專利名稱：一種多重檢測基因組dna多態(tài)性的方法及其專用探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種多重檢測基因組DNA多態(tài)性的方法及其專用探針。
背景技術(shù)：
脫氧核糖核酸(DNA)多態(tài)性是指染色體DNA等位基因中核苷酸排列的差異性， 即DNA區(qū)域中等位基因(或片段)存在兩種或兩種以上的基因型，可分為單核苷酸多態(tài)性 (single nucleotide polymorphism, SNP)禾口插入 / 缺失多態(tài)性(insertion/deletion, In/ Del)。(1)單核苷酸多態(tài)性(SNP)單核苷酸多態(tài)性(SNP)是指染色體基因組水平上單個核苷酸的變異引起的DNA 序列多態(tài)性，其中最少一種等位基因在群體中的出現(xiàn)頻率不少于1%。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個堿基的變異，這種變異可由單個堿基的轉(zhuǎn)換(transition)或顛換 (transversion)所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。但通常所說的SNP并不包括后兩種情況。SNP在基因組內(nèi)可劃分為兩種形式一是遍布于基因組的大量單堿基變異；二是基因編碼區(qū)的功能性突變，由于分布在基因編碼區(qū)(coding region)，故又稱其cSNP?？偟膩碚f，位于編碼區(qū)內(nèi)的SNP (cSNP)比較少，因為在外顯子內(nèi)，其變異率僅及周圍序列的1/5。但它在遺傳性疾病研究中卻具有重要意義，因此cSNP的研究更受關(guān)注。區(qū)分SNPs位點(diǎn)的方法包括①基于雜交的方法，②基于酶的方法，③以構(gòu)象為基礎(chǔ)的方法，④直接測序的方法等。檢測分析技術(shù)包括①凝膠分析技術(shù)，②熒光檢測技術(shù)，③DNA芯片檢測技術(shù)，④質(zhì)譜檢測技術(shù)等。理想的檢測SWs方法必須符合以下特點(diǎn)①具有高的靈敏度和準(zhǔn)確度(反應(yīng)原理嚴(yán)謹(jǐn))，②快速、簡便、高通量，③費(fèi)用相對低廉。但是，目前已有的檢測方法都無法滿足以上要求。(2)插入 / 缺失多態(tài)性(insertion/deletion, InDel)插入/缺失多態(tài)性(insertion/deletion，InDel)，是指兩生物個體在全基因組中的差異，相對另一個個體而言，其中一個個體的基因組中有一定數(shù)量的核苷酸插入或缺失 (Jander, G.，Norris, S. R.，Rounsley, S. D.，Bush，D. F.，Levin, I. Μ. and Last，R. L (2002) Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era. Plant Physiol. 129， 440-450)。短的插入與缺失(20-30核苷酸)主要是DNA復(fù)制過程的錯配造成，比如滑動鏈的錯配，而長的插入與缺失的發(fā)生主要是由不等長的互換或者DNA錯位造成。根據(jù)基因組中插入缺失位點(diǎn)，設(shè)計一些擴(kuò)增這些插入缺失位點(diǎn)的PCR引物，這就是插入/缺失anDel) 標(biāo)記。傳統(tǒng)的檢測插入/缺失標(biāo)記的方法主要是針對一個插入/缺失位點(diǎn)設(shè)計一對PCR引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增、凝膠或毛細(xì)管電泳檢測，一般一次只能檢測一個插入/缺失標(biāo)記，通量很低
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種單鏈DNA分子。本發(fā)明提供的單鏈DNA分子，從5’末端到3’末端依次由如下部分組成與待測 DNA的5’端互補(bǔ)左側(cè)寡核苷酸片段、主體片段和與待測DNA的3’端互補(bǔ)右側(cè)寡核苷酸片段；所述主體片段由如下部分組成用于決定所述單鏈DNA分子大小的長度可變區(qū)和分別位于所述長度可變區(qū)兩側(cè)的引物對區(qū)和公共片段；所述引物對區(qū)為將如下兩條寡核苷酸鏈串聯(lián)連接得到1)能擴(kuò)增所述單鏈DNA分子的一對引物中的一條引物；2)能擴(kuò)增所述單鏈DNA分子一對引物中的另一條引物的反向互補(bǔ)序列的寡核苷酸；所述長度可變區(qū)為大小為45-lOOOnt的寡核苷酸；所述公共片段為大小為13-18nt的寡核苷酸；所述主體片段與所述待測基因不互補(bǔ)。