專利名稱：氨(氨離子)的測定方法與氨(氨離子)診斷/測定試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學/食品檢驗測定技術領域，更具體地，本發(fā)明涉及氨(氨離子)診斷/測定方法及其試劑盒。
背景技術：
氨測定的方法有微量擴散法、離子交換法、酶法和氨電極法等。目前應用最多的方法是酶法和基于離子選擇電極的血氨測定儀分析法。擴散法是標本堿化后，釋放出NH3,用酸滴定釋放出的氨，或用Nessler反應形成棕黃色碘化雙汞胺進行比色。這些方法需要堿化，內源性的氨形成造成影響，使其準確性和精密度受到影響，目前已很少應用；離子交換法比擴散法更準確，CV為8% 13% ’離子選擇電極法是利用NH3擴散到電極表面，引起電極的pH發(fā)生變化進行測定，該方法的CV為 3. 5% 4. 8%，回收率高。結合具體實際，應以酶法測定為實用。檢索中國專利，僅查出87105593. 7專利申請公開了一種血氨測定速凍杯，卻未發(fā)現(xiàn)比較理想的血氨測定方法。

發(fā)明內容
[要解決的技術問題]本發(fā)明的目的是提供一種氨(氨離子)的測定方法。本發(fā)明的另一個目的是提供一種氨(氨離子)診斷/測定試劑盒。[技術方案]本發(fā)明是通過下述技術方案實現(xiàn)的。本發(fā)明的方法是一種采用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)與酶 (偶)聯(lián)法(Couple Reaction)的聯(lián)用技術，利用測定還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在 340nm波長處的吸光度變化測定氨(氨離子)的方法。本發(fā)明氨(氨離子)測定方法的的技術原理是根據(jù)下述氨激酶、丙酮酸羧化酶、甲酸脫氫酶的系列催化反應完成氨+腺苷三磷酸氨激酶腺苷二磷酸+磷酰胺腺苷二磷酸+磷酸根+草酰乙酸丙酮酸羧化酶腺苷三磷酸+丙酮酸+ 二氧化碳二氧化碳+還原型輔酶甲酸脫氫酶甲酸+輔酶本發(fā)明的方法利用氨激酶(ammonia kinase ；EC 2. 7. 3. 8)酶(偶)聯(lián)丙酮酸羧化 BS (pyruvate carboxylase ；EC 6· 4· 1· 1)、甲酸月兌 M1 (formate dehydrogenase ；EC 1. 2. 1. 2 ；EC 1. 2. 1. 43)酶促反應比色終點法。氨激酶酶解氨反應產生腺苷二磷酸，再通過 (偶)聯(lián)合丙酮酸羧化酶、甲酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰) 氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的程度，這樣可以通過測量340nm處吸光度下降的程度，可以測算氨(氨離子)的濃度大小。本發(fā)明是通過下述技術方案實現(xiàn)的。本發(fā)明涉及一種氨(氨離子)的測定方法。該氨(氨離子)測定方法的步驟如下A、樣品準備A.1標準樣品的制備將一定量的氨鹽溶于水或緩沖液中，再將氨濃度調整到100微摩爾/升，得到的溶液作為標準樣品；A. 2待測樣品的制備待測液體樣品直接測試，無須預處理；將一定量的待測固體樣品像制備標準樣品一樣溶于水或緩沖液中；A. 3空白樣品所述的水或緩沖液作為空白樣品，其氨(氨離子)濃度為0微摩爾/升；B、試劑溶液的制備分別移取或稱取緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氨激酶、丙酮酸羧化酶、甲酸脫氫酶、腺苷三磷酸、草酰乙酸與單價磷酸鹽，然后將它們混合均勻，用水溶解得到所述的試劑溶液，它們的濃度分別是 20-500mmol/L、0. 001_7mol/L、0. 1-0. 35mmol/L, 1000-80000U/L, 1000-80000U/L、1000-80000U/L、l-100mmol/L、l-100mmol/L 與 l-lOOmmol/L ；C、待測樣品與在步驟B)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進行混合，在溫度15-45°C下反應5-60分鐘，在主波長340nm與副波長405nm(如果受儀器限制可以不設副波長)下進行測定，測定其吸光度隨時間的變化；D、在與步驟C)同樣的條件下測定步驟A)標準樣品的吸光度隨時間的變化；E、在與步驟C)同樣的條件下測定在步驟A)空白樣品的吸光度隨時間的變化；F、數(shù)據(jù)處理由步驟C-E)所述測定的主波長340nm的吸光度隨時間的變化，根據(jù)下式計算得到
