專利名稱：新穎的毛頭鬼傘和黃金銀耳蘑菇菌株及其產(chǎn)物和提取物以及包含它們的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥用蘑菇，更具體地，涉及鬼傘屬(Cb/TTi/ms)和銀耳屬
蘑菇物種，和命名為毛頭鬼傘(Coprinus comatus) CBS 12；3401和黃金銀耳(Tremella mesentericaX^ 123296的新的且獨(dú)特的高等擔(dān)子菌菌株。本發(fā)明另外涉及子實(shí)體、浸沒培養(yǎng)的菌絲生物質(zhì)或單細(xì)胞生物質(zhì)、和來自包含多種生物活性化合物的這些新菌株的提取物，以及它們作為人和動物飲食添加物、益生元、藥用化妝品的應(yīng)用，和在多種疾病和病癥的治療中的應(yīng)用，以及作為抗植物病毒劑(anti-phytoviral agent)的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蘑菇生物技術(shù)產(chǎn)品對人福利具有多種有益作用，例如，作為食品、健康補(bǔ)品和藥品、飼料和肥料，和用于保護(hù)和再生環(huán)境。最近，從藥用蘑菇中分離出了具有有效的且獨(dú)特的增強(qiáng)健康性質(zhì)的藥用物質(zhì)，并在全世界上分布。它們中的許多是藥物產(chǎn)品，而其它則代表著一類新穎的飲食添加物或“蘑菇營養(yǎng)制品”或“營養(yǎng)藥”、真菌化學(xué)制品 (mycochemical)、植物化學(xué)物質(zhì)和設(shè)計者食品(designer food)。已經(jīng)從藥用蘑菇中分離出了幾種抗腫瘤多糖諸如雜-β -葡聚糖和它們的蛋白復(fù)合物(例如，木糖葡聚糖和含有糖醛酸的酸性葡聚糖)以及膳食纖維、凝集素和三萜系化合物。高等擔(dān)子菌蘑菇含有大量多糖，特別是不同類型的葡聚糖。葡聚糖的抗腫瘤作用似乎與它們的分子量和溶解度有關(guān)。例如，僅低分子量香菇多糖顯示出高抗腫瘤活性。不足令人驚奇的是，可溶性的葡聚糖似乎是比不溶性的葡聚糖更強(qiáng)的免疫刺激劑。浸沒培養(yǎng)的銀耳屬的某些物種、特別是黃金銀耳(7 ffiMmterica)菌株的單細(xì)胞生物質(zhì)和子實(shí)體含有高水平的葡糖醛酸木甘聚糖和β -葡聚糖，已經(jīng)證實(shí)，所述生物質(zhì)和純化的多糖具有降血糖活性和降甘油三酯活性(US 6，383，799; US 6，362，397)。高等擔(dān)子菌蘑菇含有大量多糖、蛋白、平衡的必需氨基酸、黑色素、包含必需脂肪酸的脂質(zhì)、三萜系化合物、抗氧化劑、維生素和其它生物活性物質(zhì)。另外，在所有蘑菇的組織中，富含屬于葡聚糖、甲殼質(zhì)和雜多糖的膳食纖維，包括果膠物質(zhì)、半纖維素或多糖醛酸苷， 它們能夠吸附膽汁酸或腸中的危險物質(zhì)，因而可以起制癌劑的作用，并減少不同種類的中另外，已知真菌物質(zhì)是(i) NF- κ B活化途徑的調(diào)節(jié)劑，該途徑在多種生理學(xué)和病理學(xué)過程中起關(guān)鍵作用；(ii)抗氧化劑，其適合作為人飲食的添加物，用于預(yù)防或減輕由氧化性應(yīng)激反應(yīng)造成的氧化損傷；(iii)免疫調(diào)節(jié)劑；并會影響炎性過程。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及新的且獨(dú)特的高等擔(dān)子菌蘑菇品種，其選自在布達(dá)佩斯條約下在登記號CBS 123401下保藏在荷蘭真菌培養(yǎng)中心(Centralbureau voor2/31 頁
khimmelcultures (CBS))的毛頭鬼傘HAI-1237 (在下文中稱作毛頭鬼傘CBS 12；3401)，和在布達(dá)佩斯條約下在登記號CBS 123296下保藏在荷蘭真菌培養(yǎng)中心(Centralbureau voor Schimmelcultures (CBS))的黃金銀耳HAI-17 (在下文中稱作黃金銀耳CBS 123296)。在其它方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的蘑菇的生物質(zhì)，其富含營養(yǎng)制品因子和生物活性物質(zhì)，包括碳水化合物、富含必需氨基酸的蛋白、維生素、富含必需脂肪酸的脂質(zhì)、抗氧化劑和礦物質(zhì)。所述生物質(zhì)可以從毛頭鬼傘CBS 123401的子實(shí)體或菌絲體或黃金銀耳CBS 123296的菌絲體得到。黃金銀耳CBS 123296的菌絲體培養(yǎng)物是單細(xì)胞生物質(zhì)的形式。在另一個方面，本發(fā)明涉及來自本發(fā)明的蘑菇的提取物，其具有營養(yǎng)制品和生物活性。所述提取物可以從蘑菇的菌絲體或子實(shí)體得到。在其它方面，本發(fā)明涉及從提取物分離出的新穎的碳水化合物，包含來自本發(fā)明蘑菇的生物質(zhì)或提取物或從所述提取物分離出的新穎的碳水化合物的組合物，包含本發(fā)明組合物的天然的食品添加物、藥物、益生元、營養(yǎng)制品、飲料或化妝品，包含藥學(xué)上可接受的載體和選自本發(fā)明組合物和新穎的碳水化合物之一的活性成分的藥物組合物，和生產(chǎn)所述生物質(zhì)和提取物的方法。