所述一條引物和所述另一條引物的大小均為18_22nt，所述一條引物和所述另一條引物的大小均具體為20nt;所述公共片段為大小具體為15nt的寡核苷酸。以下各個片段為檢測單核苷酸多態(tài)性中的DNA分子對應(yīng)的片段所述長度可變區(qū)的核苷酸序列為如下1)-8)中的任一一種序列表中序列1的第68-112位；序列表中序列2的第68-1 位；序列表中序列3的第62-136位；序列表中序列4的第62-153位；序列表中序列8的第64-125位；序列表中序列9的第64-155位；序列表中序列10的第67-278位；序列表中序列11的第67-299位；所述公共片段的核苷酸序列為序列表中序列1的第113-127位或序列表中序列2 的第130-144位或序列表中序列3的第137-151位或序列表中序列4的第1M-168位或序列表中序列8的第U6-140位或序列表中序列9的第156-170位或序列表中序列10的第 279-293位或序列表中序列11的第300-314位；所述引物對區(qū)的核苷酸序列為序列表中序列1的第觀-67位或序列表中序列2的第觀-67位或序列表中序列3的第22-61位或序列表中序列4的第22-61位或序列表中序列8的第M-63位或序列表中序列9的第M-63位或序列表中序列10的第27-66位或序列表中序列11的第27-66位。本發(fā)明的第二個目的是提供用于檢測DNA單核苷酸多態(tài)性的專用扣手探針。本發(fā)明提供的用于檢測DNA單核苷酸多態(tài)性的專用扣手探針，所述專用扣手探針由m組探針組成，所述每一組探針對應(yīng)一個待測SNP位點(diǎn)，所述單核苷酸多態(tài)性為一個待測 SNP位點(diǎn)存在η種多態(tài)性，所述每一組探針由η條所述的單鏈DNA分子組成，
η為大于等于2的自然數(shù)；m為大于等于1的自然數(shù)；所述每一條單鏈DNA分子的5’端左側(cè)寡核苷酸片段與待測SNP位點(diǎn)的上游片段特異結(jié)合，所述每一條單鏈DNA分子的3’端右側(cè)寡核苷酸與待測SNP位點(diǎn)的下游片段特異結(jié)合，所述每一條單鏈DNA分子的3’末端堿基與待測SNP位點(diǎn)的堿基互補(bǔ)。所述探針組的數(shù)目與所述待測SNP位點(diǎn)的數(shù)目相同；所待測SNP位點(diǎn)的數(shù)目至少為兩個；所述每一組探針中的每條所述的單鏈DNA分子的大小均不相同，所述的單鏈DNA 分子的大小由其的所述長度可變區(qū)決定；每條所述的單鏈DNA分子的5’末端磷酸化，具體為每條所述的單鏈DNA分子的左側(cè)寡核苷酸自5’末端起第一位核苷酸的第5位碳原子上連接磷酸基團(tuán)。所述專用扣手探針由如下兩個探針組組成探針組1由如下兩條所述單鏈DNA分子組成1)序列表中序列1所示的寡核苷酸；2)序列表中序列2所示的寡核苷酸；探針組2由如下兩條所述單鏈DNA分子組成3)序列表中序列3所示的寡核苷酸；4)序列表中序列4所示的寡核苷酸。本發(fā)明的第三個目的是提供一種用于檢測DNA插入或缺失多態(tài)性的專用扣手探針。本發(fā)明提供的用于檢測DNA插入或缺失多態(tài)性的專用扣手探針，所述專用扣手探針由a組探針組成，所述每一組探針對應(yīng)一個待測DNA插入或缺失位點(diǎn)，所述單核苷酸多態(tài)性為一個待測DNA插入或缺失位點(diǎn)存在b種多態(tài)性，所述每一組探針由b條所述的單鏈DNA分子組成，b為大于等于2的自然數(shù)；a為大于等于1的自然數(shù)；所述每一條單鏈DNA分子的5’端左側(cè)寡核苷酸片段與待測插入或缺失位點(diǎn)的上游片段特異結(jié)合，所述每一條單鏈DNA分子的3’端右側(cè)寡核苷酸與待測插入或缺失位點(diǎn)的下游片段特異結(jié)合。所述單鏈DNA分子的數(shù)目與所述DNA的插入或缺失位點(diǎn)的數(shù)目相同；所述DNA的插入或缺失位點(diǎn)至少為2個；所述每條單鏈DNA分子的大小均不相同，所述的單鏈DNA分子的大小由其的所述長度可變區(qū)決定；每條所述的單鏈DNA分子的5’末端磷酸化，具體為每條所述的單鏈DNA分子的左側(cè)寡核苷酸自5’末端起第一位核苷酸的第5位碳原子上連接磷酸基團(tuán)；所述專用扣手探針由如下兩個探針組組成探針組1由如下兩條所述單鏈DNA分子組成1)序列表中序列8所示的寡核苷酸；2)序列表中序列9所示的寡核苷酸；
