專利名稱：一種分選人骨髓極小胚胎樣干細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種分選人骨髓極小胚胎樣干細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞的研究為人體臟器再生、為器官衰竭治療帶來希望，“極小胚胎樣干細(xì)胞” (very small embryonic-like stem cells, VSELs)是近幾年在小鼠和人的骨髓、臍血中發(fā)現(xiàn)的成體干細(xì)胞，在其他物種尚未鑒定。VSELs直徑小(< IOuM)；標(biāo)志物在小鼠為 Sca-I (+) /Lin (-) /CD45 (-) /CXCR4 (+)，在人為 Oct-4 (+) CXCR4 (+) CD133 (+) Lin (-) CD45 (-)； VSELs表達(dá)胚胎干細(xì)胞的多能性標(biāo)記蛋白0ct4、NanOg、SSEA等；電鏡下可見典型的胚胎干細(xì)胞形態(tài)特征；VSELs培養(yǎng)可見典型擬胚體，適當(dāng)促分化條件下能分化為三個胚層來源的細(xì)胞。是目前最有希望應(yīng)用的干細(xì)胞“種子”之一。然而，由于其數(shù)量少，僅占骨髓單個核細(xì)胞的數(shù)萬分之一，分離后體外存活增殖能力有限，相關(guān)技術(shù)目前尚不成熟，直接從骨髓取材臨床應(yīng)用的VSELs移植仍不可能。在實驗室研究階段，已有報道采用流式細(xì)胞儀分選VSELs。眾所周知，流式分選雖然理論上能逐一收獲細(xì)胞，但過程中的機(jī)械剪切力、高能激光和超聲振蕩可能造成致命的細(xì)胞損傷及影響其生物學(xué)特性。其它的分選方法如免疫磁珠分選系統(tǒng)常應(yīng)用于造血干細(xì)胞的分選，最多的只能進(jìn)行CD34+細(xì)胞分選，對VSELs的分選尚無報道。VSELs的分選的落后， 嚴(yán)重地制約了干細(xì)胞的研究和應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種分選人骨髓極小胚胎樣干細(xì)胞的方法，能保持極小胚胎樣干細(xì)胞的完好性，具有方法簡單實用，簡化分選流程，縮短分選時間，提取成本低，能獲得較高的回收率的優(yōu)點。為此，本發(fā)明的方法的步驟是恒溫4°C條件下進(jìn)行，步驟在如下(1)經(jīng)肝素鹽水抗凝的IOml人骨髓，加入占其3倍體積量的紅細(xì)胞裂解液30ml， 混均，4°C條件下裂解，離心分離10分鐘，棄上清液，再沉淀物中加入占其2倍體積量的紅細(xì)胞裂解液20ml，混均，4°C條件下裂解，離心分離10分鐘，再棄上清液，得二次沉淀物，4°C條件下用EDTA緩沖液洗滌，得細(xì)胞懸濁液；(2)將細(xì)胞懸濁液用30uM網(wǎng)孔濾過，將過濾液在4°C條件下離心分離5分鐘，棄上清液，將該沉淀物加入EDTA緩沖液至300ul 310ul得重懸細(xì)胞液；(3)陰選，取重懸細(xì)胞液300ul，加入IOOul美天旎130-092_211_1液，充分混勻， 4°C放置10分鐘，再加入5ml EDTA緩沖液洗滌，在4°C條件下離心分離5分鐘，棄上清液， 將該沉淀物加入EDTA緩沖液500 550ul，加入美天旎130-092-211-2液200ul及美天旎 130-045-801液200ul，混勻，4°C放置15分鐘；以IOml EDTA緩沖液洗滌，棄上清液，將該沉淀物加入EDTA緩沖液至500ul，選用美天旎磁珠分選器，LS分選柱，按該美天旎磁珠分選器說明進(jìn)行分選，收集通過分選柱的細(xì)胞，計數(shù)為IO5-IO6個，4°C條件下離心收集沉淀物；
(4)陽選取25 27ulEDTA緩沖液加入步驟(3)收集的沉淀物中，得重懸細(xì)胞液，再加IOul美天旎130-059-901液及IOul美天旎130-050-081液，混勻，4°C避光放置30 分鐘；以ImlEDTA緩沖液洗滌，棄上清液，將該沉淀物加入EDTA緩沖液至500ul，選用美天旎磁珠分選器，LS分選柱，按該美天旎磁珠分選器說明進(jìn)行分選，收集吸附在分選柱上的細(xì)胞，計數(shù)1 X IO4個，離心收集細(xì)胞，得本發(fā)明人骨髓極小胚胎樣干細(xì)胞。本發(fā)明的優(yōu)點是工藝簡單實用，提取成本低、速度快，提取率高。