專利名稱：可降解棉籽殼的復(fù)合酶及其以果膠誘導(dǎo)的制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)中復(fù)合酶的發(fā)酵制備及其應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種可降解 棉籽殼的復(fù)合酶及其以果膠誘導(dǎo)的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
棉籽殼的化學(xué)成分、顏色和形態(tài)不同于棉纖維與織物，影響染色的均勻度以及織 物的手感和外觀，在進(jìn)行織物的染色和整理前必須去除。但是棉籽殼的結(jié)構(gòu)致密、成分復(fù) 雜，是棉織物精練工藝中最難去除的非纖維素雜質(zhì)。與棉纖維中其它雜質(zhì)相比，它的降解通 常需要更為劇烈的處理條件和更長的時間，因此如何去除棉織物表面的棉籽殼一直是染整 工作中的難題。當(dāng)前為了應(yīng)對我國傳統(tǒng)工業(yè)轉(zhuǎn)型和節(jié)能減排的低碳經(jīng)濟(jì)要求，紡織工業(yè)正在發(fā)展 棉織物生物酶精練的新型前處理工藝。棉籽殼的去除是實現(xiàn)棉織物酶精練工藝大規(guī)模工業(yè) 化的關(guān)鍵。棉纖維共生物和棉籽殼的化學(xué)成分復(fù)雜，而酶具有高度底物催化專一性，不同種 類的酶只能降解不同的雜質(zhì)組分。應(yīng)用酶對棉織物進(jìn)行精練，單一酶制劑難以完成棉籽殼 的降解，難以達(dá)到理想的去除率和精練效果，因此需要篩選找到最適于降解某一組分的酶， 再將這些酶進(jìn)行復(fù)配，同時確保在同一條件下復(fù)合酶體系中不同的酶能發(fā)揮各自的功效， 才能利用多種酶制劑的協(xié)同復(fù)合作用促進(jìn)棉籽殼的降解和去除。研究表明纖維素酶和木聚 糖酶對棉織物中的棉籽殼有一定的降解作用。通過研究可知棉籽殼由外表皮層、外色素層、 無色層、柵欄層和內(nèi)色素層組成；外表皮層均勻地分布著角質(zhì)(類脂物)，此外纖維素、半纖 維素、木質(zhì)素(芳環(huán)類、多酚類)和果膠也是外表皮層的主要成分；柵欄層主要以果膠、半纖 維素和木質(zhì)素為主；內(nèi)色素層和外色素層在結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分上相同，主要以帶有酚羥基類 化合物的木質(zhì)素為主。化學(xué)組分上主要包含纖維素(約37%)、果膠和木聚糖等半纖維素 (約25% )、木質(zhì)素(約29% )，此外還含有灰分(約3% )、少量蛋白質(zhì)以及脂類等化學(xué)物 質(zhì)。在棉籽殼的三大化學(xué)組分中，木聚糖等半纖維素通常與木質(zhì)素之間存在化學(xué)鍵，構(gòu)成了 木質(zhì)素——碳水化合物復(fù)合體(LCC)，木聚糖酶可以去除棉籽殼中的木聚糖，從而破壞LCC 結(jié)構(gòu)，有助于溶出木質(zhì)素，而少量的纖維素酶也有助于降解棉籽殼中的纖維素，最終起到軟 化棉籽殼，利于在水洗中去除棉籽殼。目前的關(guān)鍵問題是，雖然許多學(xué)者和機(jī)構(gòu)采用了將單一純酶復(fù)配以提高棉籽殼的 降解，譬如將纖維素酶和木聚糖酶復(fù)配，或?qū)⒛揪厶敲概c果膠酶復(fù)配，但是仍舊但不到理想 的棉籽殼去除和精練效果。這是因為棉籽殼是一種含有包括纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、果 膠、角質(zhì)、蛋白質(zhì)以及灰分等復(fù)雜成分的復(fù)合物，酶的高度底物催化專一特性使得不同種類 的酶只能降解各自不同的雜質(zhì)組分。即使采用了酶的復(fù)配技術(shù)，由于不同生物來源的酶的 特性不同，催化條件差異很大，再加上各種酶的配比很難掌握，因此達(dá)不到最佳協(xié)同處理效 果。不同酶的活力及使用效果與使用條件有相當(dāng)大的關(guān)系。不同酶的最適反應(yīng)PH值和溫 度以及穩(wěn)定PH值和溫度等都各有不同，在同一條件下，發(fā)揮復(fù)合酶中各種酶的活力，確保 在同一條件下復(fù)合酶體系中不同的酶能發(fā)揮各自的功效，是該工藝的一個技術(shù)難點。
