專利名稱：一種微小rna及其前體和反義核酸在調(diào)節(jié)過(guò)氧化氫酶活性中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)專業(yè)領(lǐng)域，涉及用于調(diào)節(jié)過(guò)氧化氫酶活性的微小 RNA(miRNA)、其前體和其反義寡核苷酸序列，以及它們?cè)陬A(yù)防和治療心血管疾病等一系列老年性疾病和減輕炎癥反應(yīng)中的用途。
背景技術(shù)：
微小RNA(microRNA，miRNA)，是一種長(zhǎng)度為22nt左右的單鏈非編碼RNA，它們通過(guò)影響信使RNA的穩(wěn)定性來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。miRNA最早在線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)，1993年Lee等發(fā)現(xiàn) lin-4通過(guò)互補(bǔ)的RNA-RNA相互作用來(lái)調(diào)節(jié)lin_14的翻譯，最終影響線蟲(chóng)的發(fā)育。到目前為止，在各個(gè)物種中都發(fā)現(xiàn)了 miRNA，而其功能也不斷為人們所揭示。這些 miRNA廣泛存在于各種生物體中，參與細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、代謝以及個(gè)體發(fā)育過(guò)程。不少研究工作證明，miRNA在線蟲(chóng)、果蠅和哺乳動(dòng)物等物種之間存在高度的保守性，加之線蟲(chóng)的整個(gè)發(fā)育過(guò)程中各個(gè)細(xì)胞的來(lái)源以及命運(yùn)都已經(jīng)被清楚的闡釋，因而在研究miRNA的工作中，線蟲(chóng)作為一種成熟的模式生物被廣泛應(yīng)用。目前對(duì)大部分miRNA的生物功能還知之甚少，對(duì)各種miRNA表達(dá)以及功能的進(jìn)一步研究是十分必要的。線蟲(chóng)作為一種模式生物，其生物學(xué)背景清楚而且各種突變體種類齊全。與其他哺乳動(dòng)物相比，秀麗線蟲(chóng)生命周期短，只有3周左右，最常用的是秀麗隱桿線蟲(chóng) (Caenorhabdiris elegans)，其成蟲(chóng)長(zhǎng)約1mm，全身透明，在25°C下壽命約為2周，20°C下壽命約為3周，主要以雌雄同體形式存在。因此，在抗氧化酶和衰老的研究中，線蟲(chóng)有很大優(yōu)勢(shì)。當(dāng)今普遍認(rèn)為，細(xì)胞正常代謝過(guò)程中不斷產(chǎn)生的自由基，隨著年齡的增加，細(xì)胞內(nèi)氧自由基不斷積累，而自由基可以引起DNA損傷，還可使細(xì)胞中的多種物質(zhì)發(fā)生氧化，損害生物膜，此外還能夠使蛋白質(zhì)、核酸等大分子交聯(lián)，影響其正常功能，最終使相應(yīng)的組織和器官的功能喪失，產(chǎn)生一系列衰老的癥狀。自由基的衰老學(xué)說(shuō)為神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病等老年性疾病以及炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展提供了理論依據(jù)。在許多炎癥反應(yīng)以及心血管疾病等老年性疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，氧自由基均起了促進(jìn)疾病進(jìn)一步發(fā)展惡化的作用。 2000年的science報(bào)道，給線蟲(chóng)飼喂SOD/catalase類似物可以延長(zhǎng)線蟲(chóng)的壽命。因此，研究開(kāi)發(fā)能夠降低細(xì)胞內(nèi)氧自由基水平的藥物具有極大的應(yīng)用前景。超氧化物歧化酶(SOD)是廣泛存在于各種生物體中的超氧自由基清除因子，它可以把有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫，然后由過(guò)氧化氫酶(catalase)將過(guò)氧化氫分解為水和氧氣。線蟲(chóng)的過(guò)氧化氫酶有三種，在染色體上按如下順序排列ctl-3，ctl-l，ctl-2， 三者的上下游都存在DAF-16的結(jié)合基序，是DAF-16的下游靶基因，同時(shí)三者在序列上也極其相似。ctl-1和ctl-3具有相同的3’ UTR, ctl-1主要在胞質(zhì)中起作用。ctl_2則主要在過(guò)氧化物酶體中起作用，ctl-3主要在線蟲(chóng)咽部的肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)。有研究報(bào)道，單獨(dú)缺失ctl-1不會(huì)影響線蟲(chóng)的壽命以及其產(chǎn)卵的能力；單獨(dú)ctl-2的突變使原本長(zhǎng)壽的clk-Ι線蟲(chóng)的最大壽命縮短，但平均壽命不變，同時(shí)使該線蟲(chóng)的產(chǎn)卵期提前。此外，該種ctl-2缺失突變體的生長(zhǎng)發(fā)育受到顯著影響，并且出現(xiàn)早老現(xiàn)象，產(chǎn)卵能力下降，過(guò)氧化物酶體的形態(tài)異常等現(xiàn)象。在線蟲(chóng)中SOD有五種異構(gòu)體，sod-Ι和sod-2在繁殖階段分別編碼細(xì)胞質(zhì)的銅鋅SOD和錳S0D，其中sod-Ι對(duì)總的SOD活性起主要的調(diào)節(jié)作用。sod-5和 sod-3分別編碼銅鋅SOD和錳S0D，但這兩種基因所編碼的異構(gòu)體比較少而且只起輔助補(bǔ)充作用，在dauer幼蟲(chóng)階段表達(dá)才顯著升高。編碼細(xì)胞外銅鋅SOD的sod-4基因可以延長(zhǎng)缺失daf-2線蟲(chóng)的壽命。