探針組2由如下兩條所述單鏈DNA分子組成3)序列表中序列10所示的寡核苷酸；4)序列表中序列11所示的寡核苷酸。含有所述單鏈DNA分子或所述的專用扣手探針的試劑盒也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述單鏈DNA分子或所述的專用扣手探針在DNA分子多態(tài)性鑒定中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述多態(tài)性為單核苷酸多態(tài)性或插入或缺失多態(tài)性；所述單核苷酸多態(tài)性具體由至少兩個SNP位點(diǎn)引起的單核苷酸多態(tài)性；所述插入或缺失多態(tài)性具體由至少2個插入或缺失位點(diǎn)引起的插入或缺失多態(tài)性。所述生物為植物，所述植物具體為粗山羊草或大麥；所述至少兩個SNP位點(diǎn)引起的單核苷酸多態(tài)性具體為序列表中序列5所示DNA分子第62位核苷酸的多態(tài)性和序列表中序列6所示DNA分子第174位核苷酸的多態(tài)性；所述序列表中序列5所示DNA分子第62位核苷酸的多態(tài)性為序列表中序列5所示DNA分子的第62位核苷酸為A或G ；所述序列表中序列6所示DNA分子第174位核苷酸的多態(tài)性為序列表中序列6所示DNA分子第174位核苷酸為T或C ；所述序列表中序列5所示DNA分子和序列表中序列6所示DNA分子為粗山羊草 (Aegilops tauschii)的兩個SNP所在的序列。粗山羊草2280和2282品種在序列5中的第62位核苷酸具有多態(tài)性，分別為AA和GG ；粗山羊草2280和2282品種在序列6中的第 175為核苷酸具有多態(tài)性，分別為TT和CC。所述至少2個插入或缺失位點(diǎn)引起的插入或缺失多態(tài)性具體為1)和2)1)序列表中序列12所示的DNA分子自5，末端的第120-121位之間插入CCGTC得到序列表中的序列13所示的DNA分子；或序列表中序列13所示的DNA分子自5’末端的第 121-125位缺失CCGTC得到序列表中的序列12所示的DNA分子；2)序列表中序列15所示的DNA分子自5，末端的第116-117位插入GCCCAT得到序列表中的序列14所示的DNA分子；或序列表中序列14所示的DNA分子自5’末端的第 117-122位缺失GCCCAT得到序列表中的序列15所示的DNA分子。所述序列表中序列12所示DNA分子或序列13所示DNA分子與序列表中序列14 所示DNA分子或序列15所示DNA分子為大麥的兩個插入/缺失標(biāo)記所在的DNA序列。本發(fā)明的第四個目的是提供一種檢測生物基因組單核苷酸多態(tài)性的方法。本發(fā)明提供的一種檢測生物基因組單核苷酸多態(tài)性的方法，包括如下步驟1)將所述用于檢測DNA單核苷酸多態(tài)性的專用扣手探針中的所有單鏈DNA分子與基因組片段連接環(huán)化，得到扣手探針的環(huán)化產(chǎn)物；2)以步驟1)得到的環(huán)化產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR，根據(jù)得到PCR產(chǎn)物的大小確定生物
基因組單核苷酸的多態(tài)性。步驟1)中，在所述連接環(huán)化之前，還包括將所述基因組片段打碎為80_250bp大小的DNA分子；所述連接環(huán)化體系包括連接緩沖液、連接酶、扣手探針、80_250bp大小的DNA片段，所述連接酶在所述連接體系中的濃度為0. 04U/ul，所述每個扣手探針在所述連接體系中的濃度均為0. 04ng/ul，所述80-250bp大小的DNA分子在所述連接體系中的濃度為 24ng/ul ；步驟2)中，所述PCR的引物為所述單鏈DNA分子中的引物對區(qū)對應(yīng)的能擴(kuò)增所述單鏈DNA分子的一對引物中的所述一條引物和所述另一條引物；所述一條引物的核苷酸序列為序列表中序列1的第48-67位或序列表中序列2的第48-67位或序列表中序列3的第42-61位或序列表中序列4的第42-61位；所述另一條引物的反向互補(bǔ)片段的核苷酸序列為序列表中序列1的第觀-47位序列表中序列2的第觀-47位或序列表中序列3的第22-41位或序列表中序列4的第22-41 位。