專利名稱:用于檢測胃癌易感性的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種疾病易感性檢測用的試劑盒,尤其是一種檢測胃癌易感性的試劑 盒,通過檢測MTHFR基因、CYP2E1代謝酶基因、XRCCl及ADPRT修復(fù)酶基因的單核苷酸多態(tài) 性位點(SNP),來預(yù)測個體對胃癌的易感性。
背景技術(shù):
胃癌是最常見消化道惡性腫瘤腫瘤之一,是嚴重威脅人類健康生命的常見病、多 發(fā)病。據(jù)統(tǒng)計,全世界每年約有90萬人新診斷為胃癌,在我國,胃癌占消化道惡性腫瘤第1 位,全身惡性腫瘤第3位。根據(jù)衛(wèi)生部衛(wèi)生信息統(tǒng)計中心2001年公布的資料,惡性腫瘤是 我國城市居民的第1位死因,死亡率為135. 59/10萬04.9% )。其中,胃癌在惡性腫瘤死 因中居第3位。胃癌的發(fā)生、發(fā)展同其他惡性腫瘤一樣,屬多因素、多步驟、多階段和多基因 改變過程。近年來,某些基因的單核苷酸多態(tài)性(SNP)在惡性腫瘤易感性研究中倍受關(guān)注, 研究認為亞甲基四氫葉酸還原酶基因(Methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR) 的C677T位點(rsl801133), CYP2E1的rs2031920位點,X線修復(fù)交叉互補基團1 (X-ray repaircross-complementing group 1, XRCC1) ^ Arg399Gln ^^ (rs25487) R^-i^WB-苷核糖基轉(zhuǎn)移酶(Adenosine diphosphate ribotransferase, ADPRT)的 Ala762Val 位點 (rsll36410)增加個體患胃癌的風險。MTHFR定位于染色體1ρ36. 3,整個編碼區(qū)長1980bp,包括11個外顯子,其cDNA序 列全長2. 2Kb。該基因的編碼產(chǎn)物是含有656個氨基酸殘基、相對分子量大約為150kDa的同 源二聚體,其氨基酸序列高度保守。MTHFR基因有多種突變類型,不同的突變類型對MTHFR 的酶活性和熱穩(wěn)定性產(chǎn)生不同的影響。至今,已發(fā)現(xiàn)MTiFR基因上有近30個SNP位點,其中 已有18個cSNP在GenBank數(shù)據(jù)庫登陸。1995年,有人發(fā)現(xiàn)了 MTHFR的C677T位點。該位 點位于MTHFR基因第4外顯子的葉酸鹽結(jié)合位點上。MTHFR基因第677位堿基胞嘧啶(C) 被胸腺嘧啶(T)置換,從而使一個高度保守的丙氨酸(Ala)變成了纈氨酸(Val)。C677T位 點位于MTHFR催化區(qū)域,該突變直接影響亞甲基四氫葉酸還原酶的活性和耐熱性,表現(xiàn)為 不同程度的酶活性降低并伴有耐熱性降低。葉酸是核苷酸DNA合成及甲基化的重要前體物質(zhì),葉酸缺乏通過干擾DNA合成和 甲基化,進而影響癌癥的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)人群中MTHFR基因C677T位點變異導(dǎo)致酶活性下 降,使總?cè)~酸水平降低,特別是5-甲基四氫葉酸水平降低,5,50-亞基四氫葉酸積聚及細胞 內(nèi)葉酸衍生物構(gòu)成發(fā)生變化。研究表明MTHFR基因677TT基因型多態(tài)性是胃癌的危險因素。大多數(shù)化學物質(zhì)需在代謝酶的作用下活化后才產(chǎn)生致癌效應(yīng),主要的代謝酶有氧 化酶(I相),如細胞色素P450氧化酶(CYPs)。前致癌物進入人體內(nèi)經(jīng)CYP450催化,轉(zhuǎn)變 成親電子化合物攻擊細胞內(nèi)生物大分子,形成DNA加成物,啟動致癌或致突變過程;由于這 些酶的基因多態(tài)性引起酶分子結(jié)構(gòu)、功能和水平改變,能影響細胞滅活致癌物和誘變劑的 能力,進而被認為與腫瘤易感性有關(guān)。CYP2E1是其中的一種,編碼二甲基亞硝胺D-脫甲基 酶(Debrisoquine Hydroxylase,DBH),主要參與食物中亞硝胺及其前體物和低分子量鹵代