圖1描述了在發(fā)酵罐或在生物反應(yīng)器技術(shù)中生產(chǎn)浸沒培養(yǎng)的毛頭鬼傘或黃金銀耳菌絲體的一般方法學(xué)的方案a-制備用于培養(yǎng)皿的標(biāo)準(zhǔn)瓊脂培養(yǎng)基；b_用于制備培養(yǎng)物的子實(shí)體的孢子或部分；C-在培養(yǎng)皿上培養(yǎng)；d-在試管中的瓊脂斜面上的儲存培養(yǎng)物 (museum culture) ；e-儲存培養(yǎng)物的顯微鏡檢查；f-在250 mL錐形瓶中的前接種物培養(yǎng)物；g_前接種物培養(yǎng)物的勻漿化;h_在2 L錐形瓶中培養(yǎng)勻漿化的菌絲生物質(zhì)；i -用于接種發(fā)酵罐培養(yǎng)基的菌絲生物質(zhì)的勻漿化；用于發(fā)酵罐的生長培養(yǎng)基；k-在發(fā)酵罐中培養(yǎng)菌絲生物質(zhì)；1-收獲菌絲生物質(zhì)；m-用于飲食添加物(DS)、藥物和其它產(chǎn)品的干燥的生物質(zhì)制劑；HM，收獲菌絲體；
圖2顯示了通過蛋白免疫印跡測得的El和E2提取物對ρ κ Ba水平的影響。該圖代表了具有類似結(jié)果的2個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。El -培養(yǎng)液(水)提取物；E2 -乙酸乙酯提取物。圖3顯示了圖2的蛋白免疫印跡的密度計分析，其顯示了與100 μΜ H2O2作用相比，El和Ε2提取物對ρ κ B α的作用(將結(jié)果表示為2個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)相對于僅H2O2-處理的平均值士標(biāo)準(zhǔn)差的倍數(shù))。圖4顯示了毛頭鬼傘提取物El和E2的IKK β抑制活性。與100 ng GST-I κ B a 底物和5 ng IKK-β酶一起溫育提取物El和Ε2 (100和200 μ g/ml)和600 nM的IKK-β 抑制劑Rict (1 μ Μ)，并使用在材料和方法中所述的基于ELISA的激酶活性試驗(yàn)，測試它們的抑制IKK-β活性的能力。El -粗培養(yǎng)液(水)提取物；Ε2 -粗乙酸乙酯提取物。圖5描述了鬼傘屬水提取物的IH WR譜。圖6A-D顯示了完整細(xì)胞、提取物和提取后的殘余物的單糖含量的氣相色譜法 (GC)分析。(A)水提取物；(B)完整細(xì)胞；(C)水提取后的細(xì)胞；和(D) NaOH提取后的細(xì)胞。圖7描述了來自毛頭鬼傘的水和NaOH提取物的多糖(部分地通過kphadex G_50 上的尺寸排阻色譜法來分離)的尺寸分離色譜圖。
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圖8A-B顯示了從靈芝屬sp.) (A)和毛頭鬼傘CBS 123401 (B)提取的葡聚糖的甲基化分析。圖9描述了從分離自黃金銀耳CBS 123296的β -葡聚糖得到的甲基化的糖類的 GC跡線。圖10顯示了從新分離的黃金銀耳CBS 123296菌株得到的甲基化的糖類(A)和純的葡糖醛酸木甘聚糖(B)的GC跡線。圖11顯示了與煙草花葉病毒(TMV)相比，GXM (1000 Pg/mL)對煙草植物品種免疫580的感受性的作用。橫坐標(biāo)導(dǎo)入GXM和接種TMV之間的間隔(天)?？v坐標(biāo)實(shí)驗(yàn) (深色實(shí)心條)和對照(帶陰影的淺色條)中的局部病變數(shù)目之比(%)。圖 12 顯示了與 TMV 相比，GXM (2500 Pg/ml)對煙草(Nicotiana tabacum)植物品種免疫580的感受性的影響。橫坐標(biāo)導(dǎo)入GXM和接種TMV之間的間隔(天)?？v坐標(biāo) 實(shí)驗(yàn)(深色實(shí)心條)和對照(帶陰影的淺色條)中的局部病變數(shù)目之比(%)。圖13顯示了 GXM (2500 Pg/ml)對TMV在煙草植物品種免疫580中誘導(dǎo)的局部病變的生長的影響。橫坐標(biāo)導(dǎo)入GXM和接種TMV之間的間隔(天)?？v坐標(biāo)實(shí)驗(yàn)(深色實(shí)心條)和對照(帶陰影的淺色條)中的局部病變的大小(mm)。圖14顯示了放線菌素D (AMD)對在接種了 TMV的煙草植物品種免疫580中誘導(dǎo)的GXM抗性的影響。橫坐標(biāo)實(shí)驗(yàn)的變體1 - GXM; 2 - GXM和AMD (10 Pg/mL)的混合物；3 -在GXM之后2天導(dǎo)入AMD (10 Pg/mL) ； 4 -在GXM之后2天導(dǎo)入AMD (20 μδ/ mL); 5 - AMD (10 Pg/mL)?？v坐標(biāo)實(shí)驗(yàn)(深色實(shí)心條)和對照(帶陰影的淺色條)中局部病變的數(shù)量之比(%)。
