專(zhuān)利名稱(chēng)：雜交瘤細(xì)胞株2c9、其產(chǎn)生的抗黃曲霉毒素m1單克隆抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雜交瘤細(xì)胞株2C9、其產(chǎn)生的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
黃曲霉毒素主要是由黃曲霉和寄生曲霉分泌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，是能引起人畜各種損害的天然有毒化合物。黃曲霉毒素目前已發(fā)現(xiàn)20余種，其中黃曲霉毒素Bl的毒性最強(qiáng)，它的毒性是氰化鉀的10倍，砒霜的68倍。黃曲霉毒素Ml (AFMl)是AFBl的羥基化代謝產(chǎn)物，哺乳動(dòng)物攝入AFBl污染的飼料后，在體內(nèi)經(jīng)羥基化會(huì)分泌于乳汁當(dāng)中。通常當(dāng)動(dòng)物攝入了 AFBl污染的食物后，AFMl的排出量為AFBl攝入量的1% 3%。大量的研究者對(duì)AFMl的毒性和致癌性進(jìn)行了深入的研究，研究結(jié)果也促使國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將AFMl的致癌等級(jí)由二類(lèi)致癌物質(zhì)變?yōu)橐活?lèi)致癌物質(zhì)。AFMl性質(zhì)穩(wěn)定，即使經(jīng)過(guò)巴氏殺菌，也幾乎完全不能被破壞。在許多乳制品中均含有AFM1。由于乳制品是嬰幼兒食物的主要來(lái)源，因此AFMl污染問(wèn)題引起了世界各國(guó)的廣泛關(guān)注，并對(duì)AFMl進(jìn)行了嚴(yán)格的限量。我國(guó)屬于黃曲霉毒素污染較重的地區(qū)，因此加強(qiáng)乳及乳制品中黃曲霉毒素Ml的檢測(cè)、特別是速測(cè)，及時(shí)了解和掌握乳及乳制品的衛(wèi)生信息，對(duì)保障我國(guó)食品消費(fèi)安全具有重要意義?，F(xiàn)有黃曲霉毒素的檢測(cè)方法包括薄層層析法、精密儀器分析法和免疫學(xué)分析法。 其中薄層層析法是檢測(cè)黃曲霉毒素最常用的檢測(cè)方法，其不需要特殊的儀器設(shè)備，一般實(shí)驗(yàn)室都可進(jìn)行，但試劑用量大、操作繁瑣、其它組分干擾嚴(yán)重、準(zhǔn)確性差，不能準(zhǔn)確定量，且對(duì)實(shí)驗(yàn)人員和周?chē)h(huán)境污染危害較大，不適于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。精密儀器分析法包括熒光分光光度法和高效液相色譜法，其靈敏度高，準(zhǔn)確性好，但儀器昂貴，要求黃曲霉毒素樣品純化程度高，樣品前處理過(guò)程繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求高，難以實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)。近些年發(fā)展起來(lái)的免疫分析技術(shù)克服了前兩者的缺點(diǎn)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、樣品前處理簡(jiǎn)單、 成本低、對(duì)實(shí)驗(yàn)人員和周?chē)h(huán)境的污染危害小、適于現(xiàn)場(chǎng)批量檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。免疫分析是利用抗原和抗體的特異性的結(jié)合反應(yīng)和抗體、抗原上的標(biāo)記物的生物、物理或化學(xué)放大作用來(lái)對(duì)超微量殘留物進(jìn)行定性、定量檢測(cè)，所以要研究建立針對(duì)黃曲霉毒素Ml的任何一種免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，都必須先制得抗黃曲霉毒素Ml的抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的問(wèn)題是提供雜交瘤細(xì)胞株2C9、其產(chǎn)生的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了雜交瘤細(xì)胞株2C9，該細(xì)胞株已于2010年7月13日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCC NO. C201018。其具有序列表中SEQ Gene No. 1所示的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體重鏈可變區(qū)編碼基因序列和序列表中SEQ Gene No. 2所示的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體輕鏈可變區(qū)編碼基因序列。
抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體，它由保藏編號(hào)為CCTCC NO. C201018的雜交瘤細(xì)胞株2C9分泌產(chǎn)生。其重鏈可變區(qū)具有序列表中SEQ Protein No. 1所示的氨基酸序列；輕鏈可變區(qū)具有序列表中SEQ Protein No. 2所示的氨基酸序列。該抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體可以識(shí)別黃曲霉毒素Ml，對(duì)黃曲霉毒素Ml的50%抑制濃度IC5tl為67 pg/mL。 抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體在黃曲霉毒素Ml測(cè)定中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞株2C9是采用兩步篩選法獲得的，其具體步驟為將 BALB/c小鼠經(jīng)黃曲霉毒素完全抗原AFMl-BSA免疫4_6次后，用2倍于前一次免疫劑量的黃曲霉毒素完全抗原AFMl-BSA作最后一次加強(qiáng)免疫，3天后進(jìn)行細(xì)胞融合，采用ELISA方法分兩步進(jìn)行篩選融合細(xì)胞第一步采用間接ELISA法篩選出抗黃曲霉毒素而不抗載體蛋白 BSA的陽(yáng)性孔；第二步采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)第一步篩選出的陽(yáng)性孔培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)，用黃曲霉毒素Ml作為競(jìng)爭(zhēng)原，選擇吸光值和靈敏度均較高的孔，采用有限稀釋法進(jìn)行克隆， 克隆后10天左右采用同樣的兩步篩選法進(jìn)行檢測(cè)，如此重復(fù)克隆2-3次后，最終篩選獲得雜交瘤細(xì)胞株2C9。本發(fā)明提供的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體的制備方法，步驟如下將獲得的雜交瘤細(xì)胞株2C9注射預(yù)先用福氏不完全佐劑處理過(guò)的BALB/c小鼠，收集該小鼠的腹水，純化即得抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體。按上述方案，所述的純化方法為辛酸-硫酸銨法，具體操作為用雙層濾紙過(guò)濾小鼠腹水，4°c，12000r/min離心15min以上，吸取上清，將所得腹水上清與4倍體積的醋酸鹽緩沖液混合，攪拌下緩慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸體積為30 35 μ L，室溫混合30 60min，4°C靜置2h以上，然后4°C，12000r/min離心30min以上，棄沉淀，將得到的上清液用雙層濾紙過(guò)濾后，加入1/10濾液體積的摩爾濃度為0. lmol/L和pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液，用2 11101/1的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)該混合液的？!1值至7.4，4 °C預(yù)冷，緩慢加入硫酸銨至硫酸銨終濃度為0. 277g/mL, 4°C靜置2h以上，然后4°C，12000r/min離心30min 以上，棄上清，將所得沉淀用原腹水體積1/10的O.Olmol/L磷酸鹽緩沖液重懸，裝入透析袋，對(duì)純水透析，將充分透析好的蛋白溶液置_70°C冰箱冷凍，之后用冷凍干燥機(jī)凍干，收集凍干粉，即得純化好的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體，將抗體置-20°C冰箱中備用；
所述的醋酸鹽緩沖液為0. 29g醋酸鈉，0. 141mL醋酸加水定容至IOOmL所得；所述的 0. lmol/L的磷酸鹽緩沖液為0. Sg氯化鈉，0. 29g十二水磷酸氫二鈉，0. 02g氯化鉀，磷酸二氫鉀0. 02g，加水定容至IOOmL所得。本發(fā)明的有益效果在于