3烴類化合物在體內(nèi)的代謝。該基因定位于人類染色體10q24. 3-ter,長11. 41Λ,含9個外顯 子。CYP2E1的rs2031920位點,位于5-調(diào)控區(qū)內(nèi)由C — T的置換所致,研究認為該位點多 態(tài)性與CYP2E1代謝酶轉(zhuǎn)錄活性增強相關(guān),其突變基因型的表達較野生基因型高,TT基因型 增加患食管癌的風險。近年來,DNA修復(fù)基因在惡性腫瘤易感性研究中倍受關(guān)注。DNA損傷修復(fù)是一個多 種酶和蛋白質(zhì)參與的復(fù)雜過程,一旦相關(guān)基因發(fā)生突變,就會導(dǎo)致整個基因組DNA修復(fù)能 力下降,可能引起包括胃癌在內(nèi)的惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。X線修復(fù)交叉互補基因1 (X-ray repair cross-comp 1 ementinggroup 1,XRCC1)是第一個分離到的影響細胞對電離輻射敏 感性的哺乳動物基因,它廣泛參與DNA損傷的修復(fù),是目前研究較多的一種DNA修復(fù)基因。 XRCCl定位于人類染色體19ql3. 2-13. 3,大小為331Λ,包含17個外顯子,編碼1個由633個 氨基酸組成的70kD的蛋白質(zhì)。XRCCl作為腳手架蛋白,通過直接與DNA聚合酶β、DNA連 接酶 III 和多聚二磷酸腺苷(adenosinediphosphate,ADP)核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)形成復(fù)合物,共同參與因電離輻射和氧化損傷引起的堿基切除修復(fù)和單 鏈斷裂修復(fù),對維持基因的穩(wěn)定性發(fā)揮十分關(guān)鍵的作用。XRCCl基因的rs2M87位點,導(dǎo)致 相應(yīng)氨基酸殘基Arg399Gln(G —A)的改變,該多態(tài)性使XRCCl蛋白質(zhì)的活性發(fā)生改變,突 變基因型AA被認為與胃癌的發(fā)病相關(guān)。ADPRT是堿基切除修復(fù)(BER)系統(tǒng)的核心蛋白成員。ADPRT作為一種DNA結(jié)合蛋 白,通過識別DNA鏈斷裂并使多種核受體蛋白(包括自身)發(fā)生多聚ADP核糖化,從而參 與BER過程。當ADPRT結(jié)合于DNA鏈斷裂處,會引發(fā)自身多聚ADP核糖化而激活。激活的 ADPRT與蛋白支架XRCCl相互作用,募集DNA聚合酶- β和DNA連接酶III形成復(fù)合體完 成DNA損傷修復(fù)過程。ADPRT有多個多態(tài)性位點,以rsl 136410位點的研究最多。XRCCl的 rs25487多態(tài)位點恰好位于與ADPRT相互作用的BRCT-結(jié)構(gòu)域,因此這種基因-基因的交互 作用具有生物學依據(jù),ADPRT的rsll36410多態(tài)位點和XRCCl的rs2M87多態(tài)位點變異具 有交互作用,兩者同時變異降低堿基切除修復(fù)功能,影響個體對癌癥的易感性?,F(xiàn)有技術(shù)檢測胃癌易感人群,采用雜交芯片法或玻璃板芯片法,以及利用taqman 探針,該方法準確率低、假陰性和假陽性率較高,且不能批量檢測;另一種直接測序法,雖準 確率高,但其成本高、同樣不能實現(xiàn)批量檢測,因此現(xiàn)有方法均無法滿足大規(guī)?;蚝Y選的 要求。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是,通過檢測一組與胃癌易感性相關(guān)的基因及位點, 利用特異性引物和探針,通過單核苷酸延伸技術(shù)結(jié)合微陣列芯片技術(shù),綜合檢測和分析受 檢人群是否攜帶“胃癌易感基因”,將胃癌易感人群從人群中篩選出來,改變不良的生活習 慣,達到預(yù)防的目的。