專利名稱：利用沙利度胺靶向因子的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用作為沙利度胺靶向因子的Cereblon (塞勒布隆有時(shí)簡(jiǎn)記為 CRBNJ或其片段的非致畸性物質(zhì)的篩選方法及沙利度胺的拮抗物的篩選方法，所述非致畸性物質(zhì)例如，藥品、藥品添加物、食品、食品添加物、特別是非致畸性沙利度胺衍生物。另外， 本發(fā)明涉及與沙利度胺的結(jié)合性低、但保持作為遍在蛋白連接酶復(fù)合體的構(gòu)成因子的功能的突變型CRBN、編碼該突變型CRBN的核酸、及導(dǎo)入有該核酸并進(jìn)行了表達(dá)的非人動(dòng)物。
背景技術(shù)：
1950年代后半期到60年代初，沙利度胺作為鎮(zhèn)靜劑在超過(guò)四十個(gè)國(guó)家銷(xiāo)售，另外它還常常被處方用于防止妊娠中的女性的早孕反應(yīng)。沙利度胺具有致崎性的事實(shí)漸漸顯著化，到其被停止使用為止，估計(jì)包含死產(chǎn)兒在內(nèi)造成了超過(guò)數(shù)千 1萬(wàn)人的畸形(形態(tài)形成障礙)(引用文獻(xiàn)1-3)。如果妊娠中第3-8周的女性服用沙利度胺，則在胎兒中引起被稱為沙利度胺胚胎病的四肢、耳、心臟、以及消化器官的形態(tài)形成障礙(引用文獻(xiàn)1づ)。其中四肢、耳的頻率顯著。作為海豹肢畸形(phocomelia)已知的四肢的異常的特征是臂或腿變短，另外耳的異常以無(wú)耳癥或小耳癥、聾癥為代表。盡管在其原因闡明中進(jìn)行了相當(dāng)?shù)呐?，但關(guān)于該發(fā)育異常所知仍甚微。根據(jù)到目前為止的研究可知沙利度胺具有氧化應(yīng)激誘導(dǎo)、血管新生抑制效果，這可作為致畸性的原因(引用文獻(xiàn)4-5)。但是，殘留有幾個(gè)重要的問(wèn)題。即，怎樣的分子是直接靶向，以及其靶向因子如何承擔(dān)致畸性。但是，作為人的輕度精神發(fā)育遲滯的原因的候選因子已知稱為CRBN的蛋白質(zhì)(非專利文獻(xiàn)1、引用文獻(xiàn)11)。也有報(bào)告該蛋白質(zhì)與稱為損傷DNA結(jié)合蛋白1 (Damaged DNA Binding protein 1，DDB1)的蛋白質(zhì)結(jié)合(非專利文獻(xiàn)2、引用文獻(xiàn)12)，關(guān)于與沙利度胺的關(guān)聯(lián)性沒(méi)有任何的報(bào)告。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)# 專禾Ij 文 ^ 1 J. J. Higgins, J. Pucilowska, R. Q. Lombardi, J. P. Rooney, Neurology 63,1927(2004).非專利文獻(xiàn)2 :S. Angers et al. , Nature 443,590(2006).

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的課題近年來(lái)，沙利度胺多用在伴隨多發(fā)性骨髄瘤、疼痛的作為麻風(fēng)病的ー種的麻風(fēng)性結(jié)節(jié)性紅斑的治療中(引用文獻(xiàn)2、3、6、7)。雖然其詳細(xì)的機(jī)理不明，但已知沙利度胺對(duì)于這些疾病發(fā)揮良好的效果。但是，致畸性依然存在，因此沙利度胺使用僅在嚴(yán)格的管制下進(jìn)行(引用文獻(xiàn)8)。為了更廣泛地應(yīng)用該有用的效果，非常希望除去沙利度胺的致畸性。本發(fā)明是在以上那樣的技術(shù)背景下完成的，目的之ー是提供在保持沙利度胺的有用藥理作用的同時(shí)、沒(méi)有致畸性的沙利度胺的替代藥的開(kāi)發(fā)方法。
用于解決課題的方法本發(fā)明者為了解決上述課題反復(fù)深入研究的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)沙利度胺與CRBN結(jié)合，通過(guò)抑制以CRBN作為構(gòu)成因子的遍在蛋白連接酶復(fù)合體的活性而產(chǎn)生致畸性。如上所述，已知CRBN為人的輕度精神發(fā)育遲滯的原因的候選因子，以及CRBN與DDBl進(jìn)行結(jié)合，但關(guān)于與沙利度胺的關(guān)聯(lián)性完全不知。因此，在本申請(qǐng)?zhí)岢鰠迹耆荒茴A(yù)測(cè)CRBN是沙利度胺的致畸性中的靶向因子。根據(jù)以上的認(rèn)識(shí)，通過(guò)使沙利度胺衍生物與Cereblon接觸，研究與Cereblon的結(jié)合性，可預(yù)見(jiàn)該沙利度胺衍生物的致畸性。如果進(jìn)一歩發(fā)展該新認(rèn)識(shí)，則不限于沙利度胺衍生物，對(duì)于所有的被驗(yàn)物質(zhì)只要研究其與CRBN的結(jié)合性，都可預(yù)見(jiàn)該物質(zhì)有無(wú)沙利度胺樣的致畸性。另外，本發(fā)明者還發(fā)現(xiàn)，來(lái)自人的CRBN的從N末端起第339 442位的氨基酸殘基是沙利度胺的結(jié)合區(qū)域，以及將從N末端起第384位的酪氨酸及第386位的色氨酸替換成丙氨酸而得的來(lái)自人的CRBN在保持作為遍在蛋白連接酶復(fù)合體的構(gòu)成因子的功能的同吋，與沙利度胺的結(jié)合性降低。