具體實(shí)施例方式在一個方面，本發(fā)明涉及擔(dān)子菌蘑菇毛頭鬼傘CBS 123401和黃金銀耳CBS 123296的生物質(zhì)，其富含營養(yǎng)制品因子和生物活性化合物，包括富含必需氨基酸的蛋白和碳水化合物，且另外包含維生素、富含必需脂肪酸的脂質(zhì)、抗氧化劑和礦物質(zhì)。在一個實(shí)施方案中，從毛頭鬼傘CBS 123401的子實(shí)體或菌絲體或單細(xì)胞生物質(zhì)形式的黃金銀耳CBS 123296的菌絲體得到所述生物質(zhì)，例如通過在營養(yǎng)培養(yǎng)基上以浸沒培養(yǎng)方式培養(yǎng)菌株。本發(fā)明另外涉及毛頭鬼傘CBS 123401和黃金銀耳CBS 123296的純的浸沒的菌絲體培養(yǎng)物，其中黃金銀耳CBS 123296的菌絲體培養(yǎng)物是單細(xì)胞生物質(zhì)的形式。黃金銀耳菌絲體培養(yǎng)物作為單細(xì)胞生物體(象酵母一樣)進(jìn)行生長的事實(shí)，會提供非常高的生長速率和在所有擔(dān)子菌蘑菇中最高的生物質(zhì)生產(chǎn)力，最高達(dá)到27g干生物質(zhì)/升培養(yǎng)基。如實(shí)施例4和7所示，測定了本發(fā)明的兩種蘑菇的菌絲體的化學(xué)組成。在本文中證實(shí)存在于本發(fā)明的蘑菇中的許多組分具有多種有益的性質(zhì)，諸如抗癌活性、免疫調(diào)控活性、抗血糖活性、 抗糖尿活性和殺昆蟲活性。按照菌絲體干重計算，毛頭鬼傘CBS 123401的菌絲生物質(zhì)具有約39%碳水化合物和約37%蛋白，黃金銀耳CBS 123296的菌絲生物質(zhì)具有約54%碳水化合物和約20%蛋白。 蘑菇多糖生產(chǎn)者的浸沒培養(yǎng)，允許使用確定組成的培養(yǎng)基在短時間段內(nèi)在恒定組成的受控條件下進(jìn)行生產(chǎn)。
生物質(zhì)中的碳水化合物包括多糖和二糖和單糖。毛頭鬼傘CBS 123401的生物質(zhì)的多糖的實(shí)例包括β-葡聚糖，優(yōu)選低分子量水溶性的β-葡聚糖和半乳聚糖，優(yōu)選中性巖藻半乳聚糖。因而，本發(fā)明涉及新穎的低分子量水溶性的β -葡聚糖，其由在某些6-位攜帶本文實(shí)施例4. 2所示的β-1-6-D-葡萄糖殘基側(cè)鏈的β-1-3-連接的D-葡萄糖殘基的主鏈結(jié)構(gòu)組成。β -葡聚糖從毛頭鬼傘、優(yōu)選毛頭鬼傘CBS 123401得到，且具有小于10，000 Da、 優(yōu)選約1000至約10，000 Da的分子量。黃金銀耳CBS 123296的生物質(zhì)的多糖的實(shí)例包括β -葡聚糖，優(yōu)選直鏈的3，4 β -葡聚糖和葡糖醛酸木甘聚糖。因而，本發(fā)明另外涉及新穎的水不溶性的直鏈的3，4 β -葡聚糖，和如本文實(shí)施例7. 4所示從黃金銀耳CBS 123296得到的葡糖醛酸木甘聚糖。葡糖醛酸木甘聚糖由— 連接的甘露聚糖的線性主鏈組成，所述甘露聚糖被 β-(1-2)(1-4)-連接的木糖和葡糖醛酸的寡糖二醇化，并產(chǎn)生聚陰離子性質(zhì)，且可以用作抗血糖劑和抗糖尿病劑。本發(fā)明的β -葡聚糖具有抗腫瘤活性和免疫調(diào)控活性，尤其是免疫刺激活性，且本發(fā)明的葡糖醛酸木甘聚糖具有降血糖活性、免疫刺激活性和降血膽固醇活性，且在下述用途中是有前途的作為用于預(yù)防和治療疾病和病癥(其中免疫系統(tǒng)的強(qiáng)化是重要的)的草藥，諸如用于預(yù)防和治療糖尿病、癌癥、病毒病諸如AIDS、心臟病、血壓，以及作為用于治療高膽固醇病癥的降血膽固醇藥。兩個物種的多糖可以是新益生元的來源?！耙嫔蜃印痹诒疚闹斜欢x為選擇性地發(fā)酵的成分，其允許賦予宿主康樂和健康益處的胃腸道微生物區(qū)系在組成和/或活性方面的特異性變化。甲殼質(zhì)(也存在于生物質(zhì)中)是膳食纖維的一種重要組分。在菌絲生物質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的單糖和二糖包括葡萄糖阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖、 葡糖胺和海藻糖。所有這些單糖和二糖對于健康而言是重要的。另外，已經(jīng)證實(shí)，甘露糖會阻止細(xì)菌向泌尿道和膀胱組織的粘附，且已知葡糖胺可用于治療骨關(guān)節(jié)炎和再建軟骨。本發(fā)明的蘑菇的菌絲生物質(zhì)蛋白富含谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、半胱氨酸 (cystein)、甲硫氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸和組氨酸。毛頭鬼傘(C ^aiM)另外含有Y-氨基丁酸。