為了解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種用于檢測胃癌易感的檢 測試劑盒,它包括與胃癌關(guān)系密切的4個基因的組合MTHFR基因、CYP2E1代謝酶基因、 XRCCl及ADPRT修復(fù)酶基因。包括下述SNP位點:MTHFR基因的rsl801133位點,CYP2E1的rs2031920位點, XRCCl基因的rs25478位點,ADPRT基因的rsl 136410位點。
所述的用于檢測胃癌易感的基因組合,用于針對所述位點設(shè)計特異性的引物對和 探針。所述的用于檢測胃癌易感的基因組合設(shè)計的特異性引物,所述的特異性引物對的 序列如下,用于進行多重PCR擴增,能同時擴增出上述4個位點的基因片段針對rsl801133 位點CACAAAGCGGAAGAATGTGTC(SEQ ID NO 1)GTCATCCCTATTGGCAGGTTAC(SEQ ID NO 2)針對rs2031920 位點ACAAGTGATTTGGCTGGATTGT(SEQ ID NO 3)AGAGAATGTTTTTCATTCTGTCTTCT(SEQ ID NO 4)針對rs25478 位點CAGTCTGACTCCCCTCCAGATT (SEQ ID NO 5)TGCTGGACTGTCACCGCAT(SEQ ID NO 6)針對rsl 136410 位點TCTCTGCATGTAGGTTTTCTCTG (SEQ ID NO 7)AGCAGACTGTAGGCCACCTC(SEQ ID NO 8)所述的用于檢測胃癌易感的基因組合設(shè)計的特異性探針,所述的特異性探針序列 如下,能同時對4個位點進行檢測分型針對rsl801133 位點ACGCACGTCCACGGTGATTTGAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCG(SEQ ID NO 9)針對rs2031920 位點GGATGGCGTTCCGTCCTATTAAGATTCATTGTTAATATAAAAGTA(SEQ ID NO :10)針對rs2M78 位點CGTGCCGCTCGTGATAGAATCGCATGCGTCGGCGGCTGCCCTCCC(SEQ ID NO :11)針對rsl 136410 位點AGCGATCTGCGAGACCGTATTTTCTTTTGCTCCTCCAGGCCAAGG(SEQ ID NO :12)所述的引物或探針,用于通過單核苷酸延伸技術(shù)結(jié)合微陣列芯片技術(shù)特異性檢出 胃癌病易感基因。本試劑盒的組分和含量包括250ul 10XPCR 反應(yīng)緩沖液,20ul IOmM dNTP 混合液,450ul 25mM MgCl2 溶液,45ul (5U/ul) Taq DNA 聚合酶,5Oul特異性引物(8條)混合液(IOuM each),15ul特異性延伸探針G條)混合液(IOuM),90ul ExoI(10U/ul),450ul SAP(lU/ul),140ul 10XSAP 反應(yīng)緩沖液,1700ul Extension Dilution Buffer,90ul IOXExtension Mix,IOul DNA polymerase,3500ul Hybridization Solution,200ul Hybridization Additive,
