專利名稱：基于磁分離與高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核酸序列分析領(lǐng)域，特別是涉及一種基于磁分離與高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，所述核酸序列比由常規(guī)Sanger測序法所能分析的序列長度更長。
背景技術(shù)：
生物的遺傳信息由非常長的脫氧核糖核酸(DNA)分子組織成染色體的形式儲存。 在生物學(xué)研究中，DNA序列分析對于遺傳信息的獲取至關(guān)重要，是遺傳學(xué)和基因組學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)。基于測序技術(shù)的深入而全面的遺傳學(xué)和基因組學(xué)研究可以應(yīng)用于基礎(chǔ)研究(基因功能鑒定、信號通路構(gòu)建、系統(tǒng)生物學(xué)、生物進化、疾病機理研究等)，也可以應(yīng)用于臨床領(lǐng)域 (疾病預(yù)測、預(yù)防、早期診斷、個性化治療等)。2000年6月沈日，人類基因組工作草圖由美國、英國、法國、德國、日本和中國科學(xué)家宣布基本完成，2002年2月又公布了“精細圖”。這是基因組學(xué)研究領(lǐng)域的一個里程碑式的工作。隨著人類基因組計劃的實施，也推動了模式生物基因組的測序工作。目前，科學(xué)家已完成了水稻、家蠶、大鼠、小鼠、熊貓等多類物種的基因組測序。自人類基因組測序完成，美國國立衛(wèi)生研究院(National Institute of Health, NIH)便提供了 “革命性基因組測序技術(shù)”(Revolutionary Genome Sequencing Technologies)項目基金，以開發(fā)革命性的DNA測序技術(shù)為目標(biāo)，并隨之推出了 1000美元基因組計劃，使得發(fā)展高通量、低成本、長讀取長度的測序技術(shù)越來越受到關(guān)注，也預(yù)示著將來的測序技術(shù)不僅只作為一種科學(xué)研究的工具，而將發(fā)展成為一種產(chǎn)業(yè)，為人類的生活健康服務(wù)。針對基因組測序，已發(fā)展了多種方法，最早可以追溯到20世紀(jì)50年代。1%4年已經(jīng)出現(xiàn)了關(guān)于測序技術(shù)的報導(dǎo)，即Whitfeld等用化學(xué)降解的方法測定多聚核糖核苷酸序列。1975年至1977年間，Sanger等發(fā)明的雙脫氧核苷酸(Dideoxyribonucleotide triphosphate, ddNTP)末端終止法和Gilbert等發(fā)明的化學(xué)降解法，標(biāo)志著第一代測序技術(shù)的誕生，它幫助人們完成了從噬菌體基因組到人類基因組草圖等大量的測序工作，但由于其存在成本高、速度慢等方面的不足，因此并不是最理想的測序方法。在此后三十幾年的發(fā)展中陸續(xù)產(chǎn)生了第二代測序技術(shù)，包括Roche公司的妨4技術(shù)、Illumina公司的Solexa 技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)。與第一代技術(shù)相比，第二代測序技術(shù)不僅保持了高準(zhǔn)確度， 而且大大降低了測序成本并極大地提高了測序速度，但由于第二代測序技術(shù)產(chǎn)生的測序結(jié)果長度較短，比較適合對序列已知的基因組進行重新測序，在對全新的基因組進行測序時還需要結(jié)合第一代測序技術(shù)。近年，Helicos公司的單分子測序技術(shù)、Pacific Biosciences 公司的單分子實時(Single Molecule Real Time, SMRT)測序技術(shù)和 Oxford NanoporeTechnologies公司正在研究的納米孔單分子測序技術(shù)被認為是第三代測序技術(shù)。第一代測序方法中，Sanger法和Gilbert法都是先得到隨機長度的DNA鏈，再通過電泳方法讀出序列。