同時(shí)有實(shí)驗(yàn)證明過(guò)氧化氫水平升高會(huì)加強(qiáng)過(guò)表達(dá)sod-Ι的線蟲(chóng)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明中使用的縮寫(xiě)和術(shù)語(yǔ)含義如下所示RT-PCR =Real time polymerase chain reaction，實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；miRNA :microRNA，微小 RNATrizol 總 RNA 抽提試劑DEPC :diethylprocarbonate，二乙基焦碳酸酯。DEPC水在水中加入千分之一濃度的DEPC，在攪拌器上攪拌至完全溶解，120°C高壓滅菌30分鐘。daf-2 胰島素樣受體基因3，UTR :3，Untranslating region，信使 RNA 3，端非翻譯區(qū)FUDR :floxuridine，5-氟尿苷因此，本發(fā)明的目的是，提供一種微小RNA及其前體和反義核酸在調(diào)節(jié)過(guò)氧化氫酶活性中的用途。本發(fā)明提供的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明提供一種微小RNA及其前體和反義核酸在調(diào)節(jié)過(guò)氧化氫酶活性中的用途， 其中所述微小RNA為包含以下序列的核苷酸或者其生物活性功能片段或變體5' -AGGCAA GAUGUUGGCAUAGCUGA-3‘ (SEQ. ID. No. 1)。優(yōu)選地，所述微小RNA前體為包含以下序列的核苷酸或者其生物活性功能片段或變體(SEQ. ID. No. 2)5 ‘ -AGGUCCC⑶CAGAGCUAGGCAAGAUGUUGGCAUAGCUGAAU GAUCGCUAUAACAACUAUCAGCU UCGCCACAUUCUGCCACGCACUG AU⑶GAGGACCU-3‘。優(yōu)選地，所述微小RNA反義核酸為包含以下序列的核苷酸或者其生物活性功能片段或變體(SEQ. ID. No. 3)5' -TCAGCTATGCCAACATCTTGCCT-3‘。優(yōu)選地，所述微小RNA及其前體和反義核酸可以進(jìn)行以下修飾硫代或甲氧基取代。優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)過(guò)氧化氫酶活性中，通過(guò)過(guò)表達(dá)微小RNA或其前體而降低過(guò)氧
化氫酶活性。優(yōu)選地，所述調(diào)節(jié)過(guò)氧化氫酶活性中，通過(guò)微小RNA反義核酸抑制微小RNA或其前體表達(dá)而增強(qiáng)過(guò)氧化氫酶活性?？梢?jiàn)，本發(fā)明以線蟲(chóng)為材料進(jìn)行miRNA分子的克隆分析。首先采用網(wǎng)上的分析數(shù)據(jù)庫(kù)尋找能夠同時(shí)結(jié)合線蟲(chóng)ctl-1/3和ctl-2基因3’UTR的miRNA。然后通過(guò)實(shí)時(shí)定量熒光PCR的方法檢測(cè)線蟲(chóng)中的SEQl的存在(見(jiàn)圖1實(shí)時(shí)定量熒光PCR結(jié)果)。通過(guò)RT-PCR 檢測(cè)在SEQl (-/")株系中SEQl表達(dá)量極低，說(shuō)明在該株系中SEQl敲除成果，SEQl幾乎不表達(dá)。。miRNA是由miRNA前體RNA分子在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)酶加工后形成的成熟體，經(jīng)過(guò)基因序列的同源分析，本發(fā)明獲得了該miRNA相應(yīng)的前體RNA序列。此外針對(duì)miRNA序列設(shè)計(jì)合成了其反義寡核苷酸序列，并分析了該miRNA對(duì)線蟲(chóng)生長(zhǎng)以及抗氧化能力的影響(見(jiàn)圖2)。線蟲(chóng)具有三種過(guò)氧化氫酶，而人只有一種過(guò)氧化氫酶，本發(fā)明所提供的這一類 miRNA具有相似的5’端種子序列GGCAAGA，在線蟲(chóng)中能夠同時(shí)抑制三種過(guò)氧化氫酶信使RNA 的翻譯，進(jìn)而抑制過(guò)氧化氫酶的活性。線蟲(chóng)的許多基因以及miRNA在果蠅和人中具有保守性，與SEQl同源的人miRNA在人的過(guò)氧化氫酶的3’ UTR中也有結(jié)合位點(diǎn)。本發(fā)明的目的是提供miRNA、miRNA前體和其反義寡核苷酸序列，所述的miRNA具有5’端種子序列GGCAAGA。經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)分析，SEQl能夠在線蟲(chóng)中同時(shí)抑制ctl-l、ctl-2以及 ctl-3的活性，而實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)SEQl可以使線蟲(chóng)體內(nèi)總的過(guò)氧化氫酶的活性降低，并且抑制SEQl序列表達(dá)能夠延長(zhǎng)線蟲(chóng)的壽命。本發(fā)明所涉及的miRNA、miRNA前體和其反義寡核苷酸，在消除衰老過(guò)程中的自由基，減輕氧自由基對(duì)機(jī)體的損傷，延緩機(jī)體衰老，降低炎癥反應(yīng)的藥物中具有應(yīng)用前景。為開(kāi)發(fā)治療心血管疾病等氧自由基損傷相關(guān)的老年性疾病的生物藥物打下了一定的研究基礎(chǔ)。據(jù)此，本發(fā)明所提供的miRNA前體基因在線蟲(chóng)和人染色體上的定位分別為，SEQl 前體基因定位于線蟲(chóng)染色體Chromosome II。國(guó)際上已經(jīng)獲得了 SEQl缺失的線蟲(chóng)株系 SEQl (-/_)(購(gòu)自 Caenorhabditis Genetics Center)。本發(fā)明所提供的miRNA分別來(lái)自線蟲(chóng)基因組，成熟miRNA序列長(zhǎng)度為23nt，其前體序列均可以形成miRNA前體的典型二級(jí)結(jié)構(gòu)，符合miRNA的結(jié)構(gòu)特征。RT-PCR驗(yàn)證了 SEQl 在線蟲(chóng)體內(nèi)的存在。在體外的熒光素酶表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，5’端種子序列具有GGCAAGA的SEQl序列可以分別抑制連有ctl-1/3和ctl-2信使RNA 3’ UTR的熒光素酶的活性。過(guò)表達(dá)SEQl 的miRNA使得線蟲(chóng)的過(guò)氧化氫酶的活性降低，壽命縮短，抑制SEQl的miRNA的表達(dá)則能提高過(guò)氧化氫酶的活性使壽命增加。