自然界中某些微生物自身就能獨立完成包括棉籽殼在內(nèi)的復(fù)雜木質(zhì)纖維素類物 質(zhì)的降解，因此篩選找到最適于降解棉籽殼的微生物，并通過發(fā)酵調(diào)控獲得最佳的復(fù)合酶 系以用于棉籽殼的降解是一條很好的途徑。該技術(shù)能確保在同一催化反應(yīng)條件下復(fù)合酶體 系中不同的酶能充分和穩(wěn)定地發(fā)揮各自的功效，利用各酶的協(xié)同復(fù)合作用來高效催化水解 棉籽殼。里氏木霉能同時合成多種降解木質(zhì)纖維素酶類，因此本發(fā)明提出誘導(dǎo)該菌發(fā)酵產(chǎn) 酶并對該酶系中各種酶活進(jìn)行調(diào)控以利于棉籽殼的降解。采用高效生物催化劑群為主體的酶處理工藝替代傳統(tǒng)的化學(xué)處理工藝，可以顯 著降低水耗、能耗，廢水量顯著減少并且容易處理；節(jié)省染料并獲得更穩(wěn)定的染色效果；織 物的柔軟度更好、強(qiáng)度更高；操作更加安全和簡便；由于用量少，在使用成本上也具有競爭 力，因而成為紡織工業(yè)清潔生產(chǎn)技術(shù)的未來發(fā)展方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種可降解棉籽殼的復(fù)合酶及其以果膠誘導(dǎo) 的制備方法和應(yīng)用，本方法制得的復(fù)合酶具有較高的酶活、更適合棉籽殼降解的復(fù)合酶體 系，而且安全環(huán)保，操作簡單，可控性強(qiáng)，相比常規(guī)的堿處理反應(yīng)條件溫和，對環(huán)境友好，具 有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明的一種可降解棉籽殼的復(fù)合酶，其組分主要包括纖維素酶、木聚糖酶、果 膠酶，以及少部分脂肪酶、蛋白酶等；所述的復(fù)合酶由以下方法制得，包括將里氏木霉種子接種到種子培養(yǎng)基于25 30°C，120 250r/min條件下培養(yǎng) 24 48小時，以4 10%接種量轉(zhuǎn)接至含1 5%果膠的發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)酶，培養(yǎng)過程中通 過添加相對發(fā)酵培養(yǎng)基1 2%的果膠進(jìn)一步誘導(dǎo)產(chǎn)酶，在25 30°C，120 250r/min條 件下培養(yǎng)4 8天，過濾，離心得粗酶液；其中，種子培養(yǎng)基包含葡萄糖，0. 1 蛋白胨，0.05%檸檬酸，0.015% Tween 80,2% Vogel' s medium N 的 Vogel 培養(yǎng)基，pH5. 0 ；或者是包含 1 %葡萄糖，0. 1
蛋白胨，終濃度為0.05Μ的檸檬酸緩沖液，0.015% Tween 80，0. 14% (NH4)2S04,0. 2% KH2PO4,0. 03 % 尿素，0. 04 % CaCl2 · 2Η20，0· 03 % MgSO4 · 7Η20，0· 0005 % FeSO4 · 7Η20, 0. 00016% MnSO4 · H20,0. 00014% ZnSO4 · 7Η20，0· 00037% CoCl2 · 6Η20 的 Mandels 培養(yǎng)基， ρΗ4· 8-5. 0 ；發(fā)酵培養(yǎng)基包含0. 1 葡萄糖，0. 1 蛋白胨，0.05%檸檬酸，0.015% Tween 80,2% Vogel' s medium N，添加 1 5%果膠，pH5. 0 ；或者是含 0. 1 葡萄糖， 0. 1 蛋白胨，終濃度為0.05M的檸檬酸緩沖液，0.015% Tween 80,0. 14% (NH4)2SO4, 0. 2% KH2PO4,0. 03%尿素，0. 