因而，菌絲體蛋白含有11種必需氨基酸中的10種蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、組氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、 苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。由于富含必需氨基酸的蛋白的存在，本發(fā)明的生物質(zhì)因此構(gòu)成一種重要的飲食添加物。毛頭鬼傘CBS 123401的生物質(zhì)包含維生素A、B1, B2, B3> C和E ；黃金銀耳CBS 123296的生物質(zhì)包含維生素A、B1, B2, B3> B6, B7、C和Ε。因而，含有高水平的重要維生素的本發(fā)明的蘑菇的生物質(zhì)和提取物可以作為維生素的優(yōu)良來源，且可以用作營養(yǎng)制品，和/ 或可以作為飲食添加物加入到食品和飲料產(chǎn)品中。毛頭鬼傘CBS 123401的菌絲生物質(zhì)另外包含脂質(zhì)，其包括脂肪酸十五酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、十七酸、硬脂酸、油酸、亞油酸(C18:2n6)、α-亞麻酸(C18:3n3)、γ -亞麻酸(C18:3n6)、花生酸、廿一烷酸、二十二烷酸和木蠟酸；黃金銀耳CBS 123296的生物質(zhì)包含脂肪酸油酸_(C18:1)、亞油酸(C18:2n6)、棕櫚酸(C16:0)、棕櫚油酸(C16:l)、硬脂酸 (C18:0)和肉豆蔻酸。蘑菇中的脂肪酸以它們與甘油的酯的形式存在。通過必需的不飽和脂肪酸α-亞麻酸(C18:3n3)和亞油酸(C182n6)的存在，證實(shí)蘑菇的高營養(yǎng)品質(zhì)。后者產(chǎn)生了 ω-6系列的多不飽和的脂肪酸，它們向磷脂中的摻入會影響細(xì)胞膜性質(zhì)諸如膜結(jié)合的酶的流動性、柔性、滲透性和活性。本發(fā)明的蘑菇的菌絲生物質(zhì)也包含礦物質(zhì)，大量元素和微量元素，包括鋁、銅、鐵、 鉀、鎂、錳、磷、硅、鈉、鈦和鋅。本發(fā)明的兩種蘑菇中的任一種的生物質(zhì)的日劑量會提供鐵和其它礦物質(zhì)的優(yōu)良來源。根據(jù)本發(fā)明，還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的毛頭鬼傘CBS 123401菌株的菌絲體和生物質(zhì)包含抗氧化劑、自由基清除劑、黑色素(賦予抗皮膚光老化的保護(hù)，特別是保護(hù)皮膚免于日光紫外線輻射，還針對由電離輻射造成的內(nèi)部器官的損傷進(jìn)行保護(hù)，且可以用于通過它的羧基和酚羥基分離潛在有毒的金屬離子)和凝集素(參見實(shí)施例4. 3)，尤其是結(jié)合乳糖、半乳糖和葡糖胺的凝集素，它們可以用于包含鑒別多糖和糖蛋白的糖部分的試驗(yàn)中。本發(fā)明的蘑菇的生物質(zhì)可以進(jìn)一步用于益生元或營養(yǎng)制品組合物中?！澳⒐綘I養(yǎng)制品”被定義為來自蘑菇的菌絲體或子實(shí)體的精制的或部分精制的提取物或干燥的生物質(zhì)，其作為飲食添加物(不是常規(guī)食物)以膠囊或片劑的形式被消耗，且具有潛在的治療用途。定期攝入可以增強(qiáng)人體的免疫應(yīng)答，從而增加對疾病的抗性，且在有些情況下，造成疾病狀態(tài)的消退。在另一個方面，本發(fā)明提供了具有營養(yǎng)制品和生物活性的本發(fā)明的蘑菇的提取物。在一個實(shí)施方案中，所述提取物來自毛頭鬼傘CBS 123401。在另一個實(shí)施方案中，所述提取物來自黃金銀耳CBS 123296.所述提取物是從毛頭鬼傘CBS 123401的子實(shí)體或菌絲體得到，或從黃金銀耳CBS 123296的菌絲體得到。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的蘑菇的提取物是從純的浸沒的菌絲體培養(yǎng)物得到。從毛頭鬼傘CBS 123401培養(yǎng)物得到的提取物富含低分子量水溶性的β -葡聚糖和/或半乳聚糖，優(yōu)選中性巖藻半乳聚糖，從黃金銀耳CBS 123296培養(yǎng)物得到的提取物富含直鏈的3，4 β -葡聚糖和/或葡糖醛酸木甘聚糖，其具有抗血糖和抗糖尿病活性。在一個實(shí)施方案中，在本發(fā)明的蘑菇的提取物中存在的生物活性是NF-K B途徑調(diào)控活性、抗氧化劑活性、自由基清除活性、抗輻射活性、金屬離子清除活性、產(chǎn)干擾素 (interferonogenous)活性、免疫調(diào)控活性、抗血糖活性、抗糖尿病活性、降血膽固醇活性、 抗變應(yīng)性活性、抗寄生蟲活性、殺昆蟲活性和/或抗植物病毒活性。本文使用的術(shù)語“產(chǎn)干擾素活性”和“產(chǎn)干擾素藥劑”表示增加哺乳動物血漿中的干擾素濃度的活性或藥劑。