專利名稱：一種多重pcr進行鴨親子鑒定的方法及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及了進行鴨親子鑒定的STR標記的PCR擴增和檢測以及親緣關系鑒定的技術方法，適合在鴨養(yǎng)殖和育種中進行種質鑒定和親緣關系鑒定。
背景技術：
親子鑒定(parentage identification)又稱親權鑒定、個體識別等，它是利用生物學、分子遺傳學及醫(yī)學的理論和技術，從子代和親代的形態(tài)構造或生理機能、遺傳的物質基礎等方面的相似特點，分析遺傳特征，判斷親代與子代是否有親緣關系的方法(錢林東等，2010)。親子鑒定技術在日常法醫(yī)檢驗以及畜牧業(yè)生產中有重要的應用價值，親子鑒定方法有多種，早期的有血型測試法、白細胞抗原鑒定法和染色體多態(tài)性鑒定法等；隨著分子遺傳學研究的深入，多種基因組水平的分子遺傳標記檢測技術已應用到親子鑒定中來，這些DNA分子標記技術是以個體間遺傳物質內核苷酸序列變異為基礎的遺傳標記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接反映。DNA分子標記具有諸多優(yōu)點，其中最適合用于親子鑒定的DNA 分子標記有線粒體DNA標記、DNA指紋標記、小衛(wèi)星變異重復序列標記、微衛(wèi)星標記STR等 (Hill蓋 ot al. 2008)。微衛(wèi)星標記(microsatellite marker)又稱簡單重復序列(simple sequence repeats, SSR)、短串聯(lián)重復(short tandem repeat, STR)等，已被廣泛應用于連鎖圖譜的構建、個體識別、親子鑒定、基因定位、遺傳多樣性分析、疾病診斷等領域。利用微衛(wèi)星標記進行親子鑒定在人類法醫(yī)學上已有廣泛應用，在動植物中也有大量報道。利用DNA微衛(wèi)星標記和SNP位點對未知系譜的動物群體進行親緣關系鑒定在國際上已有成功應用。1996年國際動物遺傳學會(ISAG，International Society of Animal Genetics,http://www. isag. org)年會上提出了牛、豬、馬、狗等幾種家畜親子鑒定中使用的微衛(wèi)星標記建議。張亞平等 1995年分離了 10個大熊貓微衛(wèi)星標記可用于大熊貓的親子鑒定，張于光等在2003年將微衛(wèi)星標記應用于東北虎的親子鑒定，都取得了很好的效果，具有很高的準確度；葉俊華等 (2005)采用多重PCR和基因組掃描技術檢測了公安部直屬四家警犬基地進口種犬和準繁犬7個品種共269頭樣本10個微衛(wèi)星DNA多態(tài)性，結果發(fā)現(xiàn)該10個微衛(wèi)星位點的非父排除率為99. 7287%、個體識別率為99. 999%，建立了警犬STR-DNA親子鑒定方法；Ellegren等 (199 用5個馬科的微衛(wèi)星標記判定馬的親權關系可使排除率達98 %以上，10個標記排除率達99. 99%;Glowatzki-Mullis等(1995)利用不同染色體上的6個多態(tài)STR標記檢測了 238頭牛的等位基因頻率，成功解決了用傳統(tǒng)的血型鑒定方法無法確定的35頭牛的親權確認問題；Ozkan等Q009)利用12個微衛(wèi)星標記對荷斯坦奶牛群體進行了親子鑒定分析，其中包括了由ISAG推薦的9個位點，結果表明這12個標記的排除概率至少為99. 9%，大部分 (95. 3% )的親權關系得到了確認JteVanovicK2009，2010)等利用11個微衛(wèi)星標記分別在不同的西門塔爾牛群體中進行親子鑒定，結果表明其排除概率可以達到99.9%。