04% CaCl2 · 2Η20，0· 03% MgSO4 · 7Η20，0· 0005% FeSO4 · 7Η20, 0. 00016% MnSO4 · H20,0. 00014% ZnSO4 · 7Η20，0· 00037% CoCl2 · 6Η20 的 Mandels 培養(yǎng)基， 添加1 5%果膠，ρΗ4· 8-5. 0。本發(fā)明的一種以果膠誘導(dǎo)制備可降解棉籽殼復(fù)合酶的方法，包括里氏木霉降解棉籽殼酶系的發(fā)酵制備將里氏木霉種子接種到種子培養(yǎng)基于25 30°C，120 250r/min條件下培養(yǎng) 24 48小時，以4 10%接種量轉(zhuǎn)接至含1 5%果膠的發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)酶，培養(yǎng)過程中通 過添加相對發(fā)酵培養(yǎng)基1 2%的果膠進(jìn)一步誘導(dǎo)產(chǎn)酶，在25 30°C，120 250r/min條
5件下培養(yǎng)4 8天，過濾，離心得粗酶液；其中，種子培養(yǎng)基包含葡萄糖，0. 1 蛋白胨，0.05%檸檬酸，0.015% Tween 80,2% Vogel' s medium N 的 Vogel 培養(yǎng)基，pH5. 0 ；或者是包含 1 %葡萄糖，0. 1
蛋白胨，終濃度為0.05Μ的檸檬酸緩沖液，0.015% Tween 80，0. 14% (NH4)2S04,0. 2% KH2PO4,0. 03 % 尿素，0. 04 % CaCl2 · 2Η20，0· 03 % MgSO4 · 7Η20，0· 0005 % FeSO4 · 7Η20, 0. 00016% MnSO4 · H20,0. 00014% ZnSO4 · 7Η20，0· 00037% CoCl2 · 6Η20 的 Mandels 培養(yǎng)基， ρΗ4· 8-5. 0 ；發(fā)酵培養(yǎng)基包含0. 1 葡萄糖，0. 1 蛋白胨，0.05%檸檬酸，0.015% Tween 80,2% Vogel' s medium N，添加 1 5%果膠，pH5. 0 ；或者是含 0. 1 葡萄糖， 0. 1 蛋白胨，終濃度為0. 05M的檸檬酸緩沖液，0. 015% Tween 80,0. 14% (NH4)2SO4, 0. 2% KH2PO4,0. 03%尿素，0. 04% CaCl2 · 2Η20，0· 03% MgSO4 · 7Η20，0· 0005% FeSO4 · 7Η20, 0. 00016% MnSO4 · H20,0. 00014% ZnSO4 · 7Η20，0· 00037% CoCl2 · 6Η20 的 Mandels 培養(yǎng)基， 添加1 5%果膠，ρΗ4· 8-5. 0。發(fā)酵培養(yǎng)基中以優(yōu)選0. 葡萄糖加上1 5%果膠是最佳的速效碳與誘導(dǎo)物的 產(chǎn)酶碳源配比。所述的果膠是購自北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司。所述的在發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)酶過程中，采用的是間歇分批式、連續(xù)培養(yǎng)式或分批補(bǔ)料 式的培養(yǎng)方法。測定纖維素酶、木聚糖酶和果膠酶活力①纖維素酶活力測定(a)粗酶液中還原糖的測定0. 2mL粗酶液+0. SmL蒸餾水+3mL 3，5_ 二硝基水楊 酸(DNS)，沸水浴5min，冷卻后加蒸餾水至25mL，550nm處測得OD1 ；(b)粗酶液與羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)反應(yīng)后總還原糖的測定0. 2mL粗酶液 +0. 8mL 1 % CMC-Na溶液(用50mM，pH4. 8的醋酸緩沖液配制)，50°C水浴IOmin后加入 3mLDNS,沸水浴5min ；冷卻后加蒸餾水至25mL，550nm處測得OD2 ；(c) AOD = OD2-OD1,1個酶活力單位(IU)定義為每分鐘水解羧甲基纖維素鈉產(chǎn)生 1 μ mol還原糖(以葡萄糖計)的酶量，