本發(fā)明的提取成本低，僅是傳統(tǒng)方法成本的10-20%，能保持VSELs的完好性，有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明的方法能有效避免人骨髓極小胚胎樣干細(xì)胞在提取過程中的損失和破壞， 將本發(fā)明收集的人骨髓極小胚胎樣干細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測和免疫熒光染色鑒定并初步進(jìn)行了培養(yǎng)，步驟如下1，流式細(xì)胞儀檢測將本發(fā)明的人骨髓極小胚胎樣干細(xì)胞10ul，加15ul抗體混合液[CD133/2Q93C3)-APC(美天旎，130-090-854)抗體 5ul ；CXCR4-PE(eBioscience, 12-9999)抗體9ul ；0ct4_FITC (CST，5263)抗體lul] 4°C避光放置30分鐘；以Iml緩沖液洗滌，棄上清，重懸于350ul 2%多聚甲醛備檢測。檢測時加入3uM的微球以確定細(xì)胞直徑，結(jié)果分選前VSELs約占骨髓單個核細(xì)胞的約0. 01 %，分選后1 X IO4個細(xì)胞中約有30%符合直徑小于10uM/0ct-4(+)/CXCR4/(+)/CD133(+)，推算回收率約為30%。人骨髓極小胚胎樣干細(xì)胞完好。2，免疫熒光染色將本發(fā)明的人骨髓極小胚胎樣干細(xì)胞加VSELs分離培養(yǎng)液)1 2ml ；分離培養(yǎng)液為
權(quán)利要求
1. 一種分選人骨髓極小胚胎樣干細(xì)胞的方法，其特征在于該方法的步驟是恒溫4°c條件下進(jìn)行，步驟在如下(1)經(jīng)肝素鹽水抗凝的IOml人骨髓，加入占其3倍體積量的紅細(xì)胞裂解液30ml，混均， 4°C條件下裂解，離心分離10分鐘，棄上清液，再沉淀物中加入占其2倍體積量的紅細(xì)胞裂解液20ml，混均，4°C條件下裂解，離心分離10分鐘，再棄上清液，得二次沉淀物，4°C條件下用EDTA緩沖液洗滌，得細(xì)胞懸濁液；(2)將細(xì)胞懸濁液用30uM網(wǎng)孔濾過，將過濾液在4°C條件下離心分離5分鐘，棄上清液，將該沉淀物加入EDTA緩沖液至300ul 310ul得重懸細(xì)胞液；(3)陰選，取重懸細(xì)胞液300ul，加入IOOul美天旎130-092-211-1液，充分混勻，4°C 放置10分鐘，再加入5ml EDTA緩沖液洗滌，在4°C條件下離心分離5分鐘，棄上清液，將該沉淀物加入EDTA緩沖液500 550ul，加入美天旎130-092-211-2液200ul及美天旎 130-045-801液200ul，混勻，4°C放置15分鐘；以IOml EDTA緩沖液洗滌，棄上清液，將該沉淀物加入EDTA緩沖液至500ul，選用美天旎磁珠分選器，LS分選柱，按該美天旎磁珠分選器說明進(jìn)行分選，收集通過分選柱的細(xì)胞，計數(shù)為IO5-IO6個，4°C條件下離心收集沉淀物；(4)陽選取25 27ulEDTA緩沖液加入步驟( 收集的沉淀物中，得重懸細(xì)胞液，再加 IOul美天旎130-059-901液及IOul美天旎130-050-081液，混勻，4°C避光放置30分鐘； 以ImlEDTA緩沖液洗滌，棄上清液，將該沉淀物加入EDTA緩沖液至500ul，選用美天旎磁珠分選器，LS分選柱，按該美天旎磁珠分選器說明進(jìn)行分選，收集吸附在分選柱上的細(xì)胞，計數(shù)1 X IO4個，離心收集細(xì)胞，得本發(fā)明人骨髓極小胚胎樣干細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明屬于一種分選人骨髓極小胚胎樣干細(xì)胞的方法。該方法的步驟是恒溫4℃條件下進(jìn)行，經(jīng)肝素鹽水抗凝的10ml人骨髓，加入占其3倍體積量的紅細(xì)胞裂解液30ml，混均，離心分離10分鐘，棄上清液，再沉淀物中加入占其2倍體積量的紅細(xì)胞裂解液20ml，混均，離心分離10分鐘，再棄上清液，得二次沉淀物，4℃條件下用EDTA緩沖液洗滌，得細(xì)胞懸濁液；將細(xì)胞懸濁液用30μm網(wǎng)孔濾過，將過濾液在4℃條件下離心分離5分鐘，棄上清液，將該沉淀物加入EDTA緩沖液至300μl～310μl得重懸細(xì)胞液；再經(jīng)陰選和陽選步驟。本發(fā)明能保持極小胚胎樣干細(xì)胞的完好性，方法簡單實用，簡化分選流程，縮短分選時間，提取成本低，能獲得較高的回收率的優(yōu)點。
文檔編號C12N5/074GK102229910SQ20111013290
公開日2011年11月2日 申請日期2011年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月23日
發(fā)明者楊躍進(jìn), 王紅 申請人:楊躍進(jìn), 王紅