兩者不同之處在于，Sanger法通過ddNTP隨機中斷待測序列的合成，而Gilbert法是先用特定的化學(xué)試劑標(biāo)記堿基再用化學(xué)方法打斷待測序列。目前廣泛使用的測序方法都基于Sanger法，該方法的原理是利用DNA聚合酶對結(jié)合在待測定序列模板上的引物進行延伸，直到摻入一種ddNTP為止。每一輪序列測定由一套四個單獨的反應(yīng)構(gòu)成，每個反應(yīng)含有四種脫氧核糖核苷酸(Deoxyribonucleotide triphosphate, dNTP), 并混有一定比例的一種ddNTP，DNA核苷酸鏈通過和dNTP戊糖C-3位的羥基反應(yīng)而延長， 而ddNTP由于其戊糖C-3位不含羥基而使核苷酸鏈的延伸反應(yīng)終止，由此產(chǎn)生不同長度的核酸片段，它們具有共同的起始點，但終止在不同的ddNTP上，進而通過各種信號分析手段讀取核苷酸序列，包括最初的電泳方法以及后來發(fā)展的熒光標(biāo)記方法等。然而，除去成本與通量的考慮，目前基于Sanger法的測序方法都存在讀長不夠長(500-1000bp)的主要缺陷。 造成此缺陷的原因主要有兩方面一方面由于聚合酶的合成能力有限，合成的片段長度有限(500-700bp);另一方面由于目前信號分析能力有限，超過一定長度后，由于信號累積造成的背景干擾或信號淬滅致無法獲取等原因，無法解碼長度更長的序列。讀長不夠長之缺陷即引起了核酸片段拼接組裝的難題，尤其是存在大量重復(fù)序列的情況下。因此，在片段合成和信號解析方面取得突破是改進Sanger測序法讀長不夠長之缺陷的關(guān)鍵。眾所周知，高保真DNA聚合酶由于具有3’ -5’核酸外切酶活性，能夠在DNA核苷酸鏈延伸的過程中，將錯誤配對的核苷酸移除，再以正確配對的核苷酸為底物繼續(xù)進行DNA 核苷酸鏈的合成，稱之為高保真聚合酶的校正功能。在測序技術(shù)的發(fā)展過程中，為了提高 DNA聚合酶的合成能力，通過基因工程的方法對聚合酶進行了改造，得到了專為測序反應(yīng)使用的不具有3’ -5’核酸外切酶活性且合成速度較快的DNA聚合酶，稱之為測序酶。測序酶由于在延伸DNA核苷酸鏈的過程中未對摻入的核苷酸進行檢驗與校正，在提高DNA核苷酸鏈合成速率的同時，也一定程度上提高了合成出錯的概率。而實際上，高保真聚合酶的校正功能除了能將錯配的核苷酸移除，還能將中斷DNA核苷酸鏈合成的核苷酸移除，摻入正確配對并能繼續(xù)DNA核苷酸鏈合成的核苷酸，使DNA核苷酸鏈的延伸合成得以繼續(xù)。因此，高保真DNA聚合酶的校正功能，不僅能提高DNA核苷酸鏈合成的正確率，也能夠降低測序過程中的背景信號，是具有雙重功能的非常有用而方便的工具酶。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明的目的在于解決上述所提到的傳統(tǒng)Sanger測序方法中讀長不夠長的問題，提出一種基于磁分離與高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，具有背景信號低、讀長更長和操作方便的優(yōu)點。技術(shù)方案一種基于磁分離與高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，1) 將耐3’ -5’核酸外切酶消化的測序引物固定于磁性介質(zhì)上，與待測DNA序列進行雜交；2) 加入成分包括不具有3’ -5’核酸外切酶活性之DNA聚合酶的第一步延伸反應(yīng)溶液，延伸經(jīng)過標(biāo)記的脫氧核糖核苷酸單體與雙脫氧核糖核苷酸單體，通過檢測標(biāo)記物信號得到核苷酸種類與個數(shù)信息；3)加入成分包括具有3’ -5’核酸外切酶活性之高保真DNA聚合酶的第二步延伸反應(yīng)溶液，利用高保真聚合酶的校正功能移除2)中已延伸的ddNTP并替換延伸上耐3’ -5’核酸外切酶消化的核苷酸單體；4)對磁性介質(zhì)進行磁分離并清洗；循環(huán)上述步驟 2)、3)和4)所進行的過程，直到確定待測DNA中的核苷酸序列信息。所述磁性介質(zhì)為體現(xiàn)磁學(xué)性質(zhì)的物體，包括具有磁學(xué)性質(zhì)的物質(zhì)構(gòu)成的物體或以具有磁學(xué)性質(zhì)的物質(zhì)為部件的物體，包括平板、微孔、微球。