權(quán)利要求
一種可降解棉籽殼的復(fù)合酶，其組分主要包括纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶、脂肪酶以及蛋白酶；所述的復(fù)合酶由以下方法制得，包括將里氏木霉種子接種到種子培養(yǎng)基于25～30℃，120～250r/min條件下培養(yǎng)24～48小時，以4～10％接種量轉(zhuǎn)接至含1～5％果膠的發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)酶，培養(yǎng)過程中通過添加相對發(fā)酵培養(yǎng)基1～2％的果膠進(jìn)一步誘導(dǎo)產(chǎn)酶，在25～30℃，120～250r/min條件下培養(yǎng)4～8天，過濾，離心得粗酶液；其中，種子培養(yǎng)基包含1％葡萄糖，0.1～1％蛋白胨，0.05％檸檬酸，0.015％Tween 80，2％ Vogel’s medium N的Vogel培養(yǎng)基，pH5.0；或者是包含1％葡萄糖，0.1～1％蛋白胨，終濃度為0.05M的檸檬酸緩沖液，0.015％Tween 80，0.14％(NH4)2SO4，0.2％KH2PO4，0.03％尿素，0.04％CaCl2·2H2O，0.03％MgSO4·7H2O，0.0005％FeSO4·7H2O，0.00016％MnSO4·H2O，0.00014％ZnSO4·7H2O，0.00037％CoCl2·6H2O的Mandels培養(yǎng)基，pH4.8 5.0；發(fā)酵培養(yǎng)基包含0.1～1％葡萄糖，0.1～1％蛋白胨，0.05％檸檬酸，0.015％Tween 80，2％Vogel’s medium N，添加1～5％果膠，pH5.0；或者是含0.1～1％葡萄糖，0.1～1％蛋白胨，終濃度為0.05M的檸檬酸緩沖液，0.015％Tween 80，0.14％(NH4)2SO4，0.2％KH2PO4，0.03％尿素，0.04％CaCl2·2H2O，0.03％MgSO4·7H2O，0.0005％FeSO4·7H2O，0.00016％MnSO4·H2O，0.00014％ZnSO4·7H2O，0.00037％CoCl2·6H2O的Mandels培養(yǎng)基，添加1～5％果膠，pH4.8 5.0。
2.如權(quán)利要求1所述的一種可降解棉籽殼的復(fù)合酶的制備方法，包括里氏木霉降解棉籽殼酶系的發(fā)酵制備將里氏木霉種子接種到種子培養(yǎng)基于25 30°C，120 250r/min條件下培養(yǎng)24 48 小時，以4 10%接種量轉(zhuǎn)接至含1 5%果膠的發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)酶，培養(yǎng)過程中通過添加相 對發(fā)酵培養(yǎng)基1 2%的果膠進(jìn)一步誘導(dǎo)產(chǎn)酶，在25 30°C，120 250r/min條件下培養(yǎng) 4 8天，過濾，離心得粗酶液；其中，種子培養(yǎng)基包含葡萄糖，0. 1 蛋白胨，0. 05%檸檬酸，0.015% Tween 80,2% Vogel' s medium N的Vogel培養(yǎng)基，pH5. 0 ；或者是包含1 %葡萄糖，0. 1 1 %蛋 白胨，終濃度為 0. 05M 的檸檬酸緩沖液，0. 015% Tween 80,0. 14% (NH4)2SO4jO. 2% KH2PO4, 0. 03 % 尿素，0. 04 % CaCl2 · 2Η20，0· 03 % MgSO4 · 7Η20，0· 0005 % FeSO4 · 7Η20，0· 00016 % MnSO4 · H20,0. 00014% ZnSO4 · 7Η20，0· 00037% CoCl2 · 6Η20 的 Mandels 培養(yǎng)基，ρΗ4· 8-5. 0 ；發(fā)酵培養(yǎng)基包含0. 1 葡萄糖，0. 1 蛋白胨，0. 05%檸檬酸，0.015% Tween 80,2% Vogel' s medium N，添加1 5%果膠，pH5. 