以下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中圖1顯示了利用實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)的SEQlmiRNA在SEQl (-/-)線蟲(chóng)株系及野生型線蟲(chóng)中的表達(dá)的結(jié)果。圖2顯示了利用實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)過(guò)氧化氫酶信使RNA在SEQl (-/_)線蟲(chóng)中的表達(dá)的結(jié)果。圖2A顯示了 ctl-1信使RNA表達(dá)水平的檢測(cè)；圖2B顯示了 ctl_2信使RNA 表達(dá)水平的檢測(cè)。圖3顯示了利用熒光素酶表達(dá)系統(tǒng)檢測(cè)miRNA對(duì)目的基因3’UTR的結(jié)合作用的結(jié)^ ο圖4顯示了不同株SEQl缺失線蟲(chóng)壽命分析結(jié)果。
圖5顯示了過(guò)表達(dá)SEQl的miRNA線蟲(chóng)過(guò)氧化氫酶活性的結(jié)果。圖6顯示了過(guò)表達(dá)SEQl的miRNA線蟲(chóng)壽命分析的結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下參照具體的實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。daf-2缺失的線蟲(chóng)株系是國(guó)際上公認(rèn)的長(zhǎng)壽線蟲(chóng)株系之一(參照文獻(xiàn)O，在實(shí)驗(yàn)中采用該株系作為陽(yáng)性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)中所使用的daf-2缺失線蟲(chóng)株系以及SEQl缺失株均購(gòu)自 Caenorhabditis Genetics Center。實(shí)施例ImiRNA的克隆和分析1.RNA的提取純化取20只野生型秀麗線蟲(chóng)、20只SEQ 1缺失線蟲(chóng)SEQ 1 (-/-)分別置于包括40ulM9 緩沖液(KH2P043g ；Na2HP046g ；NaC15g ；IM MgSO4Iml ；加水定容至 IOOOml。)的無(wú) RNA 酶的1. 5ml離心管(購(gòu)自Axygen公司)中，加入500ul總RNA抽提試劑Trizol (購(gòu)自 Invitrogen)，渦旋30秒混勻，冰浴30分鐘使蟲(chóng)體溶解。隨后在4°C，12000rpm下離心10 分鐘。將上清轉(zhuǎn)移至另一無(wú)RNA酶的1. 5ml離心管，加入IOOul氯仿，渦旋30秒，室溫放置 3分鐘。在4°C，12000rpm下離心15分鐘。將上清轉(zhuǎn)移至另一無(wú)RNA酶的離心管。加入等體積(通常約300ul)異丙醇，并混勻。室溫放置30分鐘。在4°C，12000rpm下離心10分鐘，棄去上清。加入500ul使用無(wú)RNA酶DEPC水(IOOOmL雙蒸水中加入ImL DEPC原液高壓滅菌后使用，以下同，所述的原液購(gòu)自北京東勝泰博科技有限公司)配制的75%酒精，并在4°C，12000rpm下離心5分鐘，重復(fù)用DEPC水配的75%酒精洗一遍，并在4°C，12000rpm 離心下5分鐘，棄去上清，晾干10分鐘，使酒精完全揮發(fā)。加入20ul無(wú)RNA酶的DEPC水溶解RNA，即得線蟲(chóng)總RNA。2.構(gòu)建 miRNA 的 cDNA 片段取IOul (約5ug)總RNA，用RNA逆轉(zhuǎn)錄酶(購(gòu)自Τ0Υ0Β0公司)將SEQl的miRNA以及作為內(nèi)參的U6miRNA反轉(zhuǎn)錄為DNA，反應(yīng)條件如下RNA 5ug,5X逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液(Τ0Υ0Β0 逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)品中自帶的)5ul，RNA逆轉(zhuǎn)錄酶(購(gòu)自Τ0Υ0Β0公司)0. 5U，RNA酶抑制劑(購(gòu)自TAKARA公司)20U，反轉(zhuǎn)錄引物5mM(由北京擎科生物有限公司合成)，加DEPC處理的水至總體積25ul，42°C反應(yīng)1小時(shí)，85°C反應(yīng)5分鐘，4°C保存5分鐘，離心后_20°C保存。SEQ 1 反轉(zhuǎn)錄引物(SEQ. ID. No. 4)5' -GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGA CTCAGCT-3'3.克隆序列分析按照如上的方法提取線蟲(chóng)的總DNA，取直徑為10厘米的培養(yǎng)皿(購(gòu)自海門市華生實(shí)驗(yàn)儀器中心)，使用M9緩沖液將線蟲(chóng)沖洗下來(lái)，經(jīng)M9緩沖液沖洗2次后，終體積200ul， 加入 1.7mL STE 緩沖液(0. lmmol/L NaCl, 10mmol/L Tris-HCl, lmmol/L EDTA) ,0. 