專利名稱：一種鑒別鵝抗逆性的Hsp70基因分子標記及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種鑒別鵝抗逆性的Hsp70基因分子標記及 其應用。
背景技術(shù)：
分子標記輔助選擇育種，是基因工程在現(xiàn)代家禽育種中的一項重要應用，通過分 子標記的方法進行現(xiàn)場育種，不僅能縮短育種時限，大大減少育種的人力物力消耗，另外分 子標記的多樣性更使得輔助分子標記在現(xiàn)場育種中的應用潛力大大提高?，F(xiàn)代家禽養(yǎng)殖業(yè) 的集約化發(fā)展使得家禽面對越來越多的外界應激，而鵝作外水禽，由于養(yǎng)殖密度的提高，養(yǎng) 殖水域的有限，更易受到應激。因此，通過育種的途徑改善個體本身的抗逆性是家禽遺傳育 種重要的研究方向之一，而分子標記輔助選擇育種是達到這一目的的重要手段。而評價機 體抗逆性的指標也多種多樣，皮質(zhì)酮作為一種血液生理指標可以作為一個準確的評價家禽 應激狀況的生理指標，應激會引起皮質(zhì)酮的大量分泌。血漿皮質(zhì)酮水平降低時，代謝速度減 慢，產(chǎn)熱減少；而當血漿皮質(zhì)酮水平升高時，代謝強度加強，產(chǎn)熱增多。淋巴細胞是重要的 免疫細胞，包括τ細胞和B細胞，分別直接參與細胞免疫和體液免疫應答，在機體免疫系統(tǒng) 中起著重要的作用，其數(shù)量的多少與免疫性能息息相關(guān)。當機體受到外界刺激時(如病原體 入侵，熱應激等)，淋巴細胞和單核細胞在血液中的含量會下降，異嗜性粒細胞增加，因此異 嗜性粒細胞(H)與淋巴細胞(L)的比值升高。因此H、L和H/L值不僅是獸醫(yī)臨床上常用的 檢測方法，也是家禽抗病育種上的一個重要的免疫性狀，H/L值的變化與家禽的應激程度密 切相關(guān)，可以作為檢測家禽應激程度的一項準確指標。由甲狀腺分泌的三碘甲狀腺原氨酸 (T3)與應激有重要關(guān)系，T3水平下降時，代謝速度減慢，產(chǎn)熱減少，反之亦然，是敏感的熱 應激指標。熱應激蛋白是重要的保持細胞內(nèi)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的胞內(nèi)蛋白，作為分子伴侶在細胞生 長、發(fā)育、分化、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成、折疊、運輸、分解、細胞骨架功能和膜功能等多方面 發(fā)揮著重要的作用。其中研究得比較成熟的熱應激蛋白70 (HSP70)在抗逆性方面起著重 要作用，已報道的文章一般認為Hsp70基因是影響畜禽抗逆性的重要功能基因之一。目前針對鵝抗逆性的分子標記研究比較少，本發(fā)明在鵝Hsp70的編碼區(qū)找到的耐 熱性分子標記為首次報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種可以鑒定鵝抗逆性的 Hsp70分子標記。本發(fā)明另一目的在于提供上述鑒定鵝抗逆性的Hsp70分子標記的應用。本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)
一種鵝Hsp70基因分子標記，所述分子標記為T+1122C，位于熱應激蛋白Hsp70的編碼區(qū)。
本發(fā)明鵝Hsp70基因分子標記可用于鑒別鵝抗逆性。一種利用分子標記對鵝抗逆性進行選擇的方法，其特征在于該方法包括鵝基因組 DNA的抽提、特定區(qū)域的PCR擴增和擴增產(chǎn)物的酶切分型。鵝血基因組DNA的抽提包括以下具體步驟
(1)30ul 抗凝血+470ul 1XSET+12. 5ul 20% SDS+5ul 蛋白酶 K 混勻，55°C水浴過夜 消化(注要按順序加)；
(2)力口Tris飽和酚500ul，搖勻，離心；
(3)取上清于干凈1.5ml離心管，加入500ul Tris飽和酚，搖勻，離心；
(4)取上清于干凈1.5ml離心管，加入500ul氯仿一異戊醇(23 :1)，搖勻，離心；
(5)取上清于干凈1.5ml離心管，加入無水乙醇(-20°C) lOOOul，搖勻，于-20放置 20 30min ；
(6)棄上清，加入IOOOul75%乙醇，搖勻，離心；
(7)棄上清，烘干，加適量TE，55°C水浴過夜。特定區(qū)域的PCR擴增包括以下具體步驟
(1)PCR反應體系的配制Mix占反應體系50%、上游引物和下游引物各10 20pmol、 Taq酶占反應體系0. 75%、基因組DNA 0. 1 lug，加滅菌雙蒸水至反應總體積；
(2)PCR 反應程序94°C 3 5min，(94°C 30s，57 66°C 30s, 72°C 30s) 30 35 個 循環(huán)，72°C后延伸5 lOmin，16°C保存。PCR產(chǎn)物用1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。擴增產(chǎn)物的酶切分型包括以下具體步驟
酶切反應體系為PCR產(chǎn)物8 10 yL，內(nèi)切酶3 5 U，10 X buffer緩沖液為內(nèi)切 酶體積2倍，37°C水浴過夜。用2. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，根據(jù)電泳條帶判定個 體的基因型，其中TT基因型為一條402bp的條帶、CC基因型為兩條分別為286bp和116bp 的條帶、TC基因型為三條分別為402bp、286bp和116bp的條帶。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明所采用的方法具有條件簡單，價格低，可信度高等優(yōu)點。因此，本發(fā)明在現(xiàn)場育 種中用于選擇熱適應性較好的種雞具有重要作用。


圖1為位點T+1122C的酶切電泳圖，其中，M為DL2000 Marker,自上而下分別為 2000、1000、750、500、250 和 IOObp0
具體實施例方式以下結(jié)合實施例來進一步解釋本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。