氨的含量
權利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯(lián)法技術的氨(氨離子)濃度測定方法，其測定的技術原理是根據(jù)下述氨激酶、丙酮酸羧化酶、甲酸脫氫酶的系列催化反應完成氨+腺苷三磷酸氨激酶腺苷二磷酸+磷酰胺腺苷二磷酸+磷酸根+草酰乙酸丙酮酸羧化酶腺苷三磷酸+丙酮酸+ 二氧化碳二氧化碳+還原型輔酶甲酸脫氫酶甲酸+輔酶
2.一種氨(氨離子)的測定方法，其特征在于該方法的步驟如下 2. 1樣品準備2. 1. 1標準樣品的制備將一定量的氨鹽溶于水或緩沖液中，再將其濃度調整到100微摩爾/升； 2. 1.2待測樣品的制備待測液體樣品直接測試，無須預處理；將一定量的待測固體樣品像制備標準樣品一樣溶于水或緩沖液中； 2. 1.3空白樣品所述的水或緩沖液作為空白樣品，其氨(氨離子)濃度為0微摩爾/升； 2. 2試劑溶液的制備分別移取或稱取緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、氨激酶、丙酮酸羧化酶、甲酸脫氫酶、 腺苷三磷酸、草酰乙酸與單價磷酸鹽，然后將它們混合均勻，用水溶解得到所述的試劑溶液，它們的濃度分別是 20-500mmol/L、0. 001_7mol/L、0. 1-0. 35mmol/L、1000-80000U/L、 1000-80000U/L、1000-80000U/L、l-100mmol/L、l-100mmol/L 與 l-lOOmmol/L ；2. 3待測樣品與在步驟2. 2)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進行混合，在溫度15-45°C下反應5-60分鐘，在主波長340nm與副波長405nm(如果受儀器限制，可以不設副波長)下進行測定，測定其吸光度隨時間的變化；2. 4在與步驟2. 3)同樣的條件下測定步驟2. 1. 1)標準樣品的吸光度隨時間的變化； 2. 5在與步驟2. 3)同樣的條件下測定在步驟2. 1. 3)使用的水或緩沖液作為空白溶液的吸光度隨時間的變化；2.6數(shù)據(jù)處理由步驟2. 3-2. 5)所述測定的主波長340nm的吸光度隨時間的變化，根據(jù)下式計算得到氨的含量ΔΑ (樣品)-ΔΑ (空白)氨含量 =-χ標準濃度(μπ οΙ/L)ΔΑ (標準)-ΔΑ(空白)式中ΔΑ(樣品)表示步驟2. 3)得到的待測樣品的吸光度變化； ΔΑ(空白)表示步驟2. 5)得到的空白溶液的吸光度變化； 八八(標準)表示步驟2. 4)標準樣品的吸光度變化。
3.根據(jù)權利要求1、2所述的測定方法，其特征在于使用全自動生化分析儀測定時，待測樣品、所述標準樣品與所述空白樣品由該分析儀在設定條件下自動取樣，然后在下述條件下進行測定測定方法為終點法，溫度37°C，反應時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測氨樣品與試劑的體積比例為1/10-1/500，反應方向為負反應，延遲時間 1/0分鐘，檢測時間4/5分鐘。
4.根據(jù)權利要求1、2或3所述的測定方法，其特征在于，所述的穩(wěn)定劑是一種或多種選自氯化鈉、乙二醇、丙二醇、甘油或雙乙酸鈉、疊氮鈉等防腐劑的穩(wěn)定劑；所述的緩沖液是一種或多種選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、咪唑-鹽酸緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、硼砂-鹽酸緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、二乙醇胺緩沖液或“PBS”緩沖液的緩沖液；所述的還原型輔酶是一種或多種選自NADPH、NADH或thio_NADH的還原型輔酶。