(1)本發(fā)明提供的雜交瘤細(xì)胞株2C9可以用于制備高效價(jià)抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體，抗黃曲霉毒素Ml鼠腹水抗體酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)法測(cè)得的效價(jià)可達(dá)4. 26X 106。(2)本發(fā)明提供的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體靈敏度高、特異性好，對(duì)黃曲霉毒素Ml的50%抑制濃度IC5tl為67 pg/mL，與黃曲霉毒素Bi，B2, Gl, G2交叉反應(yīng)率均小于 0. 1%。(3)本發(fā)明提供的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體可應(yīng)用于測(cè)定黃曲霉毒素Ml。


圖1為本發(fā)明的快速檢測(cè)黃曲霉毒素Ml的免疫層析試紙的正視圖。圖中1紙板、2吸水墊；3檢測(cè)墊；4金標(biāo)墊；5樣品墊；6質(zhì)控線；7檢測(cè)線。圖2為本發(fā)明的快速檢測(cè)黃曲霉毒素Ml的免疫層析試紙的左視圖。圖中1紙板；2吸水墊；3檢測(cè)墊；4金標(biāo)墊；5樣品墊。圖3為實(shí)施例4中應(yīng)用本發(fā)明提供的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體制備的試紙條檢測(cè)樣品的結(jié)果判定圖。圖中1對(duì)照試紙條；2檢測(cè)試紙條；3質(zhì)控線；4檢測(cè)線。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 雜交瘤細(xì)胞株2C9的制備 1.動(dòng)物免疫
購(gòu)買(mǎi)6周齡BALB/c小鼠6只，免疫市售的黃曲霉毒素Ml完全抗原AFM1-BSA。第一次免疫將黃曲霉毒素Ml完全抗原與等量福氏完全佐劑乳化后，于小鼠頸背部皮下多點(diǎn)注射。 第二次免疫于4周后進(jìn)行，采用福氏不完全佐劑與等量黃曲霉毒素Ml完全抗原乳化，于小鼠腹腔注射。第三次免疫與第二次免疫間隔4周，免疫方式與其相同，第四次免疫于第三次免疫3周后進(jìn)行，免疫方式與第二次免疫相同，同樣為腹腔注射。4次免疫劑量相同，均為每鼠50 μ g。前3次每次免疫后8天，尾靜脈采血，分離血清，采用間接ELISA法監(jiān)測(cè)小鼠血清效價(jià)。第4次免疫后8天，尾靜脈采血，分離血清，采用間接ELISA法監(jiān)測(cè)小鼠血清效價(jià)，并用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定小鼠血清靈敏度，選擇效價(jià)、靈敏度均相對(duì)較高的血清對(duì)應(yīng)的小鼠進(jìn)行最后一次加強(qiáng)免疫，免疫劑量為之前的2倍。黃曲霉毒素Ml完全抗原AFMl-BSA 購(gòu)于 Sigma-Aldrich 公司。2.細(xì)胞融合
于最后一次加強(qiáng)免疫3天后，采用50%(重量百分?jǐn)?shù))的聚乙二醇即PEG(分子量為1450) 作融合劑，按常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，具體步驟無(wú)菌條件下殺死免疫小鼠，分離脾細(xì)胞，與鼠源骨髓瘤細(xì)胞SP2/0以5 1的個(gè)數(shù)比混合，用RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗混合細(xì)胞，用 50%PEG融合，融合1分鐘，然后加滿RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，離心，移去上清，小鼠脾細(xì)胞和鼠源骨髓瘤細(xì)胞SP2/0形成的融合細(xì)胞用72mLRPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸，將重懸起來(lái)的細(xì)胞滴加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，2滴/孔，置37°C二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，所述的RPMI-1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)液為含有20% (體積百分?jǐn)?shù))胎牛血清，2% (重量百分?jǐn)?shù))生長(zhǎng)因子和1% (重量百分?jǐn)?shù))次黃嘌呤_氨基蝶呤_胸腺嘧啶核苷即HAT。上述SP2/0購(gòu)于上海泛柯生物科技有限公司；RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液購(gòu)于Hyclone公司；1%次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核苷即 HAT 購(gòu)于 Sigma-Aldrich 公司。3.細(xì)胞株的篩選及克隆