所述經(jīng)過標(biāo)記的脫氧核糖核苷酸單體與雙脫氧核糖核苷酸單體為直接或間接標(biāo)記著熒光分子、放射性同位素或酶的dNTP與ddNTP。所述經(jīng)過標(biāo)記的dNTP與ddNTP，所述四種單體均標(biāo)記相同的標(biāo)記物，或標(biāo)記不相同、不完全相同的標(biāo)記物。經(jīng)過標(biāo)記的dNTP與ddNTP，其中ddNTP與同種類dNTP之間的分子數(shù)比例為1:50^1:10000ο所述不具有3，-5，核酸外切酶活性之DNA聚合酶為Taq DNA聚合酶、Τ7測序酶、 Vent" DNA聚合酶、DeepVent- DNA聚合酶或測序酶。所述具有3’ -5’核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶為Vent DNA聚合酶、 DeepVent DNA聚合酶或Pfu DNA聚合酶。所述耐3’ -5’核酸外切酶消化的核苷酸單體為硫化修飾的dNTP α S、環(huán)化修飾的 acy-NTP或鎖核酸。采用線性方式依次讀取完整核苷酸序列或采用陣列方式讀取部分核苷酸序列后再利用序列拼接軟件進行拼接。該測序技術(shù)具體過程如下
1)以四種經(jīng)過標(biāo)記的雙脫氧核糖核苷酸單體ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP進行單堿基延伸反應(yīng)，記錄得到的信號值，作為下述測序過程中信號處理的基準(zhǔn)。2)將耐3’ -5’核酸外切酶消化的測序引物固定于磁性介質(zhì)上，與待測DNA序列進行雜交。所述耐3’-5’核酸外切酶消化的測序引物即引物末位核苷酸為硫化修飾的 dNTP α S、環(huán)化修飾的acy-NTP或鎖核酸(Locked Nucleic Acid, LNA)。所述磁性介質(zhì)為體現(xiàn)磁學(xué)性質(zhì)的物體，包括以具有磁學(xué)性質(zhì)的物質(zhì)構(gòu)成的物體或以具有磁學(xué)性質(zhì)的物質(zhì)為部件的物體，包括平板、微孔、微球，這對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是顯然的。3)平行進行四組反應(yīng)，加入第一步延伸反應(yīng)溶液，溶液成分包括不具有3’ -5’核酸外切酶活性之DNA聚合酶、四種經(jīng)過標(biāo)記的雙脫氧核糖核苷酸單體ddATP、ddTTP、ddCTP、 ddGTP中的一種及其對應(yīng)的脫氧核糖核苷酸單體dATP、dTTP、dCTP、dGTP，ddNTP與同種類正常dNTP之間的分子數(shù)比例為1 50 1 10000，優(yōu)選比例1 100 1 5000，更優(yōu)選比例為 1 10(Tl 2000，最優(yōu)選比例為1 1000，通過延伸進行經(jīng)典的鏈終止反應(yīng)，進而檢測標(biāo)記物信號得到核苷酸種類及個數(shù)信息。所述不具有3’ -5’核酸外切酶活性之DNA聚合酶為Taq DNA聚合酶、Τ7測序酶、Vent—DNA聚合酶、De印Vent— DNA聚合酶、測序酶等。所述經(jīng)過標(biāo)記的dNTP與ddNTP為直接或間接標(biāo)記著可檢測到的基團的脫氧核糖核苷單體與雙脫氧核糖核苷單體，例如熒光分子、放射性同位素、酶等常規(guī)標(biāo)記物，這對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是顯然的。所列舉的酶和標(biāo)記物只是舉例說明本發(fā)明，不能以任何方式限制本發(fā)明的范圍。4)繼續(xù)平行進行四組反應(yīng)，加入第二步延伸反應(yīng)溶液，溶液成分包括具有3’ -5’ 核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶，步驟3)中檢測知道的特定的一種耐3’-5’核酸外切酶消化的核苷酸單體，利用高保真聚合酶的校正功能移除步驟3)中已延伸的帶有標(biāo)記物