6mol/L β -巰基乙醇，200 μ g/mL蛋白酶K (購(gòu)自TAKARA)，20 μ g/mL RNase A (北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司)。55°C過(guò)夜孵育，孵育后的產(chǎn)物用等體積的酚氯仿異戊醇(苯酚氯仿異戊醇=25 M 1)抽提2次，等體積的無(wú)水乙醇沉淀Ih后，12000r/min離心10分鐘，將沉淀用預(yù)冷的70%乙醇洗滌，于空氣中干燥，最后加入IOOyL TE溶解得到提取的秀麗隱桿線蟲(chóng)基因組DNA，于-20°C冰箱保存。根據(jù)SEQl在基因組中的序列設(shè)計(jì)PCR引物(由北京擎科生物公司合成)，在上游引入^icII酶切位點(diǎn)，在下游引入NcoI酶切位點(diǎn)。SEQl 基因組上游引物(SEQ. ID. No. 5)TCCCCGCGGGGTGCTGAGAATGAAGTT ；SEQl 基因組下游引物(SEQ. ID. No. 6)CATGCCATGGCGACTCATTTCACTTTCCPCR體系=SEQl前體上游引物lul, SEQl前體下游引物lul, Premix Ex Taq (購(gòu)自TAKARA公司)IOul，加三蒸水至20ul。經(jīng)過(guò)PCR獲得DNA片段步驟1 :95°C，30秒。步驟2 1. 95°C，5秒；2. 550C，30秒；3. 72°C 30秒；重復(fù)1-3步四個(gè)循環(huán)。步驟3 :72°C 10分鐘。進(jìn)行凝膠電泳分離目的DNA片段，經(jīng)0. 5ug/ml EB溶液染色切膠后，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司)按照產(chǎn)品操作步驟進(jìn)行回收，得到純化后的SEQl DNA片段。使用SacII和NcoI對(duì)SEQl序列和pBluescript II SK(-)載體(購(gòu)自Mratagene公司)分別進(jìn)行雙酶切。SEQl 片段酶切體系10XBuffer 42. 5ul ；SEQ1DNA 片段溶液 20ulSacII 核酸酶 (購(gòu)自NEB公司)lul,NcoI-HF核酸酶(購(gòu)自NEB公司)lul。pBluescript II SK(-)載體酶切體系10XBuffer4 2. 5ul ；載體溶液 4ulSacII 核酸酶(購(gòu)自NEB公司)Iul，NcoI-HF核酸酶(購(gòu)自NEB公司)Iul，補(bǔ)加滅菌蒸餾水至25ul。37°C水浴16小時(shí)，進(jìn)行0.7%瓊脂糖凝膠電泳分離目的片段，使用凝膠回收試劑盒(購(gòu)自天根生物科技有限公司)按產(chǎn)品操作說(shuō)明回收目的片段。將回收的SEQl DNA片段 4. 5ul與1.5ul pBluescript II SK (-)載體片段(購(gòu)自Agilent公司)混合后，加入5ul連接液Solution 1(購(gòu)自TAKARA)16°C連接20小時(shí)，之后取IOul連接產(chǎn)物，加入50ul DH5 α 感受態(tài)菌株(購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司)按照產(chǎn)品操作說(shuō)明，將連有SEQl DNA片段的pBluescript II SK(-)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)入DH5 α菌株(購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司)，鋪Amp細(xì)菌培養(yǎng)板篩選轉(zhuǎn)化成功的陽(yáng)性克隆，挑取若干菌落進(jìn)行SEQl序列的PCR驗(yàn)證 (步驟同前)，選取PCR為陽(yáng)性的菌落，370C LB培養(yǎng)基培養(yǎng)16小時(shí)后，送去北京博尚生物科技有限公司測(cè)序，進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，并使用質(zhì)粒小體試劑盒(購(gòu)自天根生物科技有限公司) 提取陽(yáng)性克隆中的質(zhì)粒，最終獲得含SEQl序列的pBluescript II SK(-)載體。實(shí)施例2實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)SEQl微小RNA在線蟲(chóng)株系中的表達(dá)培養(yǎng)野生型秀麗線蟲(chóng)、SEQ 1缺失線蟲(chóng)品系SEQ 1 (-/-)，按照實(shí)施例1的方法提取線蟲(chóng)RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄后，通過(guò)實(shí)時(shí)定量熒光PCR(RT-PCR)檢測(cè)SEQl在野生型以及SEQ1(-/-)的表達(dá)差異。 使用STOR Premix ExTaq試劑盒(購(gòu)自TAKARA)，按照廠商的產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行操作。在20ul的SEQl的反應(yīng)體系中加入2ul模板，IOul 2 X SYBRPremix ExTaq, 0.4ul 正向引物(5，-GTGCAGGGTCCGAGGT-3，)(SEQ. ID. No. 4) 10uM，0. 4ul 反向引物 (5‘ -AGGCAAGATGTTGGCA-3‘) IOuM, 0. 4ul 50 X ROX Reference 染料(SYBR Premix ExTaq 試劑盒中自帶的)，加滅菌蒸餾水至20ul。 使用 U6 作為內(nèi)參，參照 Thermo Scientific 公司 Quantitative Real-TimeRT-PCR的計(jì)算方法，以及文獻(xiàn)2。擴(kuò)增后濃度的計(jì)算參照文獻(xiàn)3，在20ul U6的反應(yīng)體系中加入 2ul 模板，IOul 2XSYBR Premix ExTaq,0. 