待細(xì)胞融合后第12天左右，細(xì)胞集落長(zhǎng)到占孔底1/2大小，培養(yǎng)液變黃，即可進(jìn)行抗體檢測(cè)。采用ELISA方法對(duì)有雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)孔進(jìn)行篩選，篩選分兩步進(jìn)行，第一步采用間接ELISA法篩選出抗黃曲霉毒素Ml而不抗載體蛋白BSA的陽(yáng)性孔；第二步采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)第一步篩選出的陽(yáng)性孔進(jìn)行檢測(cè)，用黃曲霉毒素Ml作為競(jìng)爭(zhēng)原，選擇吸光值和靈敏度均較高的孔(吸光值較高指競(jìng)爭(zhēng)原為0的孔即陽(yáng)性對(duì)照孔的最終測(cè)定值較高， 靈敏度較高指抑制率為50%時(shí)的競(jìng)爭(zhēng)原濃度亦即IC5tl值較小)，采用有限稀釋法進(jìn)行克隆， 克隆后10天左右采用同樣的兩步法進(jìn)行檢測(cè)，如此重復(fù)克隆2-3次后，獲得雜交瘤細(xì)胞株 2C9。
實(shí)施例2 抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株系2C9抗體可變區(qū)序列測(cè)定
(1)提取總RNA采用天根公司的總RNA提取試劑盒并按照說(shuō)明書(shū)提取可產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞株系2C9的總RNA ；
(2)合成cDNA:以步驟1獲得的總RNA為模板，oligo(dT) 15為引物，按照 SuperScript -2 II反轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一鏈；引物oligo (dT) 15由 Invitrogen 購(gòu)得；
(3)PCR法克隆可變區(qū)基因根據(jù)GENEBANK中小鼠抗體基因序列的保守位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物， 以cDNA為模版擴(kuò)增抗體輕、重鏈可變區(qū)基因。PCR程序?yàn)?4°C 30s,55°C lmin、72°C Imin ，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)(重量百分?jǐn)?shù))的瓊脂糖凝膠電泳分離后，用試劑盒純化回收DNA片段，連接到載體pMDIS-T中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，送至上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。其中引物的序列分別為重鏈可變區(qū)引物為 5’-AGG TSM ARC TGC AGS AGT CffG G_3’(22mer)和 5’_TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CC-3’(32mer)其中 S、M、R 和 W 為兼并堿基，M=A/C，R=A/G， S=C/G, W=A/T，輕鏈可變區(qū)引物為 5’-GAC ATT GAG CTC ACC CAG CTT GGT GCC -3'(24mer) 禾口 5'-CCG TTT CAG CTC CAG CTT GGT CCC-3'(24mer)。得到的基因序列結(jié)果重鏈可變區(qū)編碼基因序列長(zhǎng)354bp，序列如SEQ ID NO: 1所示，根據(jù)所獲得的基因序列推導(dǎo)出該基因序列所編碼的重鏈可變區(qū)由117個(gè)氨基酸組成， 序列如SEQ ID N0:3所示。輕鏈可變區(qū)編碼基因序列長(zhǎng)332bp，序列如SEQ ID N0:2所示， 根據(jù)所獲得的基因序列推導(dǎo)出該基因序列所編碼的輕鏈可變區(qū)由110個(gè)氨基酸組成，序列如 SEQ ID N0:4 所示。實(shí)施例3 抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體的制備純化、亞型和特性鑒定