所述根據(jù)得到PCR產(chǎn)物的大小確定生物基因組單核苷酸的多態(tài)性為通過PCR產(chǎn)物大小，確定與其大小相同的所述專用扣手探針中的一條單鏈DNA分子，通過所述單鏈DNA分子中3’末端的堿基，確定對應(yīng)的SNP位點(diǎn)，從而確定生物基因組單核苷酸的多態(tài)性。本發(fā)明的第五個目的是提供一種檢測生物基因組插入或缺失多態(tài)性的方法。本發(fā)明提供的檢測生物基因組插入或缺失多態(tài)性的方法，包括如下步驟1)將所述用于檢測DNA插入或缺失多態(tài)性的專用扣手探針的所有單鏈DNA分子與基因組片段連接環(huán)化，得到扣手探針環(huán)化產(chǎn)物；2)以步驟1)得到的環(huán)化產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR，根據(jù)得到PCR產(chǎn)物的大小確定生物基因組插入或缺失的多態(tài)性；步驟1)中，在所述連接環(huán)化之前，還包括將所述基因組片段打碎為80_250bp大小的DNA分子；所述連接環(huán)化的體系包括連接緩沖液、連接酶、扣手探針、80_250bp大小的DNA 片段，所述連接酶在所述連接體系中的濃度為0. 04U/ul，所述每個扣手探針在所述連接體系中的濃度均為0. 04ng/ul，所述80-250bp大小的DNA分子在所述連接體系中的濃度為 24ng/ul ；步驟2)中，所述PCR的引物為所述單鏈DNA分子中的引物對區(qū)對應(yīng)的能擴(kuò)增所述單鏈DNA分子的一對引物中的所述一條引物和所述另一條引物；所述一條引物的核苷酸序列為序列表中序列8的第44-63位或序列表中序列9的第44-63位或序列表中序列10的第47-66位或序列表中序列11的第47-66位；。所述另一條引物的反向互補(bǔ)片段的核苷酸序列為序列表中序列8的第M-43位或序列表中序列9的第M-43位或序列表中序列10的第27-46位或序列表中序列11的第 27-46 位。所述根據(jù)得到PCR產(chǎn)物確定生物基因組插入或缺失的多態(tài)性為若有PCR產(chǎn)物，通過PCR產(chǎn)物的大小，確定與其大小相同的所述專用扣手探針中的對應(yīng)的單鏈DNA分子，根據(jù)所述對應(yīng)的單鏈DNA分子的左側(cè)寡核苷酸片段和右側(cè)寡核苷酸片段確定與其互補(bǔ)生物基因組上游片段和下游片段間沒有插入或缺失的多態(tài)性；若沒有PCR產(chǎn)物，與所述專用扣手探針中其余的單鏈DNA分子的左側(cè)寡核苷酸片段和右側(cè)寡核苷酸片段的分別互補(bǔ)的生物基因組上游片段和下游片段間有插入或缺失多態(tài)性。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明提供的單鏈DNA分子，為針對不同脫氧核糖核酸標(biāo)記位點(diǎn)及其等位位點(diǎn)的不同，設(shè)計長度各不相同的扣手探針，通過連接酶反應(yīng)區(qū)別出不同標(biāo)記和不同等位位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增連接成功的不同長度的扣手探針，經(jīng)過凝膠或毛細(xì)管電泳分離及檢測體系，實現(xiàn)同時檢測多個脫氧核糖核酸標(biāo)記的多態(tài)性，能實現(xiàn)高的靈敏度和準(zhǔn)確度， 同時滿足高通量和低費(fèi)用的要求。


圖1為兩條不同長度扣手探針檢測一個單核苷酸多態(tài)性(SNP)標(biāo)記的兩個等位位點(diǎn)示意2為兩條不同長度扣手探針檢測一個插入/缺失多態(tài)性anDel)標(biāo)記的兩個等位位點(diǎn)示意3為迷你柱狀電泳儀設(shè)計4為扣手探針的SNP分型(5%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳)圖5為扣手探針的InDel標(biāo)記分型(3%瓊脂糖凝膠電泳)圖6為扣手探針的InDel標(biāo)記分型(5%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳)