5的核苷酸單體并以耐3’-5’核酸外切酶消化的核苷酸單體為底物進行核苷酸鏈的延伸。所述具有3，-5，核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶為Vent DNA聚合酶、De印Vent DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶等。所述耐3’-5’核酸外切酶消化的核苷酸單體為硫化修飾的dNTP α S、 環(huán)化修飾的acy-NTP或鎖核酸(LNA)。這對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員是顯然的。所列舉的酶和經(jīng)過修飾的核苷酸單體只是舉例說明本發(fā)明，不能以任何方式限制本發(fā)明的范圍。5)利用磁鐵對磁性介質(zhì)進行磁分離并以清洗緩沖液對磁性介質(zhì)進行若干次清洗，清除步驟3)與步驟4)中經(jīng)過標(biāo)記的ddNTP;再次檢測標(biāo)記物信號，記錄數(shù)值作為下一輪反應(yīng)信號值的基數(shù)。循環(huán)上述3)、4)和5)所進行的過程，直到確定待測DNA中的核苷酸序列信息。有益效果與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下特點
①磁性介質(zhì)的引入使得兩步延伸反應(yīng)溶液的替換與清洗過程變得迅速而方便，整個測序過程不僅可以在單個反應(yīng)容器中以線性方式進行，也可以排列成陣列方式進行；有利于發(fā)展成為高通量自動化的平臺技術(shù)，從而有可能通過自動化儀器實現(xiàn)測序工作，具有很大的應(yīng)用前景。②高保真DNA聚合酶的校正功能使測序過程減少了錯誤延伸的現(xiàn)象。在DNA擴增中通常使用的Taq DNA聚合酶擴增堿基的出錯率為10_5，而高保真DNA聚合酶擴增堿基的出錯率為10_6，因此高保真DNA聚合酶的引入有利于提高測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。③另一方面，高保真DNA聚合酶的校正功能降低了標(biāo)記物的信號累積效應(yīng)。在傳統(tǒng)的延伸合成測序方法中，當(dāng)標(biāo)記物阻礙了下一步測序信息的獲得時，通常采用將標(biāo)記物破壞或者將標(biāo)記物與單體分離的方法清除標(biāo)記物信息，以進行下一步延伸測序。但是，無論是采用化學(xué)或物理的方法破壞標(biāo)記物結(jié)構(gòu)，還是將標(biāo)記物與單體切割分離，都可能對延伸位點造成破壞，從而增加錯誤延伸的可能性，影響測序的長度和正確性。而本發(fā)明提供的方法利用酶對帶有標(biāo)記物的核苷酸進行生物切割，在清除標(biāo)記物信號、減少背景噪音的同時， 也保護了延伸位點的完整性，有利于進行長讀長的序列分析。


圖1為本發(fā)明“一種基于磁分離與高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法” 中公布之具體實施方式
的實驗流程。圖2為核殼型Y -Fe203iAu金磁顆粒的制備過程示意圖； 圖3為Y-Fe2O3OAu復(fù)合顆粒的透射電鏡圖4為顆粒的紅外吸收圖譜。圖5為高保真DNA聚合酶的校正功能。泳道0 :DNA分子量標(biāo)志DL2000 ；泳道1 上游引物末位堿基為ddNTP + Taq DNA聚合酶；泳道2 上游引物末位堿基為dNTP + Taq DNA聚合酶；泳道3 上游引物末位堿基為ddNTP + Pfu高保真DNA聚合酶；泳道4 上游引物末位堿基為dNTP + Pfu高保真DNA聚合酶。圖6為經(jīng)配有Cy5濾色片的掃描儀掃描后記錄的熒光信號圖。圖6A為第一輪延伸時四組反應(yīng)中Cy5熒光信號圖；圖6B為第二輪延伸時四組反應(yīng)中Cy5熒光信號圖；圖6C 為第三輪延伸時四組反應(yīng)中Cy5熒光信號圖。