將實(shí)施例2獲得的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株系2C9注射預(yù)先用福氏不完全佐劑處理過(guò)的BALB/c小鼠，收集該小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸銨法純化抗體，具體操作為用雙層濾紙過(guò)濾小鼠腹水，4°C，12000r/min離心15min，吸取上清，將所得腹水上清與4倍體積的醋酸鹽緩沖液混合，攪拌下緩慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸體積為33 μ L，室溫混合30min，4°C靜置2h，然后4°C，12000r/min離心30min，棄沉淀，將得到的上清液用雙層濾紙過(guò)濾后，加入1/10濾液體積的摩爾濃度為0. lmol/L和pH值為7. 4 的磷酸鹽緩沖液，用2 11101/1的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)該混合液的？!1值至7.4，4 °C預(yù)冷，緩慢加入硫酸銨至硫酸銨終濃度為0. 277g/mL, 4°C靜置2h，然后4°C，12000r/min離心30min，棄上清，將所得沉淀用原腹水體積1/10的0. Olmol/L磷酸鹽緩沖液重懸，裝入透析袋，對(duì)純水透析，將充分透析好的蛋白溶液置_70°C冰箱冷凍，之后用冷凍干燥機(jī)凍干，收集凍干粉，即得純化好的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體，將抗體置-20°C冰箱中備用；
所述的醋酸鹽緩沖液為0. 29g醋酸鈉，0. 141mL醋酸加水定容至IOOmL所得；所述的 0. lmol/L的磷酸鹽緩沖液為0. Sg氯化鈉，0. 29g十二水磷酸氫二鈉，0. 02g氯化鉀，磷酸二氫鉀0. 02g，加水定容至IOOmL所得。用市售亞型鑒定試劑盒鑒定雜交瘤細(xì)胞株2C9分泌的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體的亞型為IgG2a。用常規(guī)非競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)法測(cè)得2C9的鼠腹水抗體的效價(jià)可達(dá) 4. 26X 106，即鼠腹水抗體稀釋4. 26X IO6倍時(shí)的溶液測(cè)定結(jié)果為陽(yáng)性。用常規(guī)間接競(jìng)爭(zhēng)
6ELISA法鑒定其對(duì)黃曲霉毒素Ml的靈敏度為67 pg/mL，與黃曲霉毒素Bi，B2, Gl, G2交叉
反應(yīng)率均小于0. 1%。 實(shí)施例4 抗體應(yīng)用
將雜交瘤細(xì)胞株2C9分泌的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體用于制備黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條，制備方法包括以下步驟
(1)吸水墊的制備
將吸水紙剪裁成長(zhǎng)16mm寬3mm的規(guī)格，即得吸水墊；
(2)檢測(cè)墊的制備檢測(cè)線的包被
將黃曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白的偶聯(lián)物AFMl-BSA配制成0. lmg/mL的包被液A ；于距硝酸纖維素膜上沿15mm的位置，用點(diǎn)噴方式將包被液A橫向包被于硝酸纖維素膜上，得到檢測(cè)線，每厘米檢測(cè)線所需黃曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白的偶聯(lián)物的包被量為75ng，然后于37°C條件下干燥15分鐘；
所述的包被液A為10mg市售黃曲霉毒素Ml-牛血清白蛋白偶聯(lián)物AFM1-BSA，Ig牛血清白蛋白，0. 02g疊氮化鈉，0. 8g氯化鈉，0. 29g十二水磷酸氫二鈉，0. 02g氯化鉀，0. 02g磷酸二氫鉀，加水定容至IOOmL所得； 質(zhì)控線的包被
將兔抗鼠多克隆抗體配成0. 2mg/mL的包被液B ；于距檢測(cè)線5mm的位置，用點(diǎn)噴方式將包被液B橫向包被于硝酸纖維素膜上，得質(zhì)控線，每厘米質(zhì)控線所需的兔抗鼠多克隆抗體的包被量為lOOng，然后于37°C條件下干燥15分鐘；
所述的包被液B為將20mg兔抗鼠多克隆抗體，0.02g疊氮化鈉，0.8g氯化鈉，0. 29g 十二水磷酸氫二鈉，0. 02g氯化鉀，0. 02g磷酸二氫鉀，加水定容至IOOmL所得； 所述的硝酸纖維素膜長(zhǎng)25mm，寬3mm ；
(3)樣品墊的制備
將玻璃纖維膜剪裁成長(zhǎng)13mm寬3mm的規(guī)格，放入封閉液A中浸濕，取出，于37°C條件下干燥6小時(shí)，得樣品墊，然后置干燥器中室溫保存；
所述的封閉液A為Ig牛血清白蛋白，2g蔗糖，0. 02g疊氮化鈉，0. 8g氯化鈉，0. 29g十二水磷酸氫二鈉，0. 02g氯化鉀，0. 02g磷酸二氫鉀，加水定容至IOOmL所得；
(4)金標(biāo)墊的制備
