專利名稱：一種秀麗白蝦srap-pcr體系的建立與優(yōu)化方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種秀麗白蝦SRAP-PCR體系的建立與優(yōu)化方法，能快速、準確地建立最優(yōu)化的秀麗白蝦SRAP-PCR反應體系，借助這一方法可以便捷地開展秀麗白蝦遺傳多樣性及種質資源調查，屬于漁業(yè)生物技術領域。
背景技術：
秀麗白蝦(Exopalaemon modestus)隸屬于甲殼綱、十足目、長臂蝦科、白蝦屬，廣泛分布于我國淡水湖泊及河流中，是長江中下游地區(qū)許多中大型湖泊的蝦類優(yōu)勢種。太湖秀麗白蝦因其殼薄味美、營養(yǎng)豐富、產量高而與銀魚、梅鱭并稱“太湖三寶”，巢湖秀麗白蝦與銀魚、河蟹并稱為“巢湖三鮮”，巢湖和洪澤湖的“湖米”(白蝦的蝦仁)遠銷海內外。因此不論從產量還是產值上講，秀麗白蝦在我國淡水湖泊漁業(yè)中占有非常重要的位置。近年來由于水質污染、過度捕撈等原因，湖泊中秀麗白蝦呈現個體小型化、產量下降的趨勢，白蝦種質資源保護顯得尤為重要。遺傳多樣性的研究是種質資源保護的重要部分，而合適的分子標記和良好的反應體系的建立是得出科學結論的前提條件。目前有關秀麗白蝦種質遺傳多樣性的研究僅見于RAPD標記和AFLP標記。RAPD分子標記是一種顯性標記，不能鑒別雜合子和純合子，且實驗結果不穩(wěn)定，重復性差；AFLP標記需要預擴增和連接，實驗操作過程煩瑣，工作量大，實驗費用高。因此急需開發(fā)新的分子標記和建立優(yōu)化的反應體系，補充、豐富秀麗白蝦分子生物學研究的手段和方法。SRAP (sequence-related amplified polymorphism)是由美國力口州大學 Li 與 Quiros博士開發(fā)出的新型DNA分子標記技術。其原理是利用獨特的正反引物設計，對開放閱讀框進行擴增，因不同個體的內含子、啟動子與外顯子間隔區(qū)長度不同而產生多態(tài)性。該分子標記技術有簡便、快速、穩(wěn)定、不需預知序列信息等優(yōu)點，不僅廣泛應用于植物的遺傳多樣性分析、基因定位和遺傳圖譜構建等，近年來已用于羅氏沼蝦、日本沼蝦、海南沼蝦、草魚、團頭魴等水產動物遺傳多樣性的研究；在反應體系的優(yōu)化上，以往多采用簡單的梯度試驗，對各個因素的最佳水平進行逐個摸索，過程比較繁瑣，而且很難兼顧各個因素之間的交互作用，實驗結果誤差大。

發(fā)明內容
發(fā)明目的
目前秀麗白蝦種質遺傳研究上缺乏足夠、可靠的分子標記，本發(fā)明開發(fā)了一種秀麗白蝦SRAP分子標記，并將正交設計引入到反應體系的優(yōu)化中，對影響SRAP-PCR的5個因素 (Mg2+、Taq酶、dNTPs、模板DNA、引物)在4個水平上進行正交組合，建立了秀麗白蝦最優(yōu) SRAP-PCR反應體系，這一發(fā)明補充、豐富秀麗白蝦分子生物學研究的手段和方法，為秀麗白蝦種質資源保護奠定了基礎。技術方案一種秀麗白蝦SRAP-PCR體系的建立與優(yōu)化方法，其特征在于該方法包括25 μ L的PCR 體系中含有 Mg2+ 2mmol/L、Taq 酶 0. 5U、模板 DNA 75ng、dNTPs 0. 20mmol/L、引物 0. 2 μ mol/ L,其中引物為 5 ‘ -TGAGTCCAAACCGGAGC-3 ‘禾口 5 ‘ -GACTGCGTACGAATTTGA-3‘。有益效果