5.根據(jù)權利要求1、2或3所述的測定方法，其特征在于 5. 1所述的試劑溶液配制成如下單劑試劑它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷三磷酸、草酰乙酸與單價磷酸鹽、氨激酶、丙酮酸羧化酶與甲酸脫氫酶組成的；5. 2所述的試劑溶液配制成如下雙劑試劑試劑1，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷三磷酸、草酰乙酸與單價磷酸鹽組成的；試劑2，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、氨激酶、丙酮酸羧化酶與甲酸脫氫酶組成的； 其中還原型輔酶、氨激酶、丙酮酸羧化酶、甲酸脫氫酶、腺苷三磷酸、草酰乙酸與單價磷酸鹽在試劑1或試劑2中的位置是不限定的；5.3所述的試劑配制成如下三劑試劑試劑1，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、還原型輔酶、腺苷三磷酸、草酰乙酸與單價磷酸鹽組成的；試劑2，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑、丙酮酸羧化酶與甲酸脫氫酶組成的； 試劑3，它是由所述的緩沖液、穩(wěn)定劑與氨激酶組成的；其中還原型輔酶、氨激酶、丙酮酸羧化酶、甲酸脫氫酶、腺苷三磷酸、草酰乙酸與單價磷酸鹽在試劑1、試劑2或試劑3中的位置是不限定的。
6.一種氨(氨離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于6. 1它由下述粉狀試劑組成，在使用時用水將它們溶解得到具有下述濃度范圍的可直接使用的液體試劑緩沖液20-500mmol/L穩(wěn)定劑0.001-7mol/L還原型輔酶0. 1-0. 35mmol/L氨激酶1000-80000U/L丙酮酸羧化酶1000-80000U/L甲酸脫氫酶1000-80000U/L腺苷三磷酸I-IOOmmo 1/L草酰乙酸l-100mmol/L單價磷酸鹽I-IOOmmo 1/L ；6. 2根據(jù)權利要求6. 1所述的氨(氨離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于它有 組成如下的試劑1 緩沖液20-500mmol/L穩(wěn)定劑0.001-7mol/L還原型輔酶0. 1-0. 35mmol/L腺苷三磷酸l-100mmol/L草酰乙酸l-100mmol/L單價磷酸鹽I-IOOmmo 1/L ； 組成如下的試劑2 緩沖液20-500mmol/L穩(wěn)定劑0.001-7mol/L氨激酶1000-80000U/L丙酮酸羧化酶1000-80000U/L甲酸脫氫酶1000-80000U/L ；[6. 3根據(jù)權利要求6. 1所述的氨(氨離子)診斷/測定試劑盒，其特征在于它有 組成如下的試劑1 緩沖液20-500mmol/L穩(wěn)定劑0.001-7mol/L還原型輔酶0. 1-0. 35mmol/L腺苷三磷酸I-IOOmmol/L草酰乙酸l-100mmol/L單價磷酸鹽I-IOOmmo 1/L ； 組成如下的試劑2 緩沖液20-500mmol/L穩(wěn)定劑0.001-7mol/L丙酮酸羧化酶1000-80000U/L甲酸脫氫酶1000-80000U/L ； 組成如下的試劑3 緩沖液20-500mmol/L穩(wěn)定劑0.001-7mol/L氨激酶1000-80000U/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用酶比色法及酶聯(lián)法技術的氨(氨離子)含量的測定方法、試劑的組成及成分，其測定的技術原理是依據(jù)氨激酶、丙酮酸羧化酶、甲酸脫氫酶的系列催化反應完成，本發(fā)明還涉及一種氨(氨離子)診斷/測定試劑盒。本發(fā)明的測定方法靈敏度高、誤差小，因此本發(fā)明的測定方法與試劑盒可以廣泛地應用于臨床醫(yī)學/食品檢驗。
文檔編號C12Q1/32GK102565360SQ20101058420
公開日2012年7月11日 申請日期2010年12月13日 優(yōu)先權日2010年12月13日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司