目前STR標記在禽類中進行親子鑒定的研究極少，多用于遺傳多樣性分析以及遺傳基因的流動等(Qu 等，.nt al. 2006 :Berthouly 等，，Ot al. 2008,2009)；在水禽中利用STR標記進行親子鑒定的研究極少，Reichart等Q010)利用蛋白質指紋技術和10個微衛(wèi)星標記鑒定了棕硬尾鴨間的親緣關系。以上研究結果表明鴨的微衛(wèi)星DNA標記研究已經取得了重要進展并有了很好的應用，如何進一步在鴨的育種工作中發(fā)揮更大的作用是一個非常值得研究的領域。我國是世界上最大的肉鴨生產國和消費國，在養(yǎng)禽業(yè)中的比重越來越大。我國有許多具有優(yōu)良遺傳特性的地方鴨品種，但是缺乏有效的開發(fā)利用，鴨的育種工作進展緩慢， 科技含量較低，有必要借助分子生物學的手段輔助提升鴨育種的技術水平和加快育種進展。建立完整準確的系譜記錄是鴨育種工作的基礎，對于提升我國鴨育種水平，提高育種效率有著重要作用和意義。利用本方法可以在不改變目前種鴨地面散養(yǎng)、自由交配的飼養(yǎng)模式的前提下準確的建立起兩代鴨群間的系譜記錄，而且準確快速，有利于加快選育進展。

發(fā)明內容
本發(fā)明研制了一種利用20個STR標記對未知親緣關系的鴨親本與子代間進行親子鑒定的技術方法，并提供了該技術的操作方法。該方法的技術方案如下本發(fā)明一方面涉及一種多重PCR進行鴨親子鑒定的方法，其特征在于包括如下步驟對親本和子代鴨提取DNA，按照下表合成熒光引物；
權利要求
1. 一種多重PCR進行鴨親子鑒定的方法，其特征在于包括如下步驟對親本和子代鴨提取DNA，按照下表合成熒光引物；標記名稱熒光類型上游引物下游引物DLOl6-FAMACAGCTTCAGCAGACTTAGAGCAGAAAGTGTATTAAGGAAGDL026-FAMTCCACTTGGTAGACCTTGAGTGGGATTCAGTGAGAAGCCTDL03HEXCTGGGTTTGGTGGAGCATAATACTGGCTGCTTCATTGCTGDL04TAMRATGCTATCCACCCAATAAGTGCAAAGTTAGCTGGTATCTGCDL05HEXTTTAGGTAAAACTGTGAATCAAATCAAAGCAGGGAGCTAAGDL06HEXACGTCACATCACCCCACAGCTTTGCCTCTGGTGAGGTTCDL076-FAMGTGCCTAACCCTGATGGATGCTTATCAGATGGGGCTCGGADL08TAMRAGATAATGGCTGGCTCCTTGAGACCACAACATCGTGCAGAGDL09TAMRAGGGACATCTCTTGGAGCAAAAGTGAAAGCTGCTGCTGGATDLlO6-FAMGAAAGAATGAGTTAAAAAGGCATGAGGCTTAATTGGTGGACADLll6-FAMTTAGTAAACTCTTGCCATCTTGTAGTTTAGTTGCTGGATADL12TAMRAGGACAAGTGGCATGTGTCATGGCTTCTGTGCTCCTCAGATDL13HEXAGAAAGCTCCTGTATGTGATATGCTGGTGTGAGATTTGAADL14HEXGATGTGTCTTTTCCAGGTGCGCATCCCATCTTCAAAGCAGDL15TAMRACAGCGTCCCCAGAAACTTGACCCTCGTATTATCCAGTCCGDL166-FAMGCTGCCTGGAATATAACCGCGCATTTGCAGAGTCAGGACCDL17TAMRAGCAATAAAGGCTGGAGCAATATCCTCTCCCTCGCATDL186-FAMGAAAAAGGCAGCACAGCACGCAAAGTTGAGGCATGTAATCDL19HEXTGACATTACACACCCAAACCAAGGGCAGGGGTAAGGATDL20 ΕΓ'i'GACC'I'CCC'I'GACGTTTGCGTCTGCGTGTCCGTGTATG使用表中的引物對提取的DNA進行多重PCR擴增，并進行熒光電泳檢測，對電泳結果進行分析得到所有個體的基因型數(shù)據(jù)，對親本和子代進行親緣關系分析。