4ul 正向引物(5，-CTCGCTTCGGCAGCACA-3，) (SEQ. ID. No. 7) 10uM，0. 4ul 反向引物(5，-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3，)(SEQ. ID. No. 8) IOuM, 0. 4ul 50 X ROX Reference染料，加滅菌蒸餾水至20ul。設(shè)置Real-time PCR 程序步驟 1 :95°C，30 秒。步驟 2 1. 95°C，5 秒；2. 55°C，30 秒；3. 720C 30秒；重復(fù)1-3步35個(gè)循環(huán)。步驟3 :55°C到95°C每秒上升0. 5°C并且讀值，結(jié)束循環(huán)。使用U6作為miRNA的內(nèi)參。結(jié)果見(jiàn)圖1。RT-PCR檢測(cè)在SEQl (-/-)株系中SEQl 表達(dá)量極低，說(shuō)明在該株系中SEQl敲除成功，SEQl幾乎不表達(dá)，而在野生型中SEQl表達(dá)量高。(RNA表達(dá)量按照參考文獻(xiàn)4的方法進(jìn)行，計(jì)算SEQl與野生型表達(dá)量的比值，得到相對(duì)表達(dá)量，沒(méi)有單位，可見(jiàn)參考文獻(xiàn)3圖la，b)實(shí)施例3實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)過(guò)氧化氫酶在線蟲(chóng)各株系中的表達(dá)培養(yǎng)野生型秀麗線蟲(chóng)和SEQ 1缺失線蟲(chóng)品系SEQ 1 (-/-)，按照實(shí)施例1中的方法提取線蟲(chóng)RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。ctl-1 反轉(zhuǎn)錄引物5，-GAGCTGATGGCGAAGAGC-3，(SEQ. ID. No. 9)ctl-2 反轉(zhuǎn)錄引物5，-TGGATGAGTGCCTTGACA-3，(SEQ. ID. No. 10)反轉(zhuǎn)錄后，使用實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)ctl-1和ctl-2在野生型和SEQl (-/-)的表達(dá)差異。實(shí)驗(yàn)條件與實(shí)施例2中相同。實(shí)時(shí)定量熒光PCR反應(yīng)中所使用的引物
ctl-IRT上游引物:5， -CGCATCTCCCTGGCTTTCAT--3，(SEQ. ID. No.11)
ctl-IRT下游引物:5’ -CTCGCCAGACAAGATGCTCC--3，(SEQ. ID. No.12)
ctl-2RT上游引物:5， -ATCATGACATTCCCCGAGCG--3，(SEQ. ID. No.13)
ctl-2RT下游引物:5’ -GATACCACATTCCCAGCCAC--3，(SEQ. ID. No.14)
使用 STOR PremixExTaq (購(gòu)自TAKARA)，在20ul的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系
中加入2ul反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，IOul 2XSYBR Premix ExTaq，0. 4ul正向引物(IOuM)， 0.4ul反向引物(IOuM)，0.4ul 50XROX Reference染料，加滅菌蒸餾水至20ul。設(shè)置實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 程序步驟 1 :95°C，30 秒。步驟 2 :1.95°C，5 秒；2. 55°C，30 秒；3. 72°C 30 秒；重復(fù)1-3步35個(gè)循環(huán)。步驟3:55°C到95°C每秒上升0.5°C并且讀值，結(jié)束循環(huán)。使用 β-tubulin作為過(guò)氧化氫酶信使RNA的內(nèi)參。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果見(jiàn)圖2。對(duì)比野生型和SEQl (-/")線蟲(chóng)，ctl-1和ctl-2的表達(dá)情況，SEQl缺失的株系中ctl-1和ctl-2轉(zhuǎn)錄水平均有上升，說(shuō)明SEQl能夠抑制ctl-1和ctl-2的表達(dá)。實(shí)施例4熒光素酶表達(dá)檢測(cè)miRNA對(duì)目的基因的抑制作用首先設(shè)計(jì)ctl-1和ctl-2的3’ UTR的上游引物和下游引物，同時(shí)分別在上游和下游引入SpeI和EcoRI的酶切位點(diǎn)ctl-1 上游引物GCCTAGACTAGTAATTGTTTGATATTC(SEQ. ID. No. 15)ctl-1 下游引物GCATTGGAATTCGACAAGAGAAACAGA(SEQ. ID. No. 16)ctl-2 上游引物GCCTAGACTAGTACTTTCTTGAAATTA(SEQ. ID. No. 17)ctl-2 下游引物GCATTGGAATTCGTTGGTGGAGAGTTT (SEQ. ID. No. 18)從基因組上使用高保真酶Phusion HotStart High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒(購(gòu)自NEB公司)按照產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行PCR反應(yīng)，克隆獲得ctl-1和ctl-2的3’ UTR序列。ctl-1 3，UTR PCR體系:ctl_l上游引物lul, ctl-Ι下游引物Iul,高保真酶 Phusion Iul，dNTP混合物(含DNA合成所需的四種堿基，包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP，試劑盒中自帶的)，5x Phusion HF緩沖液加三蒸水至20ul。