具體實施例方式本發(fā)明利用磁性介質(zhì)利于分離的特性與高保真DNA聚合酶的校正功能，公布了一種能夠迅速完成原位清除鏈終止核苷酸并替換延伸進行核酸序列分析的方法。在本發(fā)明的一個較佳實施例中，以金磁納米顆粒作為磁性介質(zhì)、Pfu高保真DNA聚合酶原位清除鏈終止核苷酸并替換延伸進行序列分析，具體實驗流程如圖1示。①將耐3’-5’核酸外切酶消化的測序引物固定于磁性介質(zhì)上，與待測DNA序列進行雜交；②加入成分包括不具有3’ -5’ 核酸外切酶活性之DNA聚合酶的第一步延伸反應(yīng)溶液，延伸經(jīng)過標(biāo)記的脫氧核糖核苷酸單體與雙脫氧核糖核苷酸單體，通過檢測標(biāo)記物信號得到核苷酸種類與個數(shù)信息；③加入成分包括具有3’ -5’核酸外切酶活性之高保真DNA聚合酶的第二步延伸反應(yīng)溶液，利用高保真聚合酶的校正功能移除②中已延伸的ddNTP并替換延伸上耐3’-5’核酸外切酶消化的核苷酸單體；④對磁性介質(zhì)進行磁分離并清洗；循環(huán)上述步驟②、③和④所進行的過程，直到確定待測DNA中的核苷酸序列信息。以下特定的實施例旨在更詳細地描述本發(fā)明。這些實施例的目的在于解釋本發(fā)明，而不應(yīng)理解為限定本發(fā)明的范圍。實施例1適合測序的金磁納米顆粒的制備
磁性納米顆粒是指顆粒尺度至少有一維在1-1000 nm之間的材料，當(dāng)它們達到一定的臨界尺度時，會呈單磁疇并表現(xiàn)出超順磁性，是20世紀(jì)70年代以來逐步產(chǎn)生和發(fā)展起來的新型生物醫(yī)學(xué)功能材料。在通常情況下，處于膠態(tài)的磁性微粒呈雜亂無序的運動狀態(tài)，可穩(wěn)定懸浮于液相介質(zhì)中，方便地進行各種生物學(xué)反應(yīng)；而在外磁場作用下磁性微粒便表現(xiàn)出良好的磁響應(yīng)性，可方便地將微粒與介質(zhì)分離開來；當(dāng)撤去外加磁場后，磁性微粒又可重新懸浮于液相介質(zhì)中而不聚集。在本發(fā)明實施例中，后續(xù)反應(yīng)檢測的是熒光標(biāo)記信號，由于一般的磁性納米顆粒存在一定的熒光背景，不利于信號采集，因此需要在磁性納米顆粒表面修飾金殼，有效消除磁性納米顆粒的熒光背景才適合在其表面直接讀取信號進行核酸序列分析。圖2給出了核殼型Y -Fe2O3OAu金磁顆粒的合成過程，包括三個步驟①制備磁性納米!^e3O4顆粒，采用高溫焙燒的方法把!^e3O4顆粒氧化成、-Fe2O3顆粒；②將得到的 Y-Fe2O3磁性顆粒以有機硅烷試劑修飾，在其表面引入-SH基團；③將氯金酸在檸檬酸的環(huán)境中原位還原到巰基功能化的Y-Fe2O3顆粒表面，得到核殼結(jié)構(gòu)的Y-Fe2O3OAu復(fù)合顆粒。具體實驗過程如下所述。①采用溶劑熱法制備直徑為300 nm左右的!^e3O4磁性納米顆粒。稱取!^eCl3 ·6Η20 1. 35 g、醋酸鈉(NaAc) 3. 6 g 以及聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG) 1.0 g，溶解于40 ml乙二醇中，磁攪拌溶解，形成黃褐色的膠體。將膠體轉(zhuǎn)移至四氟乙烯反應(yīng)釜，密封，以200° C反應(yīng)8小時；反應(yīng)完全后磁分離，以乙醇與去離子水清洗，烘干后即得!^e3O4磁性納米顆粒樣品。取上述制備得到的!^e3O4顆粒置于馬弗爐中以380°C焙燒2小時，自然冷卻至室溫后得到Y(jié)-Fe2O3磁性納米顆粒。②將上述Y-Fe2O3納米顆粒研磨均勻后重新分散于95%乙醇中并超聲，以170轉(zhuǎn)/分進行攪拌，同時滴加入3-巰丙基三甲氧基硅烷(3-Mercaptopropyltriethoxysilane，MPTES)，攪拌過夜，反應(yīng)完全后磁分離，再用95%的乙醇洗滌三次，即得到巰基修飾的Y_Fe203磁性納米顆粒。③將步驟②中所得巰基修飾的Y-Fe2O3顆粒分散于95%乙醇中，超聲30分鐘，以170轉(zhuǎn)/分進行攪拌，并滴加入0. 44 M的氯金酸溶液與0. 2 M的檸檬酸鈉溶液，反應(yīng)完成后，以95%的乙醇洗滌三次，磁分離便得到了核-殼結(jié)構(gòu)的Y -Fe2O3OAu復(fù)合顆粒。圖3為Y-Fe2O3OAu復(fù)合顆粒的透射電鏡圖，可以看出顆粒呈球形、大小均勻，并有較好的分散性。圖4為上述三步驟中分別得到之顆粒的紅外吸收圖譜，其中的a為Y-Fe2O3 顆粒的紅外吸收曲線；b為Y-Fe2O3顆粒修飾巰基后的紅外吸收曲線；c曲線為Y-FhO3OAu 復(fù)合顆粒的的紅外吸收曲線。實施例2 Pfu高保真DNA聚合酶對于ddNTP校正功能的驗證