將玻璃纖維膜剪裁成長(zhǎng)9mm寬3mm的規(guī)格，放入封閉液B中浸濕，取出，于37°C條件下干燥16小時(shí)，于干燥好的玻璃纖維膜上，用點(diǎn)噴方式將納米金標(biāo)記的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體溶液橫向噴涂，每厘米噴涂長(zhǎng)度所需納米金標(biāo)記的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體為 600ng，然后真空冷凍干燥6h，置干燥器中室溫保存；
所述的封閉液B為Ig牛血清白蛋白，0. ImL曲拉通X-100，0. 3g聚乙烯吡咯烷酮，2g蔗糖，0. 02g疊氮化鈉，0. 8g氯化鈉，0. 29g十二水磷酸氫二鈉，0. 02g氯化鉀，0. 02g磷酸二氫鉀，加水定容至IOOmL所得；
所述的納米金標(biāo)記的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體溶液的具體標(biāo)記方法為量取 50. OmL質(zhì)量濃度為0. 01%的納米金溶液，用0. 1 mol/L碳酸鉀水溶液調(diào)節(jié)溶液pH值為 5. 5 ；在攪拌的狀態(tài)下緩慢加入2. 5mL 0. lmg/mL的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體水溶液，繼續(xù)攪拌30min ；加入質(zhì)量濃度為10%牛血清白蛋白水溶液至牛血清白蛋白的終質(zhì)量濃度為 1%，繼續(xù)攪拌30min ；于4°C放置2h后，1500r/min離心15min，取上清液，棄沉淀；將上清液 12000r/min離心30 min，棄去上清液，加入50. OmL標(biāo)記洗滌保存液；再以12000r/min離心 30 min，棄去上清液，將沉淀用標(biāo)記洗滌保存液重懸，得到5. OmL濃縮物，置4°C冰箱備用， 其中納米金標(biāo)記的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體溶液的質(zhì)量濃度為0. 05mg/mL ； 所述納米金溶液中納米金的粒徑為15nm ；
所述的0. 1 mol/L碳酸鉀水溶液為13. 8g碳酸鉀溶于純水定容至1000mL，0. 22Mm濾膜過(guò)濾所得；所述的0. lmg/mL抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體水溶液為Img抗黃曲霉毒素Ml 單克隆抗體溶解在10 mL純水中制成；所述的10%牛血清白蛋白水溶液為IOg牛血清白蛋白溶解在IOOmL純水中，0. 22ΜΠ1濾膜過(guò)濾所得；所述的標(biāo)記洗滌保存液為2. Og聚乙二醇-20000，0. 2g疊氮鈉，0. 1235克硼酸，純水定容至1000mL，0. 22Mm濾膜過(guò)濾所得；
(5)試紙條的組裝在紙板的一面從上到下依次粘貼吸水墊、檢測(cè)墊、金標(biāo)墊和樣品墊，相鄰各墊在連接處交疊連接，交疊長(zhǎng)度為1mm，即得黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條，見(jiàn)圖1和圖2。 上述黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條的應(yīng)用
吸取1#和2#待測(cè)牛奶樣品各lmL，加入0. 25mL水，混勻，得到樣品溶液，取100 μ L稀釋好的樣品溶液分別做為檢測(cè)液逐滴加入一黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條的樣品墊，將其作為檢測(cè)試紙條，同時(shí)取ImL不含有黃曲霉毒素Ml的空白牛奶樣品，加入0. 25mL水，混勻，得到陰性對(duì)照溶液，取100μ L陰性對(duì)照溶液，逐滴加入另一黃曲霉毒素Ml免疫層析試紙條的樣品墊，將其作為對(duì)照試紙條，15分鐘后讀取結(jié)果；
檢測(cè)結(jié)果1#檢測(cè)試紙條的質(zhì)控線顯示出紅色線條，而檢測(cè)線不顯色，則判為陽(yáng)性結(jié)果，表明待測(cè)樣品中的黃曲霉毒素Ml的含量高于0. 5ng/mL，見(jiàn)圖3-1 ;2#檢測(cè)試紙條的質(zhì)控線顯示出紅色線條，而檢測(cè)線顏色比對(duì)照試紙條檢測(cè)線顏色淺，則判為陽(yáng)性結(jié)果，表明待測(cè)樣品中黃曲霉毒素Ml的含量高于或等于0. 5ng/mL,見(jiàn)圖3_2。
權(quán)利要求
1.雜交瘤細(xì)胞株2C9，其特征在于它保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為 CCTCC NO. C201018。
2.抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體，其特征在于它由保藏編號(hào)為CCTCCNO. C201018的雜交瘤細(xì)胞株2C9分泌產(chǎn)生。