0 ；或者是含0. 1 葡萄糖，0. 1 蛋白胨，終濃度為0.05Μ的檸檬酸緩沖液，0.015% Tween 80，0. 14% (NH4)2S04,0. 2% KH2PO4,0. 03 % 尿素，0. 04 % CaCl2 · 2Η20，0· 03 % MgSO4 · 7Η20，0· 0005 % FeSO4 · 7Η20, 0. 00016% MnSO4 · H20,0. 00014% ZnSO4 · 7Η20，0· 00037% CoCl2 · 6Η20 的 Mandels 培養(yǎng)基， 添加1 5%果膠，ρΗ4· 8-5. 0。
3.如權(quán)利要求2所述的一種可降解棉籽殼的復(fù)合酶的制備方法，其特征在于所述的 在發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)酶過程中，采用的是間歇分批式、連續(xù)培養(yǎng)式或分批補(bǔ)料式的培養(yǎng)方法。
4.如權(quán)利要求2所述的一種可降解棉籽殼的復(fù)合酶的制備方法，其特征在于所述的 發(fā)酵培養(yǎng)基包含0. 葡萄糖，0. 1 蛋白胨，0.05%檸檬酸，0.015% Tween 80,2%Vogel'smedium N，添加1 5%果膠，pH5. O ；或者是含0. 葡萄糖，0. 1 蛋白胨，終 濃度為 0.05M 的檸檬酸緩沖液，0.015% Tween 80,0. 14% (NH4)2SO4jO. 2% KH2PO4,0. 03%^ 素，0. 04% CaCl2 · 2Η20，0· 03% MgSO4 · 7Η20，0· 0005% FeSO4 · 7Η20，0· 00016% MnSO4 · H2O, 0. 00014 % ZnSO4 · 7Η20，0. 00037 % CoCl2 · 6Η20 的 Mandels 培養(yǎng)基，添加 1 5 % 果膠， ρΗ4· 8-5. O0
5.如權(quán)利要求1所述的復(fù)合酶在水解棉籽殼中的應(yīng)用，包括，用發(fā)酵獲得的粗酶液水解棉籽殼在IOmL粗酶液原液或者經(jīng)1 8倍稀釋的酶液中，加入Ig棉籽殼，在ρΗ3. 0-5.0、 40-60°C、100-200rpm條件下水浴振蕩反應(yīng)10h。
6.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合酶在水解棉籽殼中的應(yīng)用，其特征在于所述的棉籽殼為 40目篩截留下的，目數(shù)小于40目。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種可降解棉籽殼的復(fù)合酶及其以果膠誘導(dǎo)的制備方法和應(yīng)用，該復(fù)合酶組分包括纖維素酶、木聚糖酶和果膠酶活力；其制備方法，包括將里氏木霉種子接種到種子培養(yǎng)基于25～30℃，120～250r/min條件下培養(yǎng)24～48小時，以4～10％接種量轉(zhuǎn)接至含1～5％果膠的發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)酶，培養(yǎng)過程中可以通過添加果膠進(jìn)一步誘導(dǎo)產(chǎn)酶，在25～30℃，120～250r/min條件下培養(yǎng)4～8天，過濾，離心得粗酶。本發(fā)明制得的復(fù)合酶具有較高的酶活、更適合棉籽殼降解的復(fù)合酶體系，而且安全環(huán)保，操作簡單，可控性強(qiáng)，相比常規(guī)的堿處理反應(yīng)條件溫和，對環(huán)境友好，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N9/50GK101979525SQ20101052473
公開日2011年2月23日 申請日期2010年10月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月29日
發(fā)明者唐綠蓉, 曹張軍, 楊光, 洪楓 申請人:東華大學(xué)