實施例分別在環(huán)境溫度為20°C和35°C時翅下靜脈采集200個烏鬃鵝血液分裝成三管 非抗凝血1 2mL，血清用于測定T3和皮質(zhì)酮；抗凝血1 2mL，用于測定H/L ；抗凝血 l_2ml，用于基因組DNA的抽提。其中非抗凝血直接離心吸取血清，利用酶聯(lián)免疫吸附法測
4定T3和皮質(zhì)酮；抗凝血用于測定H/L，用瑞氏和吉姆薩染復合染色法對血涂片染色，鏡檢， 按Alfred的白細胞分類方法進行細胞分類，并按Campo的方法進行計數(shù)和計算；CD3+、CD4+ 利用流式細胞儀檢測。 抽提400個血液樣本的基因組DNA，每個樣本取10ul，分別制成各樣本DNA稀釋 液，以DNA稀釋液為模板，按照申請專利說明的PCR反應體系配制反應體系，并按相應反應 程序進行PCR擴增。經(jīng)凝膠電泳檢測擴增結(jié)果良好的產(chǎn)物進行酶切分型，酶切效果圖如圖 1，酶切產(chǎn)物檢測到的3種基因型分別是TT (402bp )、CC (286bp和116bp )、TC (402bp、286bp 和116bp)；分型結(jié)果與測定的耐熱性狀進行相關(guān)分析，分析結(jié)果如下表1 表1位點T+1122C與耐熱性狀關(guān)聯(lián)分析結(jié)果
注表中同一位點中同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0. 05) 常溫狀態(tài)下T+1122C位點與非應激狀態(tài)下的H/L值顯著相關(guān)(P< 0.05)。TC基因型個 體的H/L值最低，TT基因型最高，CC基因型居中。TC基因型個體H/L值與CC基因型和TT 基因型相比，差異都達到顯著水平，而CC基因型和TT基因型之間差異不顯著。因為H/L值 已經(jīng)作為一個成熟的耐應激指標應用到家禽的育種上，大量研究認為H/L值低的品系相對 于高的品系更加耐應激。因此TC基因型為有利的抗逆性基因型。
權(quán)利要求
一種鵝Hsp70基因分子標記，其特征在于所述分子標記為T+1122C，位于熱應激蛋白Hsp70的編碼區(qū)。
2.權(quán)利要求1所述鵝Hsp70基因分子標記在鑒別鵝抗逆性中的應用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述鵝Hsp70基因分子標記的應用，其特征在于所述應用包括如下 步驟(1)鵝基因組DNA的提取；(2)設(shè)計1對特異性引物，其核苷酸序列如SEQID NO:廣2所示，進行PCR擴增；(3)擴增產(chǎn)物酶切分型。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述鵝Hsp70基因分子標記的應用，其特征在于步驟(1)中所述鵝 基因組DNA的提取為從鵝血中提取，抗凝劑為EDTA或肝素鈉。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述鵝Hsp70基因分子標記的應用，其特征在于步驟(1)中所述基 因組DNA的提取方法為苯酚_氯仿抽提或試劑盒抽提。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述鵝Hsp70基因分子標記的應用，其特征在于步驟(2)中所述PCR 擴增的反應體系為Mix占反應體系的50體積％，上游引物和下游引物各l(T20pmOl，Taq酶 占反應體系的0. 75體積％，基因組DNA0.廣lug，加滅菌雙蒸水至反應總體積。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述鵝Hsp70基因分子標記的應用，其特征在于步驟(2)中所述PCR 擴增的反應程序為
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述鵝Hsp70基因分子標記的應用，其特征在于步驟(3)中所述酶 切分型的酶切反應體系為PCR產(chǎn)物8 10 μ L，內(nèi)切酶3飛U，IOX緩沖液為內(nèi)切酶體積的2 倍，37°C水浴過夜，用2. 5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，根據(jù)電泳條帶判斷個體的基 因型，其中TT基因型為一條402bp的條帶、CC基因型為兩條分別為286bp和116bp的條帶、 TC基因型為三條分別為402bp、286bp和116bp的條帶。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述鵝Hsp70基因分子標記的應用，其特征在于所述內(nèi)切酶為 HPYCH41U 或 Taal。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒別鵝抗逆性的Hsp70基因分子標記及其應用。本發(fā)明別鵝抗逆性的Hsp70基因分子標記為T+1122C，位于熱應激蛋白Hsp70的編碼區(qū)。本發(fā)明以構(gòu)建好的DNA為模板，通過對Hsp70的編碼區(qū)進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物采用直接測序的方法篩查單核苷酸多態(tài)位點SNPs，對篩查到的SNPs在實驗鵝群體里運用PCR-RFLP方法進行基因分型，所得分型結(jié)果與該群體的性狀指標進行關(guān)聯(lián)分析，顯著相關(guān)的SNP位點為分子標記，結(jié)果顯示，TC基因型個體的抗逆性強。
文檔編號C12Q1/68GK101942439SQ20101029550
公開日2011年1月12日 申請日期2010年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月29日
發(fā)明者張細權(quán), 林果, 甘建伉, 羅慶斌, 聶慶華, 肖雄 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學