經(jīng)過(guò)PCR獲得DNA片段步驟 1 :95°C，30 秒。步驟 2 :1.95°C，5 秒；2. 55°C，30 秒；3. 72 °C 1 分 40 秒；重復(fù) 1_3步四個(gè)循環(huán)。步驟3 :72°C 10分鐘。進(jìn)行凝膠電泳分離目的DNA片段，經(jīng)0. 5ug/ml EB溶液染色切膠后，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司)按照產(chǎn)品操作步驟進(jìn)行回收。將ctl-Ι和ctl-2的3，UTR分別克隆入pGL3_3，UTR熒光素酶報(bào)告載體(購(gòu)自 Promega公司)。使用Dilute FuGENE 6Reagent (購(gòu)自Roche公司)，按照廠商的產(chǎn)品說(shuō)明，轉(zhuǎn)染細(xì)胞(購(gòu)自hvitrogen公司)。轉(zhuǎn)染前一天使用無(wú)抗生素的DMEM普通培養(yǎng)基(10g DMEM干粉購(gòu)自^witrogen公司，按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配制，加入NaHC033. 7g，谷氨酰胺0. 2mmol/L,并使用HCl調(diào)pH至7. 2，加入10 %的小牛血清，然后過(guò)濾)培養(yǎng)細(xì)胞。 每IOOul無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基(IOgDMEM干粉購(gòu)自hvitrogen公司，按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配制，加入NaHC033. 7g，谷氨酰胺0. 2mmol/L，青霉素100U/ml，鏈霉素100U/ml，并使用HCl調(diào) pH至7. 2，然后過(guò)濾)中加入lul FuGENE 6Reagent (購(gòu)自Roche公司)然后將Iug含有 ctl-Ι 或是 ctl-2 3，UTR 的 pGL3-3，UTR 載體 DNA 與 40nmol/L SEQlmiRNA (由上海吉瑪生物科技有限公司合成)混合，在每2ugDNA混合液中加入IOOul前述的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，室溫孵育45min。用PBS (pH = 7. 4)洗準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染的細(xì)胞一次，24孔板中加入IOOul含有 2ug DNA的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基(配制方法如前)混合，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱(37°C，5% CO2) 培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)，之后移除混合液，加入完全DMEM培養(yǎng)基(10g DMEM干粉購(gòu)自hvitrogen公司，按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行配制，加入NaHCO3 3. 7g，谷氨酰胺0. 2mmol/L，青霉素100U/ml，鏈霉素100U/ml，并使用HCl調(diào)pH至7. 2，加入10%的小牛血清，然后過(guò)濾)繼續(xù)培養(yǎng)(37°C， 5% CO2) 24 小時(shí)。之后使用RIPA裂解液(購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司)裂解細(xì)胞。去除培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，用PBS (pH = 7. 4，每升溶液中含NaCl 8g，KC10. 2g，Na2HPO4 1. 4g)洗一遍，棄去上清。按照M孔板每孔加入100微升裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，獲得細(xì)胞裂解液。使用雙熒光報(bào)告系統(tǒng)(Dual-Luciferase Importer Assay System，購(gòu)自 Promega)以及多功能酶標(biāo)儀根據(jù)報(bào)告系統(tǒng)產(chǎn)品操作說(shuō)明檢測(cè)細(xì)胞裂解物的熒光讀值，從而得到過(guò)氧化氫酶3’ UTR與SEQl微小RNA的相互作用情況。具體操作步驟如下在96孔白板每個(gè)孔中加入將20 μ 1小量細(xì)胞裂解液，再加入100 μ 1熒光素酶檢測(cè)試劑II混合，之后立即用Synergy2多功能酶標(biāo)儀(購(gòu)自BioTek公司)在560nm波長(zhǎng)處檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶的活力12秒。檢測(cè)完畢后，加入100 μ 1 Stop&Glo Reagent (購(gòu)自Promega公司)，湮滅螢火蟲(chóng)熒光素酶反應(yīng)，并激活Renilla熒光素酶反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀在465nm處檢測(cè)Renilla熒光素酶的活力12秒。得到雙熒光讀值，熒光素酶表達(dá)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3?？偣卜?個(gè)實(shí)驗(yàn)組(1)空白對(duì)照，將PGL3空載體通過(guò)轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞；(2)將帶有ctl-Ι基因3，UTR的PGL3載體和合成的SEQl序列共轉(zhuǎn)入細(xì)胞， 如果SEQl確實(shí)能夠在體內(nèi)通過(guò)結(jié)合3’ UTR抑制ctl-Ι基因，則熒光素酶的表達(dá)下降；