3’_5’外切酶活性是多種DNA聚合酶具有的內(nèi)在功能，它在DNA合成過程中對摻入的核苷酸進行檢驗，從3’ -5’方向移除與模板不匹配的核苷酸，稱之為DNA聚合酶的校正功能。 根據(jù)DNA合成的不同需要，利用現(xiàn)代基因工程方法對各種DNA聚合酶進行了改造，得到了功能側(cè)重不同的DNA聚合酶，Pfu高保真DNA聚合酶即是其中之一。Pfu高保真DNA聚合酶除了能從3’ -5’方向移除在DNA合成過程中摻入的與模板不匹配的核苷酸，還能移除在DNA 合成過程中摻入的阻礙核苷酸鏈繼續(xù)延伸的核苷酸，例如具有空間位阻的經(jīng)過修飾的核苷酸或終止了核苷酸鏈延伸的ddNTP。在本發(fā)明中，對若干種具有3’ -5’外切酶活性的高保真DNA聚合酶進行了檢驗， 篩選出能夠有效移除ddNTP的Pfu高保真DNA聚合酶。實驗過程如下加入IOXBuffer 2 μ L, Mg2+ (25 mM) 2 μ L、dNTP (2. 5 mM) 1.5 μ L、上游引物和下游引物各 2 μ L，p-GEM-T fesy質(zhì)粒模板0. 2 μ L、DNA聚合酶0. 5 μ L，加去離子水補足體積至20 μ L，將反應(yīng)混合物置于PCR儀中。PCR參數(shù)95°C 3分鐘；95°C 30秒，54°C 30秒，72°C 6分鐘，；35個循環(huán)， 循環(huán)結(jié)束后72°C最終延伸15分鐘。反應(yīng)結(jié)束后各取10 μ L PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果如圖5所示。一般Taq DNA聚合酶在上游引物末位堿基為dNTP (泳道 2)時能對模板進行完整擴增，在上游引物末位堿基為ddNTP (泳道1)時不能對模板進行擴增，說明ddNTP確實終止了核苷酸鏈的延伸；而Pfu高保真DNA聚合酶在上游引物末位堿基為dNTP (泳道3)與ddNTP (泳道4)時都能對模板進行完整擴增，說明Pfu高保真DNA聚合酶對于終止核苷酸鏈延伸的ddNTP進行了有效移除，使核苷酸鏈的合成得以繼續(xù)。由此證明了 Pfu高保真DNA聚合酶對于ddNTP具有校正功能，能夠原位清除終止核苷酸鏈延伸的 ddNTP從而繼續(xù)延伸過程。實施例3基于磁分離與高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析原理對p-GEM-T Easy質(zhì)粒載體進行測序
將鏈親和素修飾于實施例1中得到的金磁納米顆粒上，即可進行下述測序過程 ①設(shè)計四條引物，其下游第一位堿基為已知的A、T、C、G中的一種，5’端修飾著生物素，通過鏈親和素與生物素的反應(yīng)將引物固定于鏈親和素-金磁納米顆粒。以Cy5標(biāo)記的雙脫氧核糖核苷酸單體ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP分四組平行進行單堿基延伸反應(yīng)，經(jīng)配有Cy5濾色片的掃描儀掃描后記錄得到信號值，作為后續(xù)信號處理的基準(zhǔn)。②根據(jù)p-GEM-T Easy質(zhì)粒載體的SP6位點設(shè)計測序引物為 TTCTATAGTGTCACCTAAAT，引物5’端修飾生物素以固定于鏈親和素-金磁納米顆粒，3’端末位堿基為硫化修飾的dTTP α S，將連有引物的鏈親和素-金磁納米顆粒與待測DNA序列進行雜交。
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③分四組平行進行反應(yīng)，同時重復(fù)3次，加入第一步延伸反應(yīng)溶液，具體實驗過程如下加入 IOXBuffer 2 μ L、Mg2+ (25 mM) 2 μ L、ddNTP 及其對應(yīng)的 dNTP 混合物 1. 5 μ L、連接有步驟②中測序引物的金磁納米顆粒2 μ L,p-GEM-T fesy質(zhì)粒模板0. 2 μ L.Taq DNA聚合酶0.5 μ L，加去離子水補足體積至20 μ L，將反應(yīng)混合物置于PCR儀中。