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。本發(fā)明針對不同脫氧核糖核酸標(biāo)記位點(diǎn)及其等位位點(diǎn)的不同，設(shè)計長度各不相同的扣手探針，通過連接酶反應(yīng)區(qū)別出不同標(biāo)記和不同等位位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增連接成功的不同長度的扣手探針，經(jīng)過凝膠或毛細(xì)管電泳分離及檢測體系，實現(xiàn)同時檢測多個脫氧核糖核酸標(biāo)記的多態(tài)性，設(shè)計方案如圖1和圖2所示。圖1為兩條不同長度扣手探針檢測一個單核苷酸多態(tài)性(SNP)標(biāo)記的兩個等位位點(diǎn)示意圖，其中SP 長度可變的區(qū)間，長度可調(diào)整范圍45-lOOOnt ；Pl 為公共PCR引物的反向引物，長度為20nt ；P2 為公共PCR引物的正向引物，長度為20nt ；CS 為公共序列，長度為15nt ；LF 為左翼互補(bǔ)序列，長度一般在20-30nt之間，根據(jù)與目標(biāo)DNA匹配程度及退火溫度可調(diào)整；RF 為右翼互補(bǔ)序列，長度一般在20-30nt之間，根據(jù)與目標(biāo)DNA匹配程度及退火溫度可調(diào)整；Pdp 扣手探針?？凼痔结楶dpl的總長度為155nt，Pdp2的總長度為 170nt，它們相差15nt，這兩個扣手探針的PCR產(chǎn)物可以在3%的瓊脂糖凝膠上檢測。A 扣手探針Pdpl的3’末端堿基與目標(biāo)DNA完全匹配，即C和G互補(bǔ)，在連接酶作用下，Pdpl被環(huán)化，用Pl和P2兩條公共引物PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)生155nt的PCR產(chǎn)物，可在5%的聚丙烯酰胺凝膠或者3%的瓊脂糖凝膠或者毛細(xì)管電泳分離檢測。B 扣手探針Pdpl的3’末端堿基與目標(biāo)DNA不匹配，即C和T不互補(bǔ)，在連接酶作用下，Pdpl不能被環(huán)化，用Pl和P2兩條公共引物PCR擴(kuò)增后，沒有PCR產(chǎn)物。C 扣手探針Pdp2的3’末端堿基與目標(biāo)DNA完全匹配，S卩A禾Π T互補(bǔ)，在連接酶作用下，Pdp2被環(huán)化，用Pl和P2兩條公共引物PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)生170nt的PCR產(chǎn)物，可在5%的聚丙烯酰胺凝膠或者3%的瓊脂糖分離檢測。D 扣手探針 Pdp2的3’末端堿基與目標(biāo)DNA不匹配，即A和G不互補(bǔ)，在連接酶作用下，扣手探針2不能被環(huán)化，用Pl和P2兩條公共引物PCR擴(kuò)增后，沒有PCR產(chǎn)物。圖2為兩條不同長度扣手探針檢測一個插入/缺失多態(tài)性anDel)標(biāo)記的兩個等位位點(diǎn)示意圖，SP 長度可變的區(qū)間，長度可調(diào)整范圍45-lOOOnt ；Pl 為公共PCR引物的反向引物，長度為20nt ；P2 為公共PCR引物的正向引物，長度為20nt ；CS 為公共序列，長度為15nt ；LF:為左翼互補(bǔ)序列，長度一般在20-30nt之間，根據(jù)與目標(biāo)DNA匹配程度及退火溫度可調(diào)整；RF 為右翼互補(bǔ)序列，長度一般在20-30nt之間，根據(jù)與目標(biāo)DNA匹配程度及退火溫度可調(diào)整；Pdp 扣手探針?？凼痔结楶dp3的總長度為185nt，Pdp4的總長度為 200nt，它們相差15nt，這兩個扣手探針的PCR產(chǎn)物可以在3%的瓊脂糖凝膠上檢測。A 扣手探針Pdp3的左翼互補(bǔ)序列和右翼互補(bǔ)序列與目標(biāo)DNA完全匹配，在連接酶作用下，扣手探針3被環(huán)化，用Pl和P2兩條公共引物PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)生185nt的PCR產(chǎn)物，可在5%的聚丙烯酰胺凝膠或3%的瓊脂糖凝膠或毛細(xì)管電泳分離檢測。B 在與Pdp3左翼互補(bǔ)序列和右翼互補(bǔ)序列匹配的目標(biāo)DNA中間插入一段DNA片段后，在連接酶作用下，扣手探針3不能被環(huán)化，用Pl和P2兩條公共引物PCR擴(kuò)增后，沒有PCR產(chǎn)物。C :Pdp4的左翼互補(bǔ)序列和右翼互補(bǔ)序列與目標(biāo)DNA完全匹配，在連接酶作用下，扣手探針4被環(huán)化，用Pl和P2兩條公共引物PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)生200nt的PCR產(chǎn)物，可在5%的聚丙烯酰胺凝膠或者3%的瓊脂糖凝膠或毛細(xì)管電泳分離檢測。