(3)將帶有ctl-2基因3，UTR的PGL3載體和合成的SEQl序列共轉(zhuǎn)入細(xì)胞， 如果SEQl也能夠在體內(nèi)通過(guò)結(jié)合3’ UTR抑制ctl-2基因，則熒光素酶的表達(dá)下降；(4)陰性對(duì)照，將帶有ctl-1基因3’UTR的PGL3載體和合成的隨機(jī)微小RNA序列共轉(zhuǎn)入細(xì)胞，如果隨機(jī)序列不能夠在體內(nèi)通過(guò)結(jié)合3’ UTR抑制ctl-1基因，熒光素酶的表達(dá)不受影響，則說(shuō)明SEQl序列是特異地抑制ctl-1基因；(5)陰性對(duì)照，將帶有ctl-2基因3’UTR的PGL3載體和合成的隨機(jī)微小RNA序列共轉(zhuǎn)入細(xì)胞，如果隨機(jī)序列不能夠在體內(nèi)通過(guò)結(jié)合3’ UTR抑制ctl-2基因，熒光素酶的表達(dá)不受影響，則說(shuō)明SEQl序列是特異地抑制ctl-2基因；實(shí)驗(yàn)組熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，第(4)、(5)組中熒光素酶表達(dá)與第(1)組相比，沒(méi)有顯著變化，而第O)、(3)組與第(1)組相比熒光素酶表達(dá)顯著降低，說(shuō)明SEQl能夠特異識(shí)別ctl-1以及ctl-2信使RNA的3' UTR區(qū)域，并且抑制其轉(zhuǎn)錄。實(shí)施例5線蟲(chóng)壽侖分析培養(yǎng)野生型(WT)以及SEQl (-/-)的線蟲(chóng)株系。按照文獻(xiàn)4中步驟檢測(cè)線蟲(chóng)壽命。 使用堿性次氯酸溶液(3. 75ml IM NaOH, 3ml次氯酸，加水至IOml)裂解線蟲(chóng)，離心棄上清， 獲得線蟲(chóng)卵，鋪在NGM平板(NaCl 3g，蛋白胨2. 5g，瓊脂粉17g，lmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖液(pH = 6. 0) 25ml，加975ml蒸餾水定容至1L，高壓滅菌30min后加入IM MgS04250ul, IM CaCl2 250ul, 10mg/ml膽固醇水溶液(購(gòu)自北京中生百欣科技服務(wù)有限責(zé)任公司)125ul， 配成NGM固體培養(yǎng)基，冷凝前倒在細(xì)菌培養(yǎng)板中)上，20°C培養(yǎng)2天，然后挑取成蟲(chóng)至含 35mM FUDR(購(gòu)自Sigma公司)的NGM平板(其他成分如前所述)中，每天計(jì)數(shù)存活的以及死亡的線蟲(chóng)數(shù)目占總數(shù)的百分比，算出每天的存活率。結(jié)果見(jiàn)圖4。線蟲(chóng)壽命分析可以看出 SEQl缺失株系壽命比野生型有所延長(zhǎng)，說(shuō)明SEQl確實(shí)對(duì)線蟲(chóng)的壽命有負(fù)面影響。實(shí)施例6線蟲(chóng)體內(nèi)過(guò)表達(dá)SEQl過(guò)表達(dá)SEQl的方法參照文獻(xiàn)4和S5中將外源RNA導(dǎo)入線蟲(chóng)的方法，將實(shí)施例1構(gòu)建進(jìn)入pBluescript II SK(-)載體中的miRNA片段經(jīng)過(guò)^icII和Nco I雙酶切連接，連入L4440載體(購(gòu)自Addgene公司)，將重組的L4440載體5ug加入IOOul HTl 15 (DE3)感受態(tài)(制備方法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版，第93頁(yè)，制備和轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌的 Inoue方法制備超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞)，冰浴30分鐘，42°C熱激45秒，冰浴2分鐘，加入500ul LB培養(yǎng)基(酵母粉lg，蛋白胨2g，NaCl 2g，加水至200ml滅菌，詳見(jiàn)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》 第三版，第1595頁(yè)。)37°C溫育1小時(shí)，涂Amp培養(yǎng)板(購(gòu)自北京經(jīng)科宏達(dá)生物技術(shù)有限公司)，37°C培養(yǎng)12 16小時(shí)，挑菌進(jìn)行PCR檢驗(yàn)，將檢驗(yàn)為陽(yáng)性的菌株用于飼喂野生型線蟲(chóng)，培養(yǎng)2 3天后，取后代檢測(cè)過(guò)氧化氫酶活性以及壽命。同時(shí)按相同方法制備隨機(jī)微小RNA過(guò)表達(dá)的線蟲(chóng)株系，檢測(cè)后代過(guò)氧化氫酶活性以及壽命。同時(shí)檢測(cè)SEQl缺失的株系 SEQl(-/_)的過(guò)氧化氫酶活性以及壽命。1.檢測(cè)線蟲(chóng)體內(nèi)過(guò)氧化氫酶的活性。使用ftOteoSolve-CE native試劑盒(購(gòu)自 Pressure Bic^ciences公司)提取線蟲(chóng)總蛋白，使用過(guò)氧化氫酶檢測(cè)試劑盒(S0051，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司)檢測(cè)蛋白提取液中過(guò)氧化氫酶的活性，再按照文獻(xiàn)6中的方法，比較 SEQl缺失線蟲(chóng)、以及SEQl過(guò)表達(dá)線蟲(chóng)過(guò)氧化氫酶活性與野生型線蟲(chóng)的比值，來(lái)反映不同株系線蟲(chóng)體內(nèi)過(guò)氧化氫酶活性的變化，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果顯示，SEQl過(guò)表達(dá)時(shí)，過(guò)氧化氫酶的活性下降，而在SEQl缺失的時(shí)候過(guò)氧化氫酶活性升高，隨機(jī)小RNA過(guò)表達(dá)對(duì)過(guò)氧化氫酶的活性影響不大。