2500ul 20XWash Buffer 1,800ul 64XWash Buffer 2,一個384孔12重微陣列芯片去離子水20ml, 本試劑盒供380人份檢測應(yīng)用,試劑盒保存溫度為-20°C。本發(fā)明的有益效果是(1)分型結(jié)果準確性高達99%以上,重復(fù)性好,沒有假陽性 影響;( 同時檢測多個SNP位點,檢測成本低;C3)通量高,可一次對384個樣本進行檢測; (4)操作簡便;( 靈敏度高,每次檢測的DNA用量僅2ng。本發(fā)明通過單核苷酸延伸技術(shù) 結(jié)合微陣列芯片技術(shù),利用特異性引物和探針對單核苷酸多態(tài)性(SNP)的基因分型準確率 超過99%。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。下列實施例中未注明具體條件 的實驗放大,通常按照常規(guī)條件,或按照廠商所建議的條件。IDNA 的提取取受檢者外周靜脈血,加入同等體積的細胞裂解液,裂解兩次,充分裂解白細胞, 離心棄上清后加入蛋白酶K緩沖液和蛋白酶K(50ug/ml),65°C孵育10分鐘,異丙醇沉淀、 75 %乙醇洗滌兩次,晾干后溶于適量TB溶液中。2PCR 擴增取受檢者的基因組DNA提取液加入96孔板中,進行多重PCR擴增反應(yīng)總體積5ul,其中 IOM mol/L dNTPs 0. 0375ul, 10XPCR BufferO. 5ul, 25mmol/L MgCl2 lul,模板 DNA 30ng,6 重引物混合液 lOuM/L eachO. 025ul, Amplitaq Gold(5U/ul)0. lul,補足水到 5ul。置于 PCR 儀上反應(yīng)預(yù)變性 94°C Imin ;94°C 30sec, 55°C 30sec,72°C lmin,40 個循環(huán);Hold 4°C。擴增引物混合液包括下列引物IF CACAAAGCGGAAGAATGTGTC(SEQIDN0:1)IR GTCATCCCTATTGGCAGGTTAC(SEQ ID NO 2)2F ACAAGTGATTTGGCTGGATTGT(SEQ ID NO 3)2R AGAGAATGTTTTTCATTCTGTCTTCT(SEQ ID NO 4)3F CAGTCTGACTCCCCTCCAGATT(SEQ ID NO 5)3R TGCTGGACTGTCACCGCAT(SEQ ID NO 6)4F TCTCTGCATGTAGGTTTTCTCTG(SEQ ID NO 7)4R AGCAGACTGTAGGCCACCTC(SEQ ID NO 8)3 純化在PCR擴增產(chǎn)物中加入 0. 2ul ExoI, lul SAP,0. 3ul 10 X SAP 反應(yīng)緩沖液禾口 1. 5ul 去離子水。將96孔板放入PCR儀中進行純化,純化程序37°C 30min,96°C 10min,Hold 4°C。4引物延伸反應(yīng)純化后的PCR產(chǎn)物中加入延伸反應(yīng)混合物extension Dilution Buffer3. 76ul, 延伸探針混合液(1010uM/L each) 0. 03ul, 20 X Extension Mix 0. 2ul,DNA 聚合酶 0. 02ul,
6去離子水;3ul。將裝有延伸反應(yīng)混合物的96孔板再次放入PCR儀中進行延伸反應(yīng),反應(yīng)程 序=Hold 96°C 3min ;94°C 20sec,40°C llsec,46 個循環(huán);Hold 4°C。延伸探針混合液包含下列探針I(yè)P ACGCACGTCCACGGTGATTTGAAAAGCTGCGTGATGATGAAATCG(SEQ ID2P GGATGGCGTTCCGTCCTATTAAGATTCATTGTTAATATAAAAGTA(SEQ ID3P CGTGCCGCTCGTGATAGAATCGCATGCGTCGGCGGCTGCCCTCCC(SEQ ID4P AGCGATCTGCGAGACCGTATTTTCTTTTGCTCCTCCAGGCCAAGG(SEQ ID以上延伸探針5’端具有與微陣列芯片地址引物對應(yīng)的地址序列。5延伸反應(yīng)結(jié)束后,加入雜交液可與微陣列芯片進行雜交反應(yīng)。孵育溫度42°C,孵育時間2小時。6激光掃描檢測熒光信號同時檢測上述3個基因?qū)︻A(yù)測、比較個體的白血病易感性具有重要意義。