本發(fā)明是根據(jù)以上的認(rèn)識(shí)完成的。即，本發(fā)明提供以下的[1] [11]。[1] ー種非致畸性物質(zhì)的篩選方法，其特征在干，使被驗(yàn)物質(zhì)與Cereblon或其片段接觸，評(píng)價(jià)被驗(yàn)物質(zhì)對(duì)Cereblon或其片段的結(jié)合性，選擇不與Cereblon或其片段結(jié)合的被驗(yàn)物質(zhì)，或者與Cereblon或其片段的結(jié)合性低于沙利度胺與Cereblon或其片段的結(jié)合性的被驗(yàn)物質(zhì)。[2]根據(jù)[1]所述的非致畸性物質(zhì)的篩選方法，其特征在干，被驗(yàn)物質(zhì)為藥品。[3]根據(jù)[1]或[2]所述的非致畸性物質(zhì)的篩選方法，其特征在干，被驗(yàn)物質(zhì)為通式(1)所示的沙利度胺衍生物，
權(quán)利要求
1.ー種非致畸性物質(zhì)的篩選方法，其特征在干，使被驗(yàn)物質(zhì)與Cereblon或其片段接觸，評(píng)價(jià)被驗(yàn)物質(zhì)對(duì)Cereblon或其片段的結(jié)合性，選擇不與Cereblon或其片段結(jié)合的被驗(yàn)物質(zhì)，或者與Cereblon或其片段的結(jié)合性低于沙利度胺與Cereblon或其片段的結(jié)合性的被驗(yàn)物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的非致畸性物質(zhì)的篩選方法，其特征在干，被驗(yàn)物質(zhì)為藥品。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的非致畸性物質(zhì)的篩選方法，其特征在干，被驗(yàn)物質(zhì)為通式 (1)所示的沙利度胺衍生物，
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3的任一項(xiàng)所述的非致畸性物質(zhì)的篩選方法，其特征在干，Cereblon的片段是具有下述氨基酸序列的片段，所述氨基酸序列是在序列號(hào)7所示的氨基酸序列中，具有從其N(xiāo)末端起第339 442位的氨基酸序列，在除此以外的序列號(hào)7所示的氨基酸序列中替換、缺失和/或添加了一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 4的任一項(xiàng)所述的非致畸性物質(zhì)的篩選方法，其特征在干， Cereblon或其片段被固定于載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的非致畸性物質(zhì)的篩選方法，其特征在于，沙利度胺衍生物具有沙利度胺或已知的沙利度胺衍生物所具有的藥理作用。
7.—種致畸性物質(zhì)的拮抗物的篩選方法，其特征在干，包括以下エ序使被驗(yàn)物質(zhì)與 Cereblon或其片段接觸，研究被驗(yàn)物質(zhì)與Cereblon或其片段的結(jié)合性，選擇與Cereblon或其片段結(jié)合的被驗(yàn)物質(zhì)的エ序；以及從通過(guò)上述エ序選擇的被驗(yàn)物質(zhì)中選擇減輕i)致崎性、或ii)含有Cereblon的遍在蛋白連接酶復(fù)合體的活性抑制作用的物質(zhì)的エ序。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的致畸性物質(zhì)的拮抗物的篩選方法，其特征在干，Cereblon或其片段被固定于載體。
9.一種突變型Cereblon，其特征在干，具有以下(a)和/或(b)的氨基酸替換(a)來(lái)自人的Cereblon中的從N末端起第384位的酪氨酸或與其相當(dāng)?shù)陌被岜惶鎿Q成丙氨酸，(b)來(lái)自人的Cereblon中的從N末端起第386位的色氨酸或與其相當(dāng)?shù)陌被岜惶鎿Q成丙氨酸。
10.ー種核酸，其特征在干，編碼權(quán)利要求9所述的突變型Cereblon。
11.一種沙利度胺致畸性耐性非人動(dòng)物，其特征在干，作為基因，導(dǎo)入有權(quán)利要求10所述的核酸并進(jìn)行了表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供開(kāi)發(fā)在保持有用的作用的同時(shí)、除去致畸性的化合物。本發(fā)明提供一種非致畸性物質(zhì)的篩選方法，其特征在于，使被驗(yàn)物質(zhì)與Cereblon或其片段接觸，評(píng)價(jià)被驗(yàn)物質(zhì)對(duì)Cereblon或其片段的結(jié)合性，選擇不與Cereblon或其片段結(jié)合的被驗(yàn)物質(zhì)、或者與Cereblon或其片段的結(jié)合性低于沙利度胺與Cereblon或其片段的結(jié)合性的被驗(yàn)物質(zhì)。
文檔編號(hào)C12N15/09GK102576023SQ201080047469
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月20日
發(fā)明者伊藤拓水, 半田宏, 堀田健太郎, 安藤秀樹(shù) 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人東京工業(yè)大學(xué), 藤本制藥株式會(huì)社