說(shuō)明過(guò)氧化氫酶是SEQl的靶標(biāo)，SEQl通過(guò)抑制過(guò)氧化氫酶的表達(dá)來(lái)抑制其活性。2.檢測(cè)SEQl過(guò)表達(dá)線蟲(chóng)壽命并與野生型以及SEQl缺失線蟲(chóng)進(jìn)行比較(方法同實(shí)施例5，參照文獻(xiàn)4，)，結(jié)果如圖6所示，SEQl過(guò)表達(dá)的時(shí)候線蟲(chóng)壽命顯著縮短，而SEQl缺失的時(shí)候線蟲(chóng)壽命有所延長(zhǎng)。參考文獻(xiàn)1. Kimura KD, Tissenbaum HA, Liu Y, Ruvkun G. Daf-2, an insulin receptor-like gene that regulates longevity and diapause in caenorhabditis elegans. Science. 1997 ；277 :942-9462. Jiang J,Lee EJ, Gusev Y, Schmittgen TD. Real-time expression profiling of microrna precursors in human cancer cell lines. Nucleic acids research. 2005 ； 33 :5394-54033. Wang JX, Jiao JQ, Li Q, Long B, Wang K, Liu JP, Li YR, Li PF. Mir_499regulates mitochondrial dynamics by targeting calcineurin and dynamin-related protein-l. Nature Medicine. 2011 ；17 :71-784. Lee SS,Lee RYN,Fraser AG, Kamath RS,Ahringer J,Ruvkun G. A systematic rnai screen identifies a critical role for mitochondria in c. Elegans longevity, nature genetics. 2002 ；33 :40-485. Fraser AG, Kamath RS, Zipperlen P, Martinez-Campos M, Sohrmann M, Ahringer J. Functional genomic analysis of c. Elegans chromosome i by systematic rna interference. Nature. 2000 ；408 :325-3306.Petriv 01, Rachubinski RA. Lack of peroxisomal catalase causes a progeric phenotype in caenorhabditis elegans. Journal of Biological Chemistry. 2004 ；279 :19996-2000權(quán)利要求
1.一種微小RNA及其前體和反義核酸在調(diào)節(jié)過(guò)氧化氫酶活性中的用途，其中所述微小 RNA為包含序列SEQ. ID. No. 1的核苷酸或者其生物活性功能片段或變體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述微小RNA前體為包含序列SEQ. ID. No. 2的核苷酸或者其生物活性功能片段或變體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述微小RNA反義核酸為包含序列SEQ. ID. No. 3的核苷酸或者其生物活性功能片段或變體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述微小RNA及其前體和反義核酸可以進(jìn)行以下修飾硫代或甲氧基取代。
5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述調(diào)節(jié)過(guò)氧化氫酶活性中，通過(guò)過(guò)表達(dá)微小RNA或其前體而降低過(guò)氧化氫酶活性。
6.權(quán)利要求1或4中任一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述調(diào)節(jié)過(guò)氧化氫酶活性中，通過(guò)微小RNA反義核酸抑制微小RNA或其前體表達(dá)而增強(qiáng)過(guò)氧化氫酶活性。
全文摘要
本發(fā)明提供一種微小RNA及其前體和反義核酸在調(diào)節(jié)過(guò)氧化氫酶活性中的用途。本發(fā)明提供的微小RNA為包含以下序列的核苷酸或者其生物活性功能片段或變體5′-AGGCAAGAUGUUGGCAUAGCUGA-3′。本發(fā)明通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，過(guò)表達(dá)微小RNA或其前體可降低過(guò)氧化氫酶活性，而通過(guò)微小RNA反義核酸抑制微小RNA或其前體表達(dá)，可增強(qiáng)過(guò)氧化氫酶活性。
文檔編號(hào)C12N15/113GK102363779SQ20111017537
公開(kāi)日2012年2月29日 申請(qǐng)日期2011年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月27日
發(fā)明者丁素玲, 周露玙, 李培峰 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所