D 在與Pdp4左翼互補(bǔ)序列和右翼互補(bǔ)序列匹配的目標(biāo) DNA中間缺失一段DNA片段后，Pdp4不能與目標(biāo)DNA完全匹配，在連接酶作用下，扣手探針 4不能被環(huán)化，用Pl和P2兩條公共引物PCR擴(kuò)增后，沒有PCR產(chǎn)物。實施例1、單核苷酸多態(tài)性(SNP)的扣手探針一、粗山羊草(Aegilops tauschii)基因組的兩個SNP檢測1、扣手探針 PdPCJ819266A、PdPCJ819266G、PdPBE6^15T、PdPBE6^15C 的設(shè)計粗山羊草(Aegilopstauschii)的染色體組是普通小麥(Triticum aestivum)D 染色體組的供體。PdPCJ819266和PdPBE6^15為粗山羊草(Aegilops tauschii)的兩個 SNP,其中AA和TT為粗山羊草品種2280的基因型，而GG和CC為粗山羊草品種2282的基因型，即粗山羊草2280和2282品種在序列5中的第62位核苷酸具有多態(tài)性，分別為AA和 GG ；粗山羊草2280和2282品種在序列6中的第175為核苷酸具有多態(tài)性，分別為TT和CC。其中扣手探針PdPCJ819266A特異識別等位基因A，長度為147nt，扣手探針 PdPCJ819266G特異識別等位基因G，長度為16^t，扣手探針PdPBE6^15T特異識別等位基因T，長度為176nt，扣手探針PdPBE6^15C特異識別等位基因C，長度為193nt。四條扣手探針的5’末端均磷酸化，序列設(shè)計和結(jié)構(gòu)說明見表1。表1、扣手探針的序列設(shè)計與結(jié)構(gòu)說明
權(quán)利要求
1.一種單鏈DNA分子，從5’末端到3’末端依次由如下部分組成與待測DNA的5’端互補(bǔ)左側(cè)寡核苷酸片段、主體片段和與待測DNA的3’端互補(bǔ)右側(cè)寡核苷酸片段；所述主體片段由如下部分組成用于決定所述單鏈DNA分子大小的長度可變區(qū)和分別位于所述長度可變區(qū)兩側(cè)的引物對區(qū)和公共片段；所述引物對區(qū)為將如下兩條寡核苷酸鏈串聯(lián)連接得到1)能擴(kuò)增所述單鏈DNA分子的一對引物中的一條引物；2)能擴(kuò)增所述單鏈DNA分子一對引物中的另一條引物的反向互補(bǔ)序列的寡核苷酸； 所述長度可變區(qū)為大小為45-lOOOnt的寡核苷酸；所述公共片段為大小為13-18nt的寡核苷酸； 所述主體片段與所述待測基因不互補(bǔ)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單鏈DNA分子，其特征在于所述一條引物和所述另一條引物的大小均為18-22nt，所述一條引物和所述另一條引物的大小均具體為20nt ；所述公共片段為大小為15nt的寡核苷酸；所述長度可變區(qū)的核苷酸序列為如下1)-4)中的任一一種序列表中序列1的第68-112位；序列表中序列2的第68-1 位；序列表中序列3的第62-136位；序列表中序列4的第62-153位；序列表中序列8的第64-125位；序列表中序列9的第64-155位；序列表中序列10的第67-278位；序列表中序列11的第67-299位；所述公共片段的核苷酸序列為序列表中序列1的第113-127位或序列表中序列2的第 130-144位或序列表中序列3的第137-151位或序列表中序列4的第1M-168位或序列表中序列8的第U6-140位或序列表中序列9的第156-170位或序列表中序列10的第279-293 位或序列表中序列11的第300-314位；所述引物對區(qū)的核苷酸序列為序列表中序列1的第觀-67位或序列表中序列2的第 28-67位或序列表中序列3的第22-61位或序列表中序列4的第22-61位或序列表中序列 8的第M-63位或序列表中序列9的第M-63位或序列表中序列10的第27-66位或序列表中序列11的第27-66位。