本文使用的術(shù)語“免疫調(diào)控活性”和“免疫調(diào)控劑”表示，但不限于促有絲分裂活性、刺激造血干細(xì)胞、活化替代補(bǔ)體途徑和活化免疫細(xì)胞諸如Th細(xì)胞、Tc細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞和天然殺傷(NK)細(xì)胞。術(shù)語“抗血糖活性”和“抗血糖劑”表示降低血糖水平的活性或藥劑，而術(shù)語“抗糖尿病活性”和“抗糖尿病劑”表示通過降低血液中的葡萄糖水平來治療糖尿病的活性或藥劑。殺昆蟲活性包含吸引社會昆蟲諸如木蟻、火蟻、乳白蟻(coptotermes)、臺灣白蟻 (Formosan termites)和散白蟻(reticulitermes termites)，并感染和殺死這些昆蟲。具體地，如本文在下面在實(shí)施例中所證實(shí)的，毛頭鬼傘CBS 123401乙酸乙酯提取
8物具有NF- κ B途徑調(diào)控活性(實(shí)施例幻和抗氧化劑活性和/或自由基清除活性(實(shí)施例2)。這樣的提取物可以用于治療NF-K B-依賴性的疾病，例如，但不限于癌癥、免疫學(xué)障礙、膿毒性休克、移植排斥、輻射損傷、缺血后再灌注損傷、動脈硬化和神經(jīng)變性疾病。從黃金銀耳CBS 123296培養(yǎng)物得到的提取物包含葡糖醛酸木甘聚糖，因此具有抗糖尿病活性，且另外包含免疫調(diào)控活性，例如造成巨噬細(xì)胞的機(jī)能儲備的增加的活性， 和干擾(interferrouneus)活性(參見實(shí)施例8)和/或抗植物病毒活性(參見實(shí)施例 9)。本文使用的術(shù)語“機(jī)能活性”表示自發(fā)的和刺激的(NBT-實(shí)驗(yàn))活性指數(shù)之間的差異， 即吞噬細(xì)胞(諸如巨噬細(xì)胞)在它的休眠狀態(tài)的活性與它在被活化(例如通過暴露于致病細(xì)菌)以后的活性的對比。在另一個方面，本發(fā)明涉及一種組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的生物質(zhì)或提取物。在某些實(shí)施方案中，所述組合物包含從毛頭鬼傘CBS 123401和黃金銀耳CBS 123296得到的生物質(zhì)的混合物，或從毛頭鬼傘CBS 123401和黃金銀耳CBS 123296得到的提取物的混合物。在一個實(shí)施方案中，所述組合物包含從毛頭鬼傘CBS 123401的菌絲體或子實(shí)體得到的富含營養(yǎng)制品因子和生物活性物質(zhì)的生物質(zhì)，或所述生物質(zhì)的提取物。在另一個實(shí)施方案中，所述組合物包含從黃金銀耳CBS 123296的菌絲體得到的富含營養(yǎng)制品因子和生物活性物質(zhì)的生物質(zhì)，或所述生物質(zhì)的提取物。在另一個方面，本發(fā)明涉及一種組合物，其包含選自下述的碳水化合物低分子量水溶性的β-葡聚糖、水不溶性的直鏈的3，4 β-葡聚糖、葡糖醛酸木甘聚糖(它們都如本文上面和在本文下面的實(shí)施例中所定義)或這些碳水化合物中至少兩種的組合。考慮到上述內(nèi)容，在另一個方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明組合物的天然的食品添加物、益生元、營養(yǎng)制品、飲料和化妝品。本發(fā)明另外提供了包含本發(fā)明組合物的寵物食品、殺昆蟲產(chǎn)品、抗寄生蟲產(chǎn)品和抗植物病毒產(chǎn)品。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含藥學(xué)上可接受的載體和選自下述的活性成分(a)本發(fā)明的組合物；(b)低分子量水溶性的葡聚糖；(c)水不溶性的直鏈的3，4 β-葡聚糖；(d)葡糖醛酸木甘聚糖；它們都如本文上面和在本文下面的實(shí)施例中所定義；或(e) (b)至(d)的活性成分中的至少兩種的組合。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的天然的食品添加物、益生元或營養(yǎng)制品和藥物組合物可以用于(a)治療糖尿病或降低血糖水平；(b)誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答；或(c)降低血液膽固醇水平或減少膽固醇的積累。本發(fā)明的天然的食品添加物、益生元或營養(yǎng)制品或藥物組合物可以單獨(dú)地或與抗癌藥聯(lián)合地施用給癌癥患者，以便誘導(dǎo)免疫刺激應(yīng)答，從而治療癌癥。本文使用的術(shù)語“治療”表示疾病或障礙的減輕、進(jìn)展的減少或完全治愈，或與疾病或障礙有關(guān)或由其造成的癥狀的減少。使用一種或更多種藥學(xué)上可接受的載體(包括賦形劑和輔料)，可以以常規(guī)方式配制用于根據(jù)本發(fā)明的用途的藥物組合物。關(guān)于藥物的制劑和給藥的技術(shù)，可以參見，例如， "Remington's Pharmaceutical Sciences，，，Mack Publishing Co. , Easton, PA,最新版。