(RR基因型)、敏感與抗性品系的雜交一代雜合子(SR基因型)，前述家蠅品系為BJD系，均可得自中國科學院動物研究所(北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院-5號)，以及分別采自山東、北京與吉林的野生家蠅，也可得自中國科學院動物研究所。I.單頭家蠅基因組DNA的提取方法(參考Rinkevich et al 2006)(I)取單頭家蠅(去腹部)置于1.5mL體積的離心管(印pendorf管)中，加入
0.5mL裂解緩沖液，碾磨將蟲體搗碎，置60度溫浴，20分鐘后取出；(2)加75 μ L的8Μ醋酸鉀，混勻，置冰上10分鐘； (3) 14000g離心5min，取400 μ L上清液(避免取到沉淀)轉(zhuǎn)至新的離心管；(4)加入800 μ L (上清液的2倍體積)100%冰冷乙醇，室溫放置IOmin ；(5)離心10分鐘，棄上清，沉淀用0. 5mL70%乙醇清洗；(6)離心5分鐘,沉淀干燥后,加入50 μ L水重溶。制備的DNA樣品可直接用于后續(xù)的PCR，也可以將樣品保存在4°C下備用，或在-20°C條件下長期保存。以上方法中使用的試劑配制方法如下(I)溶液A :含 IOOmM Tris HCl pH 8. O, IOmM EDTA, 50mM NaCl (高壓滅菌，室溫保存)；(2) 0. 15M 精胺(spermine)(過濾滅菌，分裝保存在 _20°C ) ； (Fluka 公司)(3) 0. 5M亞精胺(spermidine)(過濾滅菌,分裝保存在_20°C ) ； (Fluka公司)(4) 20mg/mL蛋白酶K(過濾滅菌,分裝保存在-20°C ) ； (Merck公司)(5)10% SDS，用溶液A配制，無須滅菌；(6) 8M醋酸鉀(室溫保存，IOOmL水中溶解醋酸鉀78. 51g)；(7)裂解緩沖液(現(xiàn)配現(xiàn)用):為溶液A含I % SDS ；0. 15mM精胺，O. 5mM亞精胺和
0.lmg/mL(20U/mg)蛋白酶 K。實施例2 CYP6Dlvl抗件等位基因檢測采用PCR-RFLP方法，分兩步，第一步為PCR，第二步酶切。(I)設(shè)計特異引物qxh6dlF 5/ -ATTTGCCCCGTCATTTACAA-3' (SEQ ID NO :3)qxh6dlR 5/ -GCCGGCTTGAAGAACAAATA-3' (SEQ ID NO :4)。(2) PCR PCR 反應(yīng)體系 20 μ L，含 IOxbuffer 2. O μ L, dNTP(各 2. 5mM 混合物)1.5 μ L，引物(10 μ Μ) qxh6dlF O. 5 μ L，qxh6dlR 0. 5 μ L ;家蠅基因組 DNA 2μ L ； Taq SIO. 5μ L(tiangen)，滅菌水 8· 5μ L。PCR 條件94°C 3min，30 循環(huán) 94°C 30s, 57°C 30s, 72°C45s)，延伸72°C 5min。取5yL PCR產(chǎn)物2. 0%瓊脂糖凝膠檢測，在約470bp處有條帶(圖I)。⑶酶切取 2_δμ L 的 DNA 產(chǎn)物，加 Buffer 4 (New England BioLabs) 2. O μ L,Hpy188 III (New England BioLabs) 0. 2 μ L, 100X BSA (New England BioLabs) 0. 2 μ L,加滅菌水至20 μ L，37°C溫育1-2小時。取10 μ L酶切產(chǎn)物在2. 0%瓊脂糖凝膠電泳，紫外檢測。
(4)結(jié)果解讀如圖2所示,如果在476bp—條帶,為抗性純合，即家蠅CYP6Dlvl抗性等位基因(如SEQ ID N0:1所示);如果在476bp、328bp、133bp有三條帶，為雜合型；如果在328bp和133bp有條帶，為敏感基因型(如SEQ ID NO 2所示)。具體試駘實施例試駘實施例I取北京自然種群家蠅樣品1-10按上述實施例所述方法進行檢測，如圖3所示，除7號樣品為雜合體外，其它樣品為敏感純合個體。試駘實施例2取吉林長春自然種群家蠅樣品1-10，并以實驗室保存的擬除蟲菊酯類殺蟲劑純合品系(SS)、抗性純合品系(RR基因型)、敏感與抗性品系的雜交一代雜合子(SR基因型)為 對照，按上述實施例所述方法進行檢測，如圖4所示,樣品2、3、4、6、8、9、13、14、15為敏感純合基因型個體；樣品1、5、7、10、11、12位雜合基因型個體。試駘實施例3取山東濟南自然種群家蠅樣品1-10按上述實施例所述方法進行檢測，并以實驗室保存的擬除蟲菊酯類殺蟲劑純合品系(SS)、抗性純合品系(RR基因型)、敏感與抗性品系的雜交一代雜合子(SR基因型)為對照，如圖5所示，所有檢測的山東樣品為敏感(SS)純
口 4^ ο
權(quán)利要求
1.一種家蠅對擬除蟲菊酯類殺蟲劑代謝抗性分子檢測方法，該方法包括以下步驟 步驟I :單頭家蠅基因組DNA的提??； 步驟2 :家蠅CYP6Dlvl抗性等位基因的分子檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分子檢測方法，其特征在于，所述家蠅CYP6Dlvl抗性等位基因的序列如SEQ ID NO I的序列所不。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟2中通過PCR擴增進行CYP6Dlvl抗性等位基因分子檢測。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分子檢測方法，其特征在于，所述PCR擴增中所用的特異引物為qxh6dlF 5/ -ATTTGCCCCGTCATTTACAA-3'qxh6dlR 5/ -GCCGGCTTGAAGAACAAATA-3'。
5.一種用于家蠅對擬除蟲菊酯類殺蟲劑代謝抗性分子檢測的試劑盒，所述試劑盒包括單頭家蠅基因組DNA提取的試劑；及家蠅CYP6Dlvl抗性等位基因分子檢測的試劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述家蠅CYP6Dlvl抗性等位基因的序列如SEQ ID NO 1的序列所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的試劑盒，其特征在于，用于對家蠅CYP6Dlvl抗性等位基因的分子檢測的試劑包括以下特異引物qxh6dlF 5/ -ATTTGCCCCGTCATTTACAA-3'qxh6dlR 5/ -GCCGGCTTGAAGAACAAATA-3'。
8.權(quán)利要求5至7任一項所述的試劑盒在家蠅對擬除蟲菊酯類殺蟲劑代謝抗性分子檢測中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種家蠅對擬除蟲菊酯類殺蟲劑代謝抗性分子檢測方法及試劑盒，所述方法包括以下步驟單頭家蠅基因組DNA的提?。患蚁塁YP6D1v1抗性等位基因的分子檢測；所述試劑盒包括單頭家蠅基因組DNA提取的試劑；及家蠅CYP6D1v1抗性等位基因分子檢測的試劑。本發(fā)明的方法需要生物材料少；對材料的要求低；可以區(qū)分種群的雜/純合狀態(tài)有利預測種群抗性基因頻率的變化趨勢，便于抗性的早期診斷；快速、準確。
文檔編號C12Q1/68GK102899391SQ20111021197
公開日2013年1月30日 申請日期2011年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月27日
發(fā)明者邱星輝, 李梅, 邸妙詞, 潘婧, 周云輝 申請人:中國科學院動物研究所