2.根據(jù)權利要求1所述一種多重PCR進行鴨親子鑒定的方法，其特征在于按下表所述的條件進行PCR擴增pc r 增；&合標記名稱熒光類型上游引物下游引物Tm (。C)ADL04TAMRATGCTATCCACCCAATAAGTGCAAAGTTAGCTGGTATCTGC51DL08TAMRAGATAATGGCTGGCTCCTTGAGACCACAACATCGTGCAGAGDL19HEXTGACATTACACACCCAAACCAAGGGCAGGGGTAAGGATBDLOl6-FAMACAGCTTCAGCAGACTTAGAGCAGAAAGTGTATTAAGGAAG58DLlO6-FAMGAAAGAATGAGTTAAAAAGGCATGAGGCTTAATTGGTGGACADL17TAMRAGCAATAAAGGCTGGAGCAATATCCTCTCCCTCGCATDL20HEXTGACCTCCCTGACGTTTGCGTCTGCGTGTCCGTGTATGCDL09TAMRAGGGACATCTCTTGGAGCAAAAGTGAAAGCTGCTGCTGGAT61DLll6-FAMTTAGTAAACTCTTGCCATCTTGTAGTTTAGTTGCTGGATADL166-FAMGCTGCCTGGAATATAACCGCGCATTTGCAGAGTCAGGACCDDL026-FAMTCCACTTGGTAGACCTTGAGTGGGATTCAGTGAGAAGCCT61DL03HEXCTGGGTTTGGTGGAGCATAATACTGGCTGCTTCATTGCTGDL14HEXGATGTGTCTTTTCCAGGTGCGCATCCCATCTTCAAAGCAGEDL06HEXACGTCACATCACCCCACAGCTTTGCCTCTGGTGAGGTTC60. 5DL13HEXAGAAAGCTCCTGTATGTGATATGCTGGTGTGAGATTTGAADL186-FAMGAAAAAGGCAGCACAGCACGCAAAGTTGAGGCATGTAATCFDL076-FAMGTGCCTAACCCTGATGGATGCTTATCAGATGGGGCTCGGA64.5DL12TAMRAGGACAAGTGGCATGTGTCATGGCTTCTGTGCTCCTCAGATGDL05HEXTTTAGGTAAAACTGTGAATCAAATCAAAGCAGGGAGCTAAG51HDL15TAMRACAGCGTCCCCAGAAACTTGACCCTCGTATTATCCAGTCCG63. 5
3.根據(jù)權利要求1或2所述的鴨親子鑒定方法，其特征在于所述的鴨為巢湖鴨或北京塍。
4.根據(jù)權利要求1-3任意一項所述的鴨親子鑒定方法，其特征在于通過軟件對電泳結果和/或親緣關系進行分析，所述的軟件選自GeneMaper和/或Cervus。
5. —種鴨親子鑒定的試劑盒，其特征在于包括權利要求1表中所述的引物和DNA提取試齊U °
全文摘要
本發(fā)明公開了一種多重PCR進行鴨親子鑒定的方法及其試劑盒，該方法確立了20個STR標記進行多重PCR擴增的組合，大大簡化了工作量，具有高效、快速、準確、高通量的特點。該方法尤其適用于進行大群自然隨機交配的鴨育種群體中親本與子代間遺傳關系的確認，如能在育種中使用不但可降低工作量，而且可提高種鴨產蛋率、受精率和孵化率，具有較好的經濟效益。
文檔編號C12Q1/68GK102226214SQ20111011610
公開日2011年10月26日 申請日期2011年5月6日 優(yōu)先權日2011年5月6日
發(fā)明者劉偉, 徐桂云, 李俊營, 楊寧, 詹凱 申請人:安徽省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所