可以將本發(fā)明的藥物組合物配制成用于通過任意合適的途徑的全身給藥，例如， 用于經(jīng)口遞送、腸胃外遞送(包括肌肉內(nèi)的、靜脈內(nèi)的、皮下的、鞘內(nèi)的或腹膜內(nèi)的注射)，或用于通過局部藥物遞送的局部給藥。對于用于本發(fā)明方法中的任意組合物，最初可以從體外和細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)估測治療有效量或劑量。例如，可以在動物模型中配制劑量，以達(dá)到希望的濃度或效價。這樣的信息可以用于更準(zhǔn)確地確定在人類中有用的劑量。在另一個方面，本發(fā)明涉及一種農(nóng)業(yè)組合物，其包含農(nóng)業(yè)載體和選自下述的活性成分本發(fā)明的組合物，或本文定義的葡糖醛酸木甘聚糖。在某些實(shí)施方案中，所述農(nóng)業(yè)組合物用于誘導(dǎo)植物對植物病原體(諸如植物病毒)的抗性。在一個實(shí)施方案中，所述植物病毒是能夠在受感染的植物中誘導(dǎo)過敏反應(yīng)的植物病毒，例如包括煙草花葉病毒和其它煙草花葉病毒組諸如番茄花葉病毒，胡椒綠斑點(diǎn)病毒和ondontoglossum環(huán)斑病毒在內(nèi)的植物病毒。在某些實(shí)施方案中，所述病毒是煙草花葉病本發(fā)明的農(nóng)業(yè)組合物可以另外包含惰性的添加劑。這樣的添加劑包括增稠劑、 流動增強(qiáng)劑、潤濕劑、消泡劑、緩沖劑、潤滑劑、填充劑、漂移控制劑、沉積增強(qiáng)劑、佐劑、蒸發(fā)阻滯劑、霜凍保護(hù)劑、吸引昆蟲的氣味劑、紫外保護(hù)劑、芳香劑等。所述增稠劑可以是可溶于水或能夠在水中溶脹的化合物，例如，黃原膠多糖(例如，陰離子的雜多糖)、海藻酸鹽、瓜耳膠或纖維素；合成的大分子諸如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、形成可溶脹結(jié)構(gòu)的硅酸鹽的聚羧化物諸如產(chǎn)熱的或沉淀的硅酸、皂粘土、蒙脫石、hectonites或 attapulgites ；或硅酸鋁的有機(jī)衍生物。霜凍保護(hù)劑可以是，例如，乙二醇、丙二醇、甘油、 二乙二醇、三乙二醇、四乙二醇、脲或其混合物。所述消泡劑可以是，例如，聚二甲基硅氧烷。 所述農(nóng)業(yè)組合物還可以包含適合基于水或油的產(chǎn)物的表面活性劑系統(tǒng)，如本領(lǐng)域通常已知的。本發(fā)明另外提供了從本發(fā)明的蘑菇生產(chǎn)具有生物活性的提取物的方法，其中所述生物活性是NF-K B途徑調(diào)控活性、抗氧化劑活性、自由基清除活性、抗輻射活性、金屬離子清除活性、產(chǎn)干擾素活性、免疫調(diào)控活性、抗血糖活性、抗糖尿病活性、降血膽固醇活性、 抗變應(yīng)性活性、抗寄生蟲活性或抗植物病毒活性，所述方法包括在營養(yǎng)培養(yǎng)基中以浸沒培養(yǎng)方式培養(yǎng)真菌毛頭鬼傘CBS 123401或黃金銀耳CBS 123四6，從培養(yǎng)液分離得到的可食用真菌的生物質(zhì)，干燥并研磨所述生物質(zhì)成細(xì)粉，對所述細(xì)粉進(jìn)行溶劑提取和冷凍干燥。具體地，所述方法用于生產(chǎn)黃金銀耳、優(yōu)選黃金銀耳CBS 123296的提取物，其富含葡糖醛酸木甘聚糖。提供了從本發(fā)明的蘑菇生產(chǎn)富含多糖、單糖、蛋白、必需氨基酸、維生素、必需脂肪酸、礦物質(zhì)和微量元素的生物質(zhì)的另一種方法，所述方法包括在營養(yǎng)培養(yǎng)基上以浸沒培養(yǎng)方式培養(yǎng)所述蘑菇，從培養(yǎng)液分離得到的可食用真菌的生物質(zhì)，干燥并研磨所述生物質(zhì)成細(xì)粉。特別重要的是，本發(fā)明提供的在營養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)蘑菇的單細(xì)胞浸沒培養(yǎng)物的另一種方法，所述蘑菇包括選自下述的銀耳屬黃金銀耳、銀耳fucifonnis)縫耳(Jremella a ra/7iia)，優(yōu)選黃金銀耳 CBS 123296。根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，為了上面定義的方法的目的，用于培養(yǎng)毛頭鬼傘的營養(yǎng)培養(yǎng)基應(yīng)當(dāng)具有下述的組成(g/L蒸餾水)葡萄糖，15;蛋白胨，3;酵母浸出物，5;KH2P04， 0.8 ;K2HP04，0.2 ;MgS04*7H20，0.5 ；為了上面定義的方法的目的，用于培養(yǎng)黃金銀耳的營養(yǎng)培養(yǎng)基應(yīng)當(dāng)具有下述的組成(g/L蒸餾水)蔗糖，50 ；酵母浸出物，0.5;KC1，1 ；乙酸鎂·4Η20，1. 0 ；NaH2PO4^H20,0. 5 ；Na2HPO4·7Η20,1. 0?，F(xiàn)在，通過下面的非限制性實(shí)施例，例證本發(fā)明。