PCR參數(shù)95°C 3分鐘；95°C 30秒，54°C 30秒，72°C 1分鐘，1個循環(huán)，磁分離，以清洗緩沖溶液對金磁納米顆粒進行三次清洗，棄上清，經(jīng)配有Cy5濾色片的掃描儀掃描后記錄第一輪延伸時四組反應(yīng)中Cy5熒光的有無和強弱，如圖6A示，在ddATP與dATP組合的反應(yīng)管中檢測到了 Cy5熒光信號，而其他反應(yīng)管中并無信號，通過與步驟①得到的信號強度比較確定A堿基個數(shù)為1。④繼續(xù)平行進行四組反應(yīng)，同時重復(fù)3次，加入第二步延伸反應(yīng)溶液，具體實驗過程如下加入IOXBuffer 2 μ L、Mg2+ (25 mM) 2 μ L、由步驟③檢測得知的dATP α S 1.5 μ L、步驟③中的金磁納米顆粒，p-GEM-T fesy質(zhì)粒模板0. 2 μ L、Pfu高保真DNA聚合酶0. 5 μ L，加去離子水補足體積至20 μ L，將反應(yīng)混合物置于PCR儀中。PCR參數(shù)95°C 3分鐘； 950C 30秒，54°C 30秒，72°C 3分鐘，1個循環(huán)，磁分離。由此利用Pfu高保真DNA聚合酶的校正功能移除步驟③中已延伸的帶有Cy5熒光標(biāo)記的ddATP并延伸上對應(yīng)的耐3’-5’核酸外切酶消化的dATP α S。⑤磁分離，以清洗緩沖溶液對步驟④中的金磁納米顆粒進行三次清洗，清除步驟 ③與步驟④中經(jīng)Cy5標(biāo)記的ddATP ；再以掃描儀掃描后記錄該次循環(huán)中剩余的Cy5熒光值作為下次循環(huán)Cy5熒光值的基數(shù)。循環(huán)上述③、④和⑤所進行的過程，直到確定p-GEM-T Easy質(zhì)粒載體中的核苷酸序列信息并與已知的P-GEM-T Easy質(zhì)粒載體DNA圖譜進行比對。圖6為經(jīng)配有Cy5濾色片的掃描儀掃描后記錄的前三輪延伸時四組反應(yīng)中的Cy5 熒光信號。圖6A為第二輪延伸時四組反應(yīng)中Cy5熒光信號。圖6B為第二輪延伸時四組反應(yīng)中Cy5熒光信號，在ddGTP與dGTP組合的反應(yīng)管中檢測到了 Cy5熒光信號，而其他反應(yīng)管中并無信號，通過與步驟⑤得到的信號強度比較確定G堿基個數(shù)為1。圖6 C第三輪延伸時四組反應(yīng)中Cy5熒光信號，在ddCTP與dCTP組合的反應(yīng)管中檢測到了 Cy5熒光信號，而其他反應(yīng)管中并無信號，通過與步驟⑤得到的hi信號強度比較確定C堿基個數(shù)為1。
權(quán)利要求
1.一種基于磁分離與高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，其特征在于1) 將耐3’ -5’核酸外切酶消化的測序引物固定于磁性介質(zhì)上，與待測DNA序列進行雜交；2) 加入成分包括不具有3’ -5’核酸外切酶活性之DNA聚合酶的第一步延伸反應(yīng)溶液，延伸經(jīng)過標(biāo)記的脫氧核糖核苷酸單體與雙脫氧核糖核苷酸單體，通過檢測標(biāo)記物信號得到核苷酸種類與個數(shù)信息；3)加入成分包括具有3’ -5’核酸外切酶活性之高保真DNA聚合酶的第二步延伸反應(yīng)溶液，利用高保真聚合酶的校正功能移除2)中已延伸的ddNTP并替換延伸上耐3’ -5’核酸外切酶消化的核苷酸單體；4)對磁性介質(zhì)進行磁分離并清洗；循環(huán)上述步驟 2),3)和4)所進行的過程，直到確定待測DNA中的核苷酸序列信息。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于磁分離與高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，其特征在于所述磁性介質(zhì)為體現(xiàn)磁學(xué)性質(zhì)的物體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于磁分離與高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，其特征在于所述經(jīng)過標(biāo)記的脫氧核糖核苷酸單體與雙脫氧核糖核苷酸單體為直接或間接標(biāo)記著熒光分子、放射性同位素或酶的dNTP與ddNTP。