3.用于檢測DNA單核苷酸多態(tài)性的專用扣手探針，所述專用扣手探針由m組探針組成， 所述每一組探針對應(yīng)一個待測SNP位點(diǎn)，所述單核苷酸多態(tài)性為一個待測SNP位點(diǎn)存在η 種多態(tài)性，所述每一組探針由η條權(quán)利要求1或2所述的單鏈DNA分子組成， η為大于等于2的自然數(shù)； m為大于等于1的自然數(shù)；所述每一條單鏈DNA分子的5’端左側(cè)寡核苷酸片段與待測SNP位點(diǎn)的上游片段特異結(jié)合，所述每一條單鏈DNA分子的3’端右側(cè)寡核苷酸與待測SNP位點(diǎn)的下游片段特異結(jié)合，所述每一條單鏈DNA分子的3’末端堿基與待測SNP位點(diǎn)的堿基互補(bǔ)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的專用扣手探針，其特征在于 所述探針組的數(shù)目與所述待測SNP位點(diǎn)的數(shù)目相同； 所待測SNP位點(diǎn)的數(shù)目至少為兩個；所述每一組探針中的每條所述的單鏈DNA分子的大小均不相同，所述的單鏈DNA分子的大小由其的所述長度可變區(qū)決定；每條所述的單鏈DNA分子的5’末端磷酸化，具體為每條所述的單鏈DNA分子的左側(cè)寡核苷酸自5’末端起第一位核苷酸的第5位碳原子上連接磷酸基團(tuán)； 所述專用扣手探針由如下兩個探針組組成 探針組1由如下兩條所述單鏈DNA分子組成1)序列表中序列1所示的寡核苷酸；2)序列表中序列2所示的寡核苷酸； 探針組2由如下兩條所述單鏈DNA分子組成3)序列表中序列3所示的寡核苷酸；4)序列表中序列4所示的寡核苷酸。
5.用于檢測DNA插入或缺失多態(tài)性的專用扣手探針，所述專用扣手探針由a組探針組成，所述每一組探針對應(yīng)一個待測DNA插入或缺失位點(diǎn)，所述單核苷酸多態(tài)性為一個待測 DNA插入或缺失位點(diǎn)存在b種多態(tài)性，所述每一組探針由b條權(quán)利要求1或2所述的單鏈DNA分子組成， b為大于等于2的自然數(shù)； a為大于等于1的自然數(shù)；所述每一條單鏈DNA分子的5’端左側(cè)寡核苷酸片段與待測插入或缺失位點(diǎn)的上游片段特異結(jié)合，所述每一條單鏈DNA分子的3’端右側(cè)寡核苷酸與待測插入或缺失位點(diǎn)的下游片段特異結(jié)合。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的專用扣手探針，其特征在于 所述DNA的插入或缺失位點(diǎn)至少為2個；所述每條單鏈DNA分子的大小均不相同，所述的單鏈DNA分子的大小由其的所述長度可變區(qū)決定；每條所述的單鏈DNA分子的5’末端磷酸化，具體為每條所述的單鏈DNA分子的左側(cè)寡核苷酸自5’末端起第一位核苷酸的第5位碳原子上連接磷酸基團(tuán)； 所述專用扣手探針由如下兩個探針組組成 探針組1由如下兩條所述單鏈DNA分子組成1)序列表中序列8所示的寡核苷酸；2)序列表中序列9所示的寡核苷酸； 探針組2由如下兩條所述單鏈DNA分子組成3)序列表中序列10所示的寡核苷酸；4)序列表中序列11所示的寡核苷酸。
7.含有權(quán)利要求1或2所述單鏈DNA分子或權(quán)利要求3-6中任一所述的專用扣手探針的試劑盒。
8.權(quán)利要求1或2所述單鏈DNA分子或權(quán)利要求3-6中任一所述的專用扣手探針在 DNA分子多態(tài)性鑒定中的應(yīng)用；所述多態(tài)性為單核苷酸多態(tài)性或插入或缺失多態(tài)性； 所述單核苷酸多態(tài)性具體由至少兩個SNP位點(diǎn)引起的單核苷酸多態(tài)性； 所述插入或缺失多態(tài)性具體由至少2個插入或缺失位點(diǎn)引起的插入或缺失多態(tài)性； 所述至少兩個SNP位點(diǎn)引起的單核苷酸多態(tài)性具體為序列表中序列5所示DNA分子第 62位核苷酸的多態(tài)性和序列表中序列6所示DNA分子第174位核苷酸的多態(tài)性；所述序列表中序列5所示DNA分子第62位核苷酸的多態(tài)性為序列表中序列5所示DNA 分子的第62位核苷酸為A或G ；所述序列表中序列6所示DNA分子第174位核苷酸的多態(tài)性為序列表中序列6所示 DNA分子第174位核苷酸為T或C ；所述至少2個插入或缺失位點(diǎn)引起的插入或缺失多態(tài)性具體為1)和2)1)序列表中序列12所示的DNA分子自5，末端的第120-121位之間插入CCGTC得到序列表中的序列13所示的DNA分子；或序列表中序列13所示的DNA分子自5’末端的第 121-125位缺失CCGTC得到序列表中的序列12所示的DNA分子；2)序列表中序列15所示的DNA分子自5’末端的第116-117位插入GCCCAT得到序列表中的序列14所示的DNA分子；或序列表中序列14所示的DNA分子自5’末端的第117-122 位缺失GCCCAT得到序列表中的序列15所示的DNA分子。所述序列表中序列12所示DNA分子或序列13所示DNA分子與序列表中序列14所示 DNA分子或序列15所示DNA分子為大麥的兩個插入/缺失標(biāo)記所在的DNA序列。