實(shí)施例材料和方法。1.在錐形瓶和發(fā)酵罐中浸沒培養(yǎng)毛頭鬼傘的菌絲生物質(zhì)
圖1顯示了使用發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器技術(shù)，生產(chǎn)浸沒培養(yǎng)的毛頭鬼傘CBS 123401和黃金銀耳CBS 123296的菌絲體的一般方法學(xué)。蘑菇浸沒培養(yǎng)菌絲體(SCM)生產(chǎn)的一般方案包括5個培養(yǎng)物生長步驟
儲存培養(yǎng)物(I)->中間培養(yǎng)物(II)->前接種物培養(yǎng)物(III)->接種物培養(yǎng)物(IV)->發(fā)酵培養(yǎng)物(V)。3類培養(yǎng)基用于SCM生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂培養(yǎng)基(步驟I和II)、液體標(biāo)準(zhǔn)接種物培養(yǎng)基(步驟III和IV)和發(fā)酵培養(yǎng)基(步驟V)。在試管中的瓊脂斜面上形成儲存培養(yǎng)物(museum culture)；在試管或培養(yǎng)皿中的瓊脂斜面上形成中間培養(yǎng)物。使用旋轉(zhuǎn)搖床，在錐形瓶中形成前接種物和接種物培養(yǎng)物。在發(fā)酵罐Bioflo 2000 (New Brunswick Scientific, USA)中，形成發(fā)酵培養(yǎng)物，所述發(fā)酵罐配有用于測量和/或控制攪拌、溫度、 PH、溶解氧濃度(p02)和泡沫的儀器。對于第一種前接種物培養(yǎng)物，給250 ml錐形瓶接種來自培養(yǎng)皿的1_3周齡蘑菇菌絲體。將來自在瓊脂平板邊緣生長的菌絲體的5-6片(直徑5-7 mm)轉(zhuǎn)移進(jìn)錐形瓶中， 并在瓶壁上切成小片，以增加菌絲體的生長點(diǎn)的數(shù)目。在裝有100 ml確定的合成培養(yǎng)基的250-mL錐形瓶中，接種菌絲體。在由下述組分(g/L蒸餾水)組成的合成培養(yǎng)基上，培養(yǎng)真菌接種物(g Γ1)葡萄糖，15 ；蛋白胨，3.0 ；酵母浸出物，5.0 ;ΚΗ2Ρ04，0·8 ;Κ2ΗΡ04，0·2 ； MgSO4 7Η20,0. 5ο 培養(yǎng)基的初始 ρΗ 是 6.0。單獨(dú)滅菌磷酸鹽(Sigma-Aldrich，St Louis, MO, USA)。在100 rpm和27 °C，在旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)接種的燒瓶6-7天。在培養(yǎng)結(jié)束時，從培養(yǎng)物取出1 ml樣品，用于培養(yǎng)物純度的顯微鏡觀察。對于第二種接種物培養(yǎng)物，使用Waring Laboratory Blender (Waring, USA)，將來自第一種前接種物培養(yǎng)物(沉淀物)的生物質(zhì)勻漿化2 χ 30秒，并接種在含有700 mL 相同培養(yǎng)基的2 L燒瓶中。培養(yǎng)5-7天后，將菌絲生物質(zhì)(沉淀物)勻漿化，并用作接種物培養(yǎng)物，用于在發(fā)酵罐(Bioflo 2000 10 L, New Brunswick Scientific, USA)中生長，所述發(fā)酵罐具有10 L工作體積的相同的上述合成培養(yǎng)基。培養(yǎng)的起始參數(shù)如下溫度27°C;pH-6. 1; 攪拌-lOOrpm，通氣-0. 2v/v/min。 使用的消泡劑是聚丙二醇2000 ；并使用4%NaOH和 4%HC1來控制ρΗ。表1.浸沒培養(yǎng)的毛頭鬼傘CBS 123401的菌絲生物質(zhì)生產(chǎn)隨時間而變化。
1權(quán)利要求
1.新的且獨(dú)特的高等擔(dān)子菌蘑菇品種，其選自在布達(dá)佩斯條約下在登記號CBS 123401下保藏在荷蘭真菌培養(yǎng)中心(CBS)的毛頭鬼傘HAI-1237(在下文中稱作毛頭鬼傘CBS 123401)，和在布達(dá)佩斯條約下在登記號CBS 123296下保藏在荷蘭真菌培養(yǎng)中心 (CBS)的黃金銀耳HAI-17 (在下文中稱作黃金銀耳CBS 123296)。
2.如權(quán)利要求1所述的蘑菇的生物質(zhì)，其富含營養(yǎng)制品因子和生物活性化合物，包括碳水化合物、富含必需氨基酸的蛋白、維生素、富含必需脂肪酸的脂質(zhì)、抗氧化劑和礦物質(zhì)， 其中所述生物質(zhì)從毛頭鬼傘CBS 123401的子實(shí)體或菌絲體或黃金銀耳CBS 123296的菌絲體得到，優(yōu)選通過在營養(yǎng)培養(yǎng)基上以浸沒培養(yǎng)方式培養(yǎng)所述蘑菇。
3.如權(quán)利要求2所述的菌絲生物質(zhì)，其中所述毛頭鬼傘CBS123401的碳水化合物包括海藻糖、葡聚糖，優(yōu)選低分子量水溶性的葡聚糖和半乳聚糖，優(yōu)選中性巖藻半乳聚糖，且所述黃金銀耳CBS 123296的碳水化合物包括β -葡聚糖，優(yōu)選直鏈的3，4 β -葡聚糖和葡糖醛酸木甘聚糖。