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述基于磁分離與高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，其特征在于所述體現(xiàn)磁學(xué)性質(zhì)的物體為具有磁學(xué)性質(zhì)的物質(zhì)構(gòu)成的物體或以具有磁學(xué)性質(zhì)的物質(zhì)為部件的物體。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述基于磁分離與高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，其特征在于經(jīng)過標(biāo)記的dNTP與ddNTP，所述四種單體均標(biāo)記相同的標(biāo)記物，或標(biāo)記不相同、不完全相同的標(biāo)記物。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述基于磁分離與高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法， 其特征在于經(jīng)過標(biāo)記的dNTP與ddNTP，其中ddNTP與同種類dNTP之間的分子數(shù)比例為 1:50 1:10000。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于磁分離與高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，其特征在于所述不具有3’ -5’核酸外切酶活性之DNA聚合酶為Taq DNA聚合酶、T7測序酶、 Vent" DNA聚合酶、DeepVent- DNA聚合酶或測序酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于磁分離與高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法， 其特征在于所述具有3’-5’核酸外切酶活性的高保真DNA聚合酶為Vent DNA聚合酶、 DeepVent DNA聚合酶或Pfu DNA聚合酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于磁分離與高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，其特征在于所述耐3’ -5’核酸外切酶消化的核苷酸單體為硫化修飾的dNTP α S、環(huán)化修飾的 acy-NTP或鎖核酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于磁分離與高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法， 其特征在于采用線性方式依次讀取完整核苷酸序列或采用陣列方式讀取部分核苷酸序列后再利用序列拼接軟件進行拼接。
全文摘要
一種基于磁分離與高保真聚合酶校正功能的核酸序列分析方法，1)將耐核酸外切酶消化的測序引物固定于磁性介質(zhì)上，與待測DNA序列進行雜交；2)加入成分包括不具有核酸外切酶活性之DNA聚合酶的延伸反應(yīng)溶液，延伸經(jīng)過標(biāo)記的脫氧核糖核苷酸單體與雙脫氧核糖核苷酸單體，通過檢測標(biāo)記物信號得到核苷酸種類與個數(shù)信息；3)加入成分包括具有核酸外切酶活性之高保真DNA聚合酶的延伸反應(yīng)溶液，利用高保真聚合酶的校正功能移除2)中已延伸的ddNTP并替換延伸上耐核酸外切酶消化的核苷酸單體；4)對磁性介質(zhì)進行磁分離并清洗；循環(huán)上述步驟2)、3)和4)所進行的過程，直到確定待測DNA中的核苷酸序列信息。
文檔編號C12Q1/68GK102191328SQ20111009798
公開日2011年9月21日 申請日期2011年4月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月19日
發(fā)明者何農(nóng)躍, 曾新 申請人:東南大學(xué)