3.權(quán)利要求2所述的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體在黃曲霉毒素Ml含量測(cè)定中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株2C9的制備方法，其特征在于將BALB/c小鼠經(jīng)黃曲霉毒素完全抗原AFMl-BSA免疫4-6次后，用2倍于前一次免疫劑量的黃曲霉毒素完全抗原AFMl-BSA作最后一次加強(qiáng)免疫，3天后進(jìn)行細(xì)胞融合，采用ELISA方法分兩步進(jìn)行篩選融合細(xì)胞第一步采用間接ELISA法篩選出抗黃曲霉毒素而不抗載體蛋白BSA的陽(yáng)性孔； 第二步采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法對(duì)第一步篩選出的陽(yáng)性孔培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)，用黃曲霉毒素Ml 作為競(jìng)爭(zhēng)原，選擇吸光值和靈敏度均較高的孔，采用有限稀釋法進(jìn)行克隆，克隆后10天左右采用同樣的兩步篩選法進(jìn)行檢測(cè)，如此重復(fù)克隆2-3次后，最終篩選獲得雜交瘤細(xì)胞株 2C9。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體的制備方法，其特征在于將獲得的雜交瘤細(xì)胞株2C9注射預(yù)先用福氏不完全佐劑處理過(guò)的BALB/c小鼠，收集該小鼠的腹水，純化即得抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述的純化方法為辛酸_硫酸銨法，具體操作為用雙層濾紙過(guò)濾小鼠腹水，4°C，12000r/min離心15min以上，吸取上清，將所得腹水上清與4倍體積的醋酸鹽緩沖液混合，攪拌下緩慢加入正辛酸，每毫升腹水所需的正辛酸體積為30 35 μ L，室溫混合30 60min，4°C靜置2h 以上，然后4°C，12000r/min離心30min以上，棄沉淀，將得到的上清液用雙層濾紙過(guò)濾后， 加入1/10濾液體積的摩爾濃度為0. lmol/L和pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液，用2 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)該混合液的PH值至7. 4，4 °C預(yù)冷，緩慢加入硫酸銨至硫酸銨終濃度為 0. 277g/mL, 4°C靜置2h以上，然后4°C，12000r/min離心30min以上，棄上清，將所得沉淀用原腹水體積1/10的0. Olmol/L磷酸鹽緩沖液重懸，裝入透析袋，對(duì)純水透析，將充分透析好的蛋白溶液置-70°C冰箱冷凍，之后用冷凍干燥機(jī)凍干，收集凍干粉，即得純化好的抗黃曲霉毒素Ml單克隆抗體，將抗體置-20°C冰箱中備用；所述的醋酸鹽緩沖液為0. 29g醋酸鈉，0. 141mL醋酸加水定容至IOOmL所得；所述的 0. lmol/L的磷酸鹽緩沖液為0. Sg氯化鈉，0. 29g十二水磷酸氫二鈉，0. 02g氯化鉀，磷酸二氫鉀0. 02g，加水定容至IOOmL所得。
全文摘要
本發(fā)明提供了雜交瘤細(xì)胞株2C9、其分泌產(chǎn)生的抗黃曲霉毒素M1單克隆抗體及其應(yīng)用。雜交瘤細(xì)胞株2C9，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO.C201018。該雜交瘤細(xì)胞株2C9可以用于制備高效價(jià)抗黃曲霉毒素M1單克隆抗體，采用鼠腹水抗體酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)法測(cè)得的效價(jià)可達(dá)4.26×106。該抗黃曲霉毒素M1單克隆抗體靈敏度高，對(duì)黃曲霉毒素M1的50%抑制濃度IC50為67pg/ml，與黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2交叉反應(yīng)率均小于0.1%，可用于黃曲霉毒素M1的快速測(cè)定。
文檔編號(hào)C12N5/20GK102220286SQ201110108230
公開(kāi)日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2011年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月21日
發(fā)明者丁小霞, 姜俊, 張奇, 張文, 李培武, 李鑫, 管笛, 陳小媚 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所