4.具有營養(yǎng)制品和生物活性的如權(quán)利要求1所述的蘑菇的提取物，其從毛頭鬼傘CBS 123401的子實(shí)體或菌絲體或黃金銀耳CBS 123296的菌絲體得到，優(yōu)選從純的浸沒的蘑菇菌絲體培養(yǎng)物得到。
5.如權(quán)利要求4所述的提取物，其中所述提取物從毛頭鬼傘CBS123401培養(yǎng)物得到， 且富含低分子量水溶性的β -葡聚糖和/或半乳聚糖，優(yōu)選中性巖藻半乳聚糖，或所述提取物從黃金銀耳CBS 123296培養(yǎng)物得到，且富含直鏈的3，4 β _葡聚糖和/或葡糖醛酸木甘聚糖。
6.一種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求2或3的生物質(zhì)、或根據(jù)權(quán)利要求4或5的提取物、或所述生物質(zhì)或提取物的混合物。
7.如權(quán)利要求6所述的組合物，其包含從毛頭鬼傘CBS123401的菌絲體或子實(shí)體得到的富含營養(yǎng)制品因子和生物活性物質(zhì)的生物質(zhì)，或所述生物質(zhì)的提取物。
8.如權(quán)利要求6所述的組合物，其包含從黃金銀耳CBS123296的菌絲體得到的富含營養(yǎng)制品因子和生物活性物質(zhì)的生物質(zhì)，或所述生物質(zhì)的提取物。
9.一種純的浸沒的毛頭鬼傘CBS 123401菌絲體培養(yǎng)物。
10.一種純的浸沒的黃金銀耳CBS 123296菌絲體培養(yǎng)物，其中所述菌絲體培養(yǎng)物是單細(xì)胞生物質(zhì)的形式。
11.一種低分子量水溶性的β-葡聚糖，其由在某些6-位攜帶下述結(jié)構(gòu)的 β -1-6-D-葡萄糖殘基側(cè)鏈的β -1-3-連接的D-葡萄糖殘基的主鏈結(jié)構(gòu)組成
12.如權(quán)利要求11所述的β-葡聚糖，其從毛頭鬼傘、優(yōu)選毛頭鬼傘CBS123401得到。
13.從黃金銀耳CBS123296得到的一種水不溶性的直鏈的3，4 β-葡聚糖。
14.從黃金銀耳CBS123296得到的一種葡糖醛酸木甘聚糖。
15.一種組合物，其包含選自下述的碳水化合物(a)如權(quán)利要求11或12所述的低分子量水溶性的β-葡聚糖；(b)如權(quán)利要求13所述的水不溶性的直鏈的3，4β-葡聚糖；(c)如權(quán)利要求14所述的葡糖醛酸木甘聚糖；或(d)(a)-(c)的至少2種碳水化合物的組合。
16.一種食品添加物、藥物、益生元、營養(yǎng)制品、飲料或化妝品，其包含如權(quán)利要求6-8 或15中任一項(xiàng)所述的組合物。
17.一種寵物食品、殺昆蟲、抗寄生蟲藥或抗植物病毒產(chǎn)品，其包含如權(quán)利要求6-8或 15中任一項(xiàng)所述的組合物。
18.—種藥物組合物，其包含藥學(xué)上可接受的載體和選自下述的活性成分(a)如權(quán)利要求6-8或15中任一項(xiàng)所述的組合物；(b)如權(quán)利要求11或12所述的低分子量水溶性的β-葡聚糖；(c)如權(quán)利要求13所述的水不溶性的直鏈的3，4β-葡聚糖；(d)如權(quán)利要求14所述的葡糖醛酸木甘聚糖；或(e)(b)-(d)的至少2種活性成分的組合。
19.如權(quán)利要求18所述的藥物組合物，其用于治療糖尿病、降低血糖水平、誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)應(yīng)答、降低血液膽固醇水平、或減少膽固醇積累。
20.—種農(nóng)業(yè)組合物，其包含載體和選自下述的活性成分如權(quán)利要求6-8或15中任一項(xiàng)所述的組合物，或如權(quán)利要求15所述的葡糖醛酸木甘聚糖。
21.用于誘導(dǎo)植物對植物病毒的抗性的如權(quán)利要求20所述的農(nóng)業(yè)組合物。
全文摘要
公開了新的且獨(dú)特的高等擔(dān)子菌蘑菇品種，其選自在布達(dá)佩斯條約下分別在登記號CBS123401和CBS123296下保藏在CentralbureauvoorSchimmelcultures(CBS)的毛頭鬼傘HAI-1237和黃金銀耳HAI-17，其生物質(zhì)和提取物，和分離的組分諸如β-葡聚糖、巖藻半乳聚糖和葡糖醛酸木甘聚糖，以及它們作為天然的食品添加物、營養(yǎng)制品、益生元、飲料產(chǎn)品、化妝品、寵物食品和農(nóng)業(yè)殺昆蟲和抗植物病毒組合物的應(yīng)用。
文檔編號C12P1/00GK102438632SQ201080020448
公開日2012年5月2日 申請日期2010年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月10日
發(fā)明者P. 瓦瑟 S. 申請人:帕爾梅德特瓦有限公司