本發(fā)明 將與白血病易感、發(fā)生密切相關(guān)的基因進行組合,通過大量的篩選數(shù)據(jù)表明所述3個基因 MTHFR基因、CYP2E1代謝酶基因、XRCCl及ADPRT修復(fù)酶基因,如四個基因都有位點發(fā)生突 變,則患急性胃癌的概率最高;沒有基因有位點發(fā)生突變患胃癌的概率較小。本發(fā)明采用單核苷酸延伸技術(shù)和微陣列芯片技術(shù)相結(jié)合的方法,針對上述4個位 點,設(shè)計一套多重PCR引物,在一個擴增反應(yīng)中同時擴增攜帶SNP位點的4個基因片段,根 據(jù)SNP位點上游5’端23-2^p的序列設(shè)計寡核苷酸探針,此探針與序列雜交后3’末端位 于snp5’端上游Ibp處。檢測時聚合酶根據(jù)SNP攜帶的堿基在探針末端結(jié)合上一個攜帶熒 光的ddNTP,根據(jù)結(jié)合的ddNTP不同,其所攜帶的熒光顏色也不相同,在探針的5’端根據(jù)與 微陣列芯片結(jié)合位置的不同設(shè)計有不同的20bp的Tag地址序列,與微陣列芯片上對應(yīng)的序 列互補,延伸后的探針與微陣列芯片上對應(yīng)區(qū)域上的序列雜交,不同的探針結(jié)合在芯片的 不同區(qū)域,通過檢測對應(yīng)位置的熒光,達到同時進行多個SNP分型的目的。疾病的發(fā)生是一個十分復(fù)雜的過程,受到多個蛋白和基因的共同影響,其中任何 一個酶的改變都會影響疾病的易感性。傳統(tǒng)的基因檢測疾病的方法受到方法的限制,往往 只能對一到兩個基因的多態(tài)性進行分析,只能覆蓋一部份患病風險人群,對于由于其他基 因上的多態(tài)性造成的疾病患病風險不能及時的預(yù)警,檢測的準確性因此會大幅降低,受檢 者不能全面的了解自身疾病的易感情況。本發(fā)明針對一種疾病不同的患病途徑檢測多個相關(guān)的基因和其多態(tài)性位點,能更 準確更全面的檢測受檢者不同患病途徑的患病風險,能給受檢者提出具有針對性和有效地 健康建議,及時有效的避免其疾病的發(fā)生。由于本發(fā)明使用的檢測方法可以高通量,自動化的檢測SNP,大幅降低了檢測成 本,可以對不同患病途徑的多個基因同時進行檢測,本發(fā)明針對白血病不同的患病途徑的 關(guān)鍵酶基因?qū)ふ姨暨x了 4個多態(tài)性位點,能更準確更全面的檢測受檢者不同患病途徑的患 病風險,能夠給受檢者提出具有針對性的健康建議,及時有效的避免其疾病的發(fā)生。本發(fā) 明通過單核苷酸延伸技術(shù)結(jié)合微陣列芯片技術(shù),利用特異性引物和探針對單核苷酸多態(tài)性 (SNP)的基因分型準確率超過99%,同時檢測上述3個基因?qū)z測、比較個體的胃癌易感性 具有重要意義。綜上所述,本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實施例中,相同領(lǐng)域內(nèi)的有識之士可以在本發(fā)明的技術(shù)指導(dǎo)思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實施例,但這種實施例都包括在本發(fā) 明的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測胃癌易感性的試劑盒,其特征在于,包括=MTHFR基因的rsl801133位 點、CYP2E1 的 rs2031920 位點、XRCCl 基因的 rs25478 位點、ADPRT 基因的 rsl 136410 位點 的特異性引物及對應(yīng)的延伸探針,Taq酶,dNTP混合液,MgCl2溶液,10XPCR反應(yīng)緩沖液, ExoI, SAP, 10XSAPExtension Dilution Buffer, IOXExtension Mix, DNA polymerase, Hybridization Solution, Hybridization Additive,20Xffash Buffer 1, 64X Wash Buffer 2,去離子水,微陣列芯片。