9.一種檢測生物基因組單核苷酸多態(tài)性的方法，包括如下步驟1)將權(quán)利要求3或4所述的專用扣手探針中的所有單鏈DNA分子與基因組片段連接環(huán)化，得到扣手探針的環(huán)化產(chǎn)物；2)以步驟1)得到的環(huán)化產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR，根據(jù)得到PCR產(chǎn)物的大小確定生物基因組單核苷酸的多態(tài)性；步驟1)中，在所述連接環(huán)化之前，還包括將所述基因組片段打碎為80-250bp大小的 DNA分子；所述連接環(huán)化的體系包括連接緩沖液、連接酶、扣手探針、80-250bp大小的DNA片段， 所述連接酶在所述連接體系中的濃度為0. 04U/ul，所述每個扣手探針在所述連接體系中的濃度均為0. 04ng/ul，所述80-250bp大小的DNA分子在所述連接體系中的濃度為Mng/ul ； 步驟2)中，所述PCR的引物為所述單鏈DNA分子中的引物對區(qū)對應(yīng)的能擴(kuò)增所述單鏈 DNA分子的一對引物中的所述一條引物和所述另一條引物；所述一條引物的核苷酸序列為序列表中序列1的第48-67位或序列表中序列2的第 48-67位或序列表中序列3的第42-61位或序列表中序列4的第42-61位；所述另一條引物的反向互補(bǔ)片段的核苷酸序列為序列表中序列1的第觀-47位序列表中序列2的第觀-47位或序列表中序列3的第22-41位或序列表中序列4的第22-41位。
10.一種檢測生物基因組插入或缺失多態(tài)性的方法，包括如下步驟1)將權(quán)利要求5或6的所述的專用扣手探針的所有單鏈DNA分子與基因組片段連接環(huán)化，得到扣手探針環(huán)化產(chǎn)物；2)以步驟1)得到的環(huán)化產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR，根據(jù)得到PCR產(chǎn)物確定生物基因組插入或缺失的多態(tài)性；步驟1)中，在所述連接環(huán)化之前，還包括將所述基因組片段打碎為80-250bp大小的 DNA分子；所述連接環(huán)化的體系包括連接緩沖液、連接酶、扣手探針、80-250bp大小的DNA片段， 所述連接酶在所述連接體系中的濃度為0. 04U/ul，所述每個扣手探針在所述連接體系中的濃度均為0. 04ng/ul，所述80-250bp大小的DNA分子在所述連接體系中的濃度為Mng/ul ； 步驟2)中，所述PCR的引物為所述單鏈DNA分子中的引物對區(qū)對應(yīng)的能擴(kuò)增所述單鏈 DNA分子的一對引物中的所述一條引物和所述另一條引物；所述一條引物的核苷酸序列為序列表中序列8的第44-63位或序列表中序列9的第 44-63位或序列表中序列10的第47-66位或序列表中序列11的第47-66位；。所述另一條引物的反向互補(bǔ)片段的核苷酸序列為序列表中序列8的第M-43位或序列表中序列9的第M-43位或序列表中序列10的第27-46位或序列表中序列11的第27-46 位。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種多重檢測基因組DNA多態(tài)性的方法及其專用探針。本發(fā)明提供了一種單鏈DNA分子，從5′末端到3′末端依次由如下部分組成與待測DNA的5′端互補(bǔ)左側(cè)寡核苷酸片段、主體片段和與待測DNA的3′端互補(bǔ)右側(cè)寡核苷酸片段；本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明提供的單鏈DNA分子，通過連接酶反應(yīng)區(qū)別出不同標(biāo)記和不同等位位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增連接成功的不同長度的扣手探針，經(jīng)過凝膠或毛細(xì)管電泳分離及檢測體系，實現(xiàn)同時檢測多個脫氧核糖核酸標(biāo)記的多態(tài)性，能實現(xiàn)高的靈敏度和準(zhǔn)確度，同時滿足高通量和低費(fèi)用的要求。
文檔編號C12Q1/68GK102181443SQ20111012124
公開日2011年9月14日 申請日期2011年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月21日
發(fā)明者曹曉花, 漆小泉 申請人:中國科學(xué)院植物研究所