本發(fā)明開發(fā)了一種秀麗白蝦SRAP分子標記，并將正交設計引入反應體系的優(yōu)化中，建立了秀麗白蝦最優(yōu)SRAP-PCR反應體系。該方法與現有技術相比具有以下優(yōu)勢
(1)目前報道的應用于秀麗白蝦種質遺傳分析的分子標記只有RAPD和AFLP2種。本發(fā)明開發(fā)了一種新的分子標記SRAP標記，補充、豐富了秀麗白蝦分子生物學研究的手段和方法。(2) RAPD標記是一個顯性標記，不能鑒別雜合子和純合子；而且對于反應條件比較敏感，穩(wěn)定性和重復性差，SRAP標記具有高共顯性、重復性好的特點，克服了 RAPD標記的上述缺點。(3)AFLP標記需要預擴增和連接，實驗操作過程煩瑣，工作量大，實驗費用高。相比之下，SRAP標記具有實驗操作簡單，工作量小，實驗費較低的優(yōu)勢。(4) SRAP標記與性狀的表現型相關性更高，因此通過分離特異SRAP標記、序列測定的方法更易篩選到與某個性狀相關的功能基因。
具體實施方案實施例1
本發(fā)明為一種秀麗白蝦SRAP-PCR體系的建立與優(yōu)化方法，采用以下工藝步驟 1、采集秀麗白蝦樣本，保存于95%乙醇中帶回實驗室。常規(guī)酚/氯仿法提取樣本總DNA。 提取的DNA經70%的乙醇洗滌，室溫干燥后溶于適量ddH20中，置于_20°C保存?zhèn)溆谩?、參照有關文獻合成SRAP引物序列，選取部分白蝦樣品預擴增，篩選擴增效果好的引物對。篩選出的SRAP引物對的序列為
ME2 (5' -TGAGTCCAAACCGGAGC-3‘)禾口 EM4 (5' -GACTGCGTACGAATTTGA-3‘)。3、PCR反應的因素與水平梯度設計，如表1。表1 PCR反應的因素與水平
權利要求
1. 一種秀麗白蝦SRAP-PCR體系的建立與優(yōu)化方法，其特征在于該方法包括25 μ L 的 PCR 體系中含有 Mg2+ 2mmol/L、Taq 酶 0. 5U、模板 DNA 75ng、dNTPs 0. 20mmol/L、引物 0. 2 μ mol/L，其中引物為 5 ‘ -TGAGTCCAAACCGGAGC-3 '和 5 ‘ -GACTGCGTACGAATTTGA-3 ‘。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種秀麗白蝦SRAP-PCR體系的建立與優(yōu)化方法，屬于漁業(yè)生物技術領域；一種秀麗白蝦SRAP-PCR體系的建立與優(yōu)化方法，其特征在于該方法包括25μL的PCR體系中含有Mg2+2mmol/L、Taq酶0.5U、模板DNA75ng、dNTPs0.20mmol/L、引物0.2μmol/L，其中引物為5′-TGAGTCCAAACCGGAGC-3′、GACTGCGTACGAATTTGA。目前報道的應用于秀麗白蝦種質遺傳分析的分子標記只有RAPD和AFLP2種。本發(fā)明開發(fā)了一種新的分子標記SRAP標記，補充、豐富了秀麗白蝦分子生物學研究的手段和方法。
文檔編號C12N15/10GK102234644SQ20111016312
公開日2011年11月9日 申請日期2011年6月17日 優(yōu)先權日2011年6月17日
發(fā)明者劉凱, 張敏瑩, 徐東坡, 施煒綱, 段金榮, 程長洪 申請人:中國水產科學研究院淡水漁業(yè)研究中心