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測胃癌易感性的試劑盒,其特征在于所述的特異性 引物對是針對MTHFR基因的rs 1801133位點,CYP2E1的rs2031920位點,XRCCl基因的 rs25478位點,ADPRT基因的rsll36410位點,能特異性擴增出包括上述SNP位點的DNA片 段的引物對。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測胃癌易感性的試劑盒,其特征在于所述的特異性 延伸探針是針對MTHFR基因的rsl801133位點,CYP2E1的rs2031920位點,XRCCl基因的 rs25478位點,ADPRT基因的rsl 136410位點而設(shè)計,能通過單核苷酸延伸和微陣列技術(shù)檢 測出這四個SNPs位點基因型的探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測胃癌易感性的試劑盒,其特征在于所含的特異性 引物對選自具有SEQ ID NO :1,2所示核苷酸序列的引物對、具有SEQ ID N0:3,4所示核苷 酸序列的引物對、具有SEQ ID NO :5,6所示核苷酸序列的引物對以及具有SEQ ID N0:7,8 所示核苷酸序列的引物對。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測胃癌易感性的試劑盒,其特征在于所含的特異性 延伸探針選自具有SEQ ID NO :9、10、11和12所示的延伸探針。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測胃癌易感性的試劑盒,其特征在于試劑盒的組分 和含量包含250ul 10 X PCR反應(yīng)緩沖液,20ul IOmM dNTP混合液,450ul 25mM MgC12溶液, 45ul 5U/ul Taq DNA聚合酶,50ul每條IOuM的8條特異性引物混合液,15ul每條IOuM的 4條特異性延伸探針混合液,90ull0U/ul Exol,450ul lU/ul SAP, 140ul 10XSAP反應(yīng)緩沖1700ulExtension Dilution Buffer,90ul IOXExtension Mix,IOul DNApolymerase, 3500ul Hybridization Solution,200ul HybridizationAdditive,2500ul 20XWash Buffer l,800ul 64 X Wash Buffer 2,去離子水20ml,一個供380人份檢測應(yīng)用的384孔 12重微陣列芯片,試劑盒保存溫度為-20°C。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢測胃癌易感性的試劑盒,它檢測與胃癌關(guān)系密切的四個基因MTHFR基因、CYP2E1代謝酶基因、XRCC1及ADPRT修復(fù)酶基因??赏瑫r檢測SNP位點包括MTHFR基因的rs1801133位點,CYP2E1的rs2031920位點,XRCC1基因的rs25478位點,ADPRT基因的rs1136410位點。利用本試劑盒,通過檢測一組與胃癌易感性相關(guān)的基因及位點,利用特異性引物和探針,通過單核苷酸延伸技術(shù)結(jié)合微陣列芯片技術(shù),可清晰的判斷受檢人群是否攜帶“胃癌易感基因”,將胃癌易感人群從人群中篩選出來,改變不良的生活習慣,達到預(yù)防的目的。
文檔編號C12Q1/68GK102108411SQ20101059941
公開日2011年6月29日 申請日期2010年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月22日
發(fā)明者劉志霈, 劉蓉華, 周毓玲, 李楠, 杜宏偉, 靳霞, 韓俊領(lǐng) 申請人:協(xié)和干細胞